CN102621328B

CN102621328B - 牛奶抗体谱诊断试剂盒

Info

Publication number: CN102621328B
Application number: CN201210065508.0A
Authority: CN
Inventors: 常艳敏; 李会强; 吴瑞杰; 李婵; 孙静文; 张爱民
Original assignee: TIANJIN NANKAI HOSPITAL
Current assignee: TIANJIN NANKAI HOSPITAL
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: CN102621328A

Abstract

本发明公开了一种牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法，属于酶免疫印迹技术。本发明包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括标本稀释液，酶标抗体稀释液和浓缩洗液，以及分别包被酪蛋白并标记T1、大分子蛋白标记T2、α-乳白蛋白标记T3、β-乳球蛋白标记T4的检测区，以及包被兔抗鼠IgG抗体并标记C的质控区。这样设计的本发明，由于包被4种过敏原，并采用相同浓度分区包被，使不同特异性IgE检测能够保证相同效果的特异性和敏感性；同时，检测结果能够回答待检血清中存在几种过敏原组分的特异性抗体，能够提高临床诊断准确性，适合牛奶过敏的进一步确认并制定合理脱敏方案。

Description

牛奶抗体谱诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及酶免疫印迹技术，具体是一种牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

早期对于食物过敏的检测，主要集中在病史观察，及体内试验（如皮肤点刺试验、食物激发试验）；但这些方法不仅昂贵、耗时，并且存在着诱发严重过敏反应的风险，已渐渐被淘汰。过敏反应的本质是一种错误的免疫应答，机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体（IgE和IgG），而正常机体内不存在此种特异性抗体。因此，目前临床上常采用检测特异性抗体来确定患者食物过敏情况，最终确定过敏食物。

采用体外检测特异性抗体的方法来确定食物过敏原，显著优于普遍使用的皮肤点刺试验（体内检测），它具有不受药物干扰、安全无风险、患者容易接受等优点。特异性IgE测定基于免疫化学原理，即通过已知抗原（过敏原）测定未知抗体（IgE）。血清特异性IgE需要采用标记免疫技术，通常使用酶、荧光物质等作为标记物，即酶联免疫吸附试验、酶免疫印迹法以及荧光酶免疫法。因此，特异性IgE抗体被广泛用于过敏患者食物过敏原的鉴别。

特异性IgE测定原理是用已知抗原（过敏原）检测未知抗体（sIgE）,包被于固相材料（聚苯乙烯或硝酸纤维素膜）表面已知抗原的组份将决定特异性IgE检测结果的准确性。然而，现有诊断试剂盒多采用从食物中提取的总蛋白成份作为已知抗原，一般不进行单一成份提取，也不考虑各组份之间的比例关系。基于食物总蛋白提取物作为包被抗原，检测特异性IgE的食物过敏原诊断试剂盒均存在如下缺陷或不足。以牛奶为例：①牛奶中过敏原组份蛋白浓度比例不同，而含量低的蛋白成份未必不是主要过敏原。如酪蛋白含量在牛奶中约占80%，但并不是主要过敏原；而β-乳球蛋白含量在牛奶中只占10%，但却是重要的过敏原。如用牛奶中提取的总蛋白作为包被抗原，酪蛋白包被浓度偏高，β-乳球蛋白包被浓度偏低。为此，不能很好地检测针对β-乳球蛋白的特异性IgE。②食物过敏反应存在明显个体差异，不同牛奶过敏患者血清中特异性IgE存在明显个体差异；换言之，牛奶过敏患者血清中特异性IgE的种类和浓度存在一定差别，而这种差别对临床诊断和治疗有重要指导意义。现有食物过敏原试剂盒由于采用总蛋白进行包被，不能对特异性IgE的异质性进行区分。

发明内容

本发明为了解决目前牛奶特异性诊断试剂盒只能筛选出血清中牛奶特异性IgE的存在，而不能确定患者对牛奶中不同过敏蛋白过敏性的差异，以及由于不同过敏原组份包被浓度差异导致造成的假阴性或假阳性的问题，而提供一种多组分特异性IgE联合测定的牛奶抗体谱诊断试剂盒及其制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种牛奶抗体谱诊断试剂盒，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括分别包被有酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和兔抗鼠IgG抗体的硝酸纤维膜检测条，标本稀释液，酶标抗体稀释液和浓缩洗液。

