JPH02296149A - ヒトヘモグロビンの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的なヒ
トヘモグロビン検出方法に関し、特に低濃度にて存在す
るヒトヘモグロビンを高感度にて検出することができる
方法に関する。

〈従来の技術〉 近年、大腸癌などの下部消化器の疾患を検査する方法と
して、消化器管からの出血に起因する糞便中の潜血成分
、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行なわれでいる。

ヒトヘモグロビンの検出方法は、従来からヘモグロビン
のペルオキシダーゼ活性を利用する方法や、グアヤツク
法、オルトトリジン法などが採用されている。

しかし、これらの、方法ではペルオキシダーゼ活性を有
する野菜や動物ヘモグロビンを含む食品の摂取を制限し
たり、一部の薬剤の投与（併用）を制限する必要がある
。

そこで、食品摂取や薬剤投与の制限を必要としない、抗
ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な検出方法が提
案されている。

このような検出方法には例えば、寒天板肉での抗ヒトヘ
モグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグロビンとの沈
降線を利用してヘモグロビンを検出する一次元免疫拡散
法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したも
のと、被検液とを混合して生じる沈降現象像を利用して
検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテックス粒子に抗
ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、被検液を混合
して生じる凝集像を利用して検出するラテックス凝集法
、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒトヘモグロビン
抗体を利用するエンザイムイムノアッセイ法やラジオア
ッセイ法などがある。

上記検出方法においては被検物質であるヒトヘモグロビ
ンは通常、溶解液状で検査に供され、例えば便潜血検査
では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解することにより
、糞便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にして被検液
として用いられている。

ヒトヘモグロビンの構造は、例えばヘモグロビンＡでは
アミノ酸１４１個からなるα鎖とアミノ酸１４６個から
なるβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞれ２個から
形成してなる四量体であり、これらが立体構造で配置さ
れている。このような構造のヒトヘモグロビンは、通常
の緩衝液中では徐々に変性し、ヒトヘモグロビン表面の
抗原決定基がくずれる（失活する）ため、その結果、従
来からの免疫学的方法では検出感度が著しく低下するも
のである。特に、被検液中のヒトヘモグロビンが低濃度
である場合は、上記失活が顕著であり診断上、意義のあ
る低濃度域での検出が困難となる。

一方、便潜血検査では検査員の手間や不快感を少なくす
るために、被験者自身が自宅などで糞便中に含まれるヒ
トヘモグロビンを溶解液状態にする場合があり、このよ
うな場合は溶解液状態で数日間放置されることが多い、
また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液状態にした場
合でも、作業の都合上、検査までに数時間放置される場
合もあり、このような放置状態では前述のようにヒトヘ
モグロビンの失活が起こってしまい好ましくない。

このようなヒトヘモグロビンの失活を防止する目的で、
例えばウシ血清アノ１ブミンや糖類などを添加すること
が行なわれているが、充分に効果を発揮するものではな
い。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は上記従来の技術の欠点を解決するためになされ
たものであって、その目的とするところは、被検液中の
ヒトヘモグロビン、特に低濃度にて存在するヒトヘモグ
ロビンの放置中での失活を防止して高感度で正確にヒト
ヘモグロビンを検出できる方法を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 即ち、本発明の検査方法は、抗ヒトヘモグロビン抗体を
用いたヒトヘモグロビンの検出において、ヒト以外の動
物ヘモグロビンを被検液中に添加することを特徴とする
ものである。

本発明の方法において被検体としてのヒトヘモグロビン
を溶解するための液として、例えばりん酸緩衝液、グリ
シン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、アンモニア緩衝液、
はう酸緩衝液などがベース液として用いられる。緩衝液
のｐＨは５〜１０、好ましくは６．５〜８．５の範囲と
する。緩衝液中には生理食塩濃度近傍の食塩を添加する
ことが好ましい。また、細菌等によるヒトヘモグロビン
の変性を抑制するために、抗菌剤として０．０５〜０．
５重量％濃度のアジ化ナトリウムを添加することが好ま
しい。

本発明の方法においては上記緩衝液中に、ヒト以外の動
物由来ヘモグロビン、またはヒト以外の動物の溶血液を
添加する。ヒト以外の動物種としてはウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマ、ウシ、ブタ、マウスなどが挙げられる。こ
れらのうちヒトヘモグロビンとアミノ酸配列が非常に類
似したサルやヒヒなどのヘモグロビンを用いると、検出
時に抗ヒトヘモグロビン抗体と結合してしまう、所謂交
叉反応を起こすことがあるので、このようなときはこれ
らの動物ヘモグロビンを用いないほうがよい。なお、交
叉反応性はあってもその程度が小さい場合には、抗ヒト
ヘモグロビン抗体と結合しないような高濃度の動物ヘモ
グロビンを添加すればよい。

また、ヒト以外の動物ヘモグロビンと、用いる抗ヒトヘ
モグロビン抗体の由来動物種が同一である場合は交叉反
応性が極めて低いので、このような動物ヘモグロビンを
添加することが好ましい。

ヒト以外の動物ヘモグロビンの添加濃度は１００ｎ、ｇ
／−以上、好ましくは１００μｇ／ｒｄ以上とする。添
加濃度が低すぎると、ヒトヘモグロビンの変性を抑制す
る効果が小さくなり、正確にヒトヘモグロビンの検出を
行なうことができない。

本発明の方法では上記のようにしてヒト以外の動物ヘモ
グロビンを添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘ
モグロビンを溶解して被検液とする。具体的には、便潜
血検査の場合、被験者の糞便の一定量を前記動物ヘモグ
ロビンを含有する緩衝液中の一定量に溶解することによ
り調製することができる。

本発明の検出方法を実施するには、従来から知られてい
る抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が
採用できる。