所述牛奶抗体谱诊断试剂盒，其硝酸纤维膜检测条上按一定间距形成有包被酪蛋白并标记T1、包被大分子蛋白并标记T2、包被α-乳白蛋白并标记T3、包被β-乳球蛋白并标记T4的检测区，以及包被兔抗鼠IgG抗体并标记C的质控区。

一种牛奶抗体谱诊断试剂盒的制备方法，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括包被有酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的检测区和包被兔抗鼠IgG抗体的质控区的硝酸纤维膜检测条，稀释待测血清的标本稀释液，与兔抗鼠IgG抗体结合的酶标抗体稀释液和浓缩洗液；

其中，硝酸纤维膜检测条的制备方法是：硝酸纤维素膜在膜处理液（TBS）中浸泡5-10分钟，经蛋白点样板按一定间距，以1.6-2.4毫克/毫升的浓度分别一次点样形成包被酪蛋白、大分子蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的检测区和包被兔抗鼠IgG抗体的质控区，室温温育2小时，依次用蒸馏水、膜处理液冲洗后，再用1.8%-2.2%的聚乙烯醇溶液室温封闭1小时，漂洗弃去封闭液，风干，备用。

其大分子蛋白的制备方法是：

a.鲜牛奶低温离心去脂过滤得脱脂奶，加入等量0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液,用盐酸调pH至4.6；40℃水浴30min，使酪蛋白充分析出，离心取上清的乳清蛋白，超滤器浓缩，使蛋白浓度至5-10mg/ml，备用；

b.另取凝胶粉末溶于足量双蒸水中充分溶胀，溶胀后的凝胶经脱气处理，装入层析柱内，用0.01M pH 7.4 PB充分平衡；

c.取2-3ml乳清蛋白溶液，加在凝胶上面，用0.01M pH 7.4 PB洗脱，最先被洗脱的蛋白峰即为大分子蛋白。

所述牛奶抗体谱诊断试剂盒的制备方法，其酶标抗体稀释液是按以下配比的原料制备的：

双蒸水（ddH₂O） 80 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 0.606 g

氯化钠（NaCl） 0.877 g

氯化镁（1M MgCl₂） 0.1ml

氯化锌（0.1M ZnCl₂） 0.1ml

氨基己酸（ACA） 1 g

叠氮钠（NaN₃） 0.1 g

牛血清白蛋（白BSA） 2 g

加ddH₂O定容至1L，用HCl或NaOH调PH，保证其在7.95-8.05范围内，最后用0.22μm的滤膜过滤。

所述牛奶抗体谱诊断试剂盒的制备方法，其标本稀释液是按以下配比的原料制备的：

双蒸水（ddH₂O） 400 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.03 g

氯化钠（NaCl） 4.38g

防腐剂（Proclin 300） 0.25ml

用HCl或NaOH调pH于7.95-8.05

牛血清白蛋白（BSA） 10g

吐温20（ Tween） 0.25ml

加入ddH₂O至500ml，用0.22μm的滤膜过滤。

所述牛奶抗体谱诊断试剂盒的制备方法，其浓缩洗液是按以下配比的原料制备的：

双蒸水（ddH₂O） 140 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.12g

氯化钠（NaCl） 17.72g

防腐剂(Proclin 300) 10 ml

氯化镁1M （MgCl₂） 2 ml

氯化锌0.1M（ZnCl₂） 2 ml

用HCl或NaOH调PH使其在7.3-7.5，加入4ml的Tween20，用ddH₂O定容至200ml，最后用0.22μm的滤膜过滤，临用时用蒸馏水稀释10倍。

这样设计的本发明，由于四种包被抗原（过敏原）采用相同浓度分区包被，使不同特异性IgE检测能够保证相同效果（特异性和敏感性）；同时，检测结果能够回答待检血清中存在几种过敏原组份的特异性抗体（IgE），能够提高临床诊断准确性，适合牛奶过敏的进一步确认，并根据患者含有特异性IgE种类制定合理脱敏方案。

附图说明

图1是本发明中硝酸纤维膜检测条平面结构示意图；

图2本发明检测原理示意图。

其中：T.检测区：T1 酪蛋白检测区 T2大分子蛋白检测区

T3 α-乳白蛋白检测区 T4 β-乳球蛋白检测区

C.质控区

1.包被酪蛋白 2.包被大分子蛋白

3.包被α-乳白蛋白 4.包被β-乳球蛋白

5.包被兔抗鼠IgG抗体 6.硝酸纤维素膜检测条

7.待检抗体（IgE） 8.酶标鼠抗人IgE抗体

9.显色底物 10.有色产物

E.辣根过氧化物酶。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

1.溶液配制

⑴ 磷酸盐缓冲溶液（PB） 0.1M pH 7.4

双蒸水（ddH₂O） 3.6 L

磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O） 11.84 g

磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O） 116 g

磁力搅拌，充分溶解后，调pH 至7.4，补加ddH₂O定容至4L。

⑵硝酸纤维膜处理液(下称膜处理液或TBS）

双蒸水（dd H₂O） 800 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 6.055 g

叠氮钠（NaN₃） 1 g

氯化钠（NaCl） 8.766 g

用HCl或NaOH调pH 至7.95-8.05，加dd H₂O定容至1L。

⑶ 样本稀释液

双蒸水（ddH₂O） 400 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.03 g

氯化钠（ NaCl） 4.38g

防腐剂300（Proclin） 0.25ml

用HCl或NaOH调pH于7.95-8.05

牛血清白蛋白（BSA） 10g

吐温20 （Tween） 0.25ml

加入ddH₂O至500ml，用0.22μm的滤膜过滤

⑷ 浓缩洗液（10倍）

双蒸水（ddH₂O） 140 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.12 g

氯化钠（NaCl） 17.72 g

防腐剂300(Proclin) 10 ml

氯化镁1M（MgCl₂） 2 ml

氯化锌0.1M（ZnCl₂） 2 ml

⑸ 酶标抗体稀释液

双蒸水（ddH₂O） 80 ml

三羟甲基氨基甲烷（Tris） 0.606 g

氯化钠（NaCl） 0.877 g

氯化镁1M（MgCl₂） 0.1ml

氯化锌0.1M（ZnCl₂） 0.1ml

氨基己酸（ACA） 1 g

叠氮钠（NaN₃） 0.1 g

牛血清白蛋白（BSA） 2 g

用HCl或NaOH调PH使其在7.95-8.05，然后加ddH₂O定容至1L，再检测PH保证其在7.95-8.05范围内，最后用0.22μm的滤膜过滤。

⑹ 底物溶液

采用硝基蓝四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）混合液，为商品化试剂，美国Sima公司有售。

2.制备牛奶中大分子蛋白

文献报道牛奶中主要过敏原包括：酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，但在我们的研究中发现牛奶乳清蛋白经Sephadex G200凝胶层析后第一个蛋白峰，与牛奶过敏患者血清（sIgE）存在很强的反应性，说明这一组分是牛奶中重要的过敏原。经SDS-PAGE证实此组分是一些大分子蛋白质，具体成份有待证实，暂命名为大分子蛋白。

提取方法：

⑴ 分离乳清蛋白

鲜牛奶低温离心5000 rpm，20 min，吸去上层大部分脂肪；取下层清液并用双层纱布过滤后即得脱脂奶。脱脂奶加入等量0.1M pH 7.4 PB,用盐酸调pH至4.6；40℃水浴30min，使酪蛋白充分析出。离心8000 rpm，30 min，上清为乳清蛋白，沉淀为酪蛋白。

采用millipore超滤器将乳清蛋白溶液进行浓缩，以截流分子量10 kDa的YM-10滤膜对乳清蛋白溶液进行正压超滤浓缩，使蛋白浓度至5-10mg/ml，保存备用。

⑵ 分离大分子蛋白

采用Sephadex G200凝胶层析分离大分子蛋白：

① 凝胶的预处理称取一定量的凝胶粉末溶于足量双蒸水中沸水浴使凝胶充分溶胀，再用双蒸水漂洗若干次去除细碎颗粒。处理后凝胶需浸泡于储存液中于4℃保存备用。

② 装层析柱将溶胀后的凝胶在磁力搅拌下用真空泵脱气处理，而后进行装柱，选择柱高约80cm，小心将处理后的凝胶装入层析柱内，用0.01M pH 7.4 PB充分平衡（10倍柱床体积）。连接紫外监测装置和恒流泵，控制蠕动泵速20 rpm。