以下にラテックス凝集法を利用した検出方法について例
示する。

精製したヒトヘモグロビンＡを抗原としてウサギ、ヤギ
などの動物に免疫したのち、採血、精製をして抗ヒトヘ
モグロビン抗体を得る。この抗体を中性ｐＨでポリスチ
レンラテックス（粒径０．３μｍ）と混合して数時間吸
着反応させたのち、ウシ血清アルブミンおよび食塩を含
む緩衝液などで遠心分離精製を行ない、抗ヒトヘモグロ
ビン抗体感作ラテックス試薬を得る。

次に、このラテックス試薬と被検液とをガラス板上で撹
拌混合し、数分後のラテックスの凝集像によって、ヒト
ヘモグロビンを定性的に検出することができる。

また、酵素免疫法の場合は、抗ヒトヘモグロビン抗体を
感作したマイクロプレートのウェルに被検液を入れ、洗
浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファター
ゼで標識した抗体を添加し、洗浄して基質溶液を添加す
る。

〈発明の効果〉 以上のように、本発明の方法によれば、ヒト以外の動物
ヘモグロビンを添加しているので、被検液中のヒトヘモ
グロビンを放置中の失活を抑制できるので、高感度にて
検出することができるものである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに具体的に説明する
。

実施例１ ０、２　ｉｏｌ　／　ｉ！−グリシン、０．１％アジ化
す１−リウム、０．９％塩化ナトリウムからなる水溶液
を作製し、ＩＮ−水酸化ナトリウム水溶液にてｐ　Ｈ８
゜０に調整し、この溶液１ｏｏｉにウサギ、ヤギ、ブタ
、ウシ、ウマ由来のヘモグロビンをそれぞれ１００■添
加して溶解し、溶液状にした。

次に、５％カルボキシル化ポリスチレン１０ｍ１ｌに、
１■／厩の１−エチル−５−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド１０ｄを加え、２０分間攪拌しな
がら反応させた後、０．０１ａ＋ｏｌ／Ｃ−はう酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で２回遠心分離精製した。

このラテックス（濃度５％）１０ｄに、精製ヒトへモグ
ロブンをウサギに免疫して作製した抗ヒトヘモグロビン
抗体（ウサギＩｇＧ、濃度５■／ｍ１）１ｔｒｄｌを添
加し、５時間ゆっくりと攪拌しながら反応させ、さらに
０．１％−ウシ血清アルブミンを含む０．０１ｍｏｌ−
はう酸！１衝液（ｐＨ８，０）で３回遠心分離精製し、
ラテックス濃度１％の抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテ
ックス試薬を得た。

次いで、前記動物由来のヘモグロビン溶液を前記グリシ
ン、塩化ナトリウムを含有するグリシン緩衝液で倍々希
釈し、この溶液８０μ尼と前記ラテックス試薬２０μ２
を血清反応盤上のウェル内で混合、攪拌して５分後の凝
集像を肉眼にて観察した。その結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、ブタ、ウシヘモグロビンと
交叉反応が見られた。

次に、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマヘモグロビンを溶解した
前記溶解液（希釈倍数×１）中に、ヒトヘモグロビンの
濃度を変えて溶解したものを８０μｌと、前記１％ラテ
ックス試薬２０μｌをウェル内で混合、攪拌して、５分
後の凝集像を肉眼にて観察した。その結果を第２表に示
す。

第 表 第 表 第２表から明らかなように高感度にヒトヘモグロビンを
検出することができることが判明した。

次いで、ウサギヘモグロビン濃度を変えて溶解した前記
溶解液中に、ヒトヘモグロビンを濃度を変えて溶解した
ものを８０μｉと、前記１％ラテックス試薬２０μ２を
ウェル内で混合、攪拌して、５分後の凝集像を肉眼にて
観察した。

さらに、このヒトヘモグロビン溶解液をそれぞれの濃度
で２５°Ｃにて５日間放置したのち、再度ラテックス試
薬と混合し、凝集像を観察した。

これらの結果を第３表および第４表に示す。

下記第３表及び第４表から明らかなようにウサギヘモグ
ロビンを高濃度にて添加することにより、ヒトヘモグロ
ビンを高感度にて検出することができる。

（以下、余白） 第 表 （以下、 余白） （以下、 余白） 比較例１ 実施例１と同様にして作製したグリシン緩衝液（０，２
ｍｏｌ　／　１　）に、ウシ血清アルブミンを濃度を変
えて溶解した。この溶解液にヒトヘモグロビンを濃度を
変えて溶解したちの８０μ２と、実施例１で作製した１
％ラテックス試薬２０μｉを混合、攪拌して５分後の凝
集像を肉眼で観察した。

また、このヒトヘモグロビン溶解液をそれぞれの濃度で
２５°Ｃにて５日間放置した後、再度ラテンクス試薬と
混合して凝集像を観察した。

その結果を第５表および第６表に示す。

下記比較例１の結果（第５表及び第６表）から明らかな
ように、何も添加しなかった場合は感度が低下した。ま
た、ウシ血清アルブミンの添加によってもある程度感度
は上昇したが、５０間の放置によって感度が低下した。

第 表

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロビ
   ンの検出において、ヒト以外の動物ヘモグロビンを被検
   液中に添加することを特徴とするヒトヘモグロビンの検
   出方法。
2. （２）ヒト以外の動物ヘモグロビンを被検液中に１００
   ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で添加する請求項（１）記載のヒ
   トヘモグロビンの検出方法。
3. （３）ヒト以外の動物ヘモグロビンが、使用する抗ヒト
   ヘモグロビン抗体と同一由来動物から得られたものであ
   る請求項（１）または（２）記載のヒトヘモグロビンの
   検出方法。