③ 上样分离取2-3ml乳清蛋白溶液，小心加在凝胶上面，用0.01M pH 7.4 PB洗脱，控制蠕动泵速20 rpm，最先被洗脱的蛋白峰即为大分子蛋白。

④ 将收集的成份进行SDS-PAGE鉴定，同时采用上述方法进行浓缩，无菌过滤，测定蛋白浓度并分装保存（-30℃）。

3. 制备硝酸纤维膜检测条（NC）

⑴ 膜处理：取一张硝酸纤维素膜（7cm×8cm），做标记后放在膜处理液（TBS）pH 8.0中浸泡5-10分钟；硝酸纤维素膜购自碧云天生物科技有限公司，进口原装（货号：FFN09）。

⑵ 组装点样装置：将浸泡过的硝酸纤维膜放在平铺的垫子上，放上蛋白点样板子，板子两侧的孔要在硝酸纤维膜6上，上面留出贴标记纸的地方，用夹子固定；

⑶ 点样：划分好检测区T1、T2、T3、T4和质控区C，分别为60mm×5mm，其中检测区T1至T4分别包被酪蛋白1、大分子蛋白2、α-乳白蛋白3和β-乳球蛋白4，质控区C包被兔抗鼠IgG抗体5。所有样品蛋白最佳浓度为2毫克/毫升；以上均点样一次，室温温育2小时；

⑷ 封闭：取出硝酸纤维膜用蒸馏水冲洗三次，TBS洗10分钟，再用2% 聚乙烯醇（PVA）溶液（称取2克聚乙烯醇溶于100毫升蒸馏水）室温封闭1小时；

⑸ 漂洗：弃去封闭液，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗三次，每次10分钟；

⑹ 风干：将硝酸纤维膜检测膜（NC）放在干燥的纸上，自动干燥，贴标记纸，剪切成条备用。

4.酶标记鼠抗人IgE抗体

鼠抗人IgE-Ap（碱性磷酸酶）抗体为商品化试剂，购自美国R&D公司。产品说明书提供最佳稀释浓度1:1000，范围1:800-1:12000。

5.本发明的使用方法（测定步骤）

⑴ 将硝酸纤维素膜检测条6放入印记反应槽内（未图示），加入1ml洗液；放在摇床上摇10分钟，使检测条充分润湿。

⑵ 吸干槽中的洗液，加入0.5ml稀释后的待测血清（血清标本用标本稀释液稀释10倍），置摇床上，室温反应2小时，此时血清中抗体与相应过敏原结合。

⑶ 吸干槽中的血清，加1ml洗液，置摇床中震荡3-5分钟；重复洗涤3-5次。

⑷ 吸干槽中的洗液，加入0.5ml 1:150稀释鼠抗人IgE-AP标记抗体，置摇床上，室温反应0.5小时，C区兔抗鼠IgG抗体与酶标记抗体结合形成复合物，T区则形成过敏原-特异性IgE抗体-酶标记抗体复合物。

⑸ 吸干酶标抗体，加1ml洗液，置摇床中震荡3-5分钟；重复洗涤3-5次。

⑹ 加入0.5ml显色底物溶液，避光反应大约15-20分钟，而若血清中无相应抗体，则该检测区无显色；质控区C无论血清中有无特异性抗体，酶标记抗体均会与硝酸纤维素膜表面的羊抗鼠IgG抗体结合，加入底物后出现显色带。

⑺ 倒掉底物，加1ml洗液，置摇床中震荡3-5分钟；重复洗涤3次。

⑻ 干燥检测条，根据检测区显色情况判定检测结果，确认患者血清存在IgE的种类。

注：如质控区C未显色说明本次检测出现问题，不能报告结果。

Claims

1.一种牛奶抗体谱诊断试剂盒，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，其特征在于：该试剂盒还包括分别包被有酪蛋白(1)、大分子蛋白(2)、α-乳白蛋白(3)、β-乳球蛋白(4)和兔抗鼠IgG抗体(5)的硝酸纤维膜检测条(6)，标本稀释液，酶标抗体稀释液和浓缩洗液。

2.根据权利要求1所述牛奶抗体谱诊断试剂盒，其特征在于：硝酸纤维膜检测条上按一定间距形成有包被酪蛋白(1)并标记（T1）、包被大分子蛋白(2)并标记（T2）、包被α-乳白蛋白（3）并标记（T3）、包被β-乳球蛋白（4）并标记（T4）的检测区(T),以及包被兔抗鼠IgG抗体(5)并标记（C）的质控区。