CN101329341A - 检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括反应卡、酶联试剂、显色剂、终止液和浓缩洗涤液，所述反应卡由载片和固定在载片上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，该硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有分别由nRNP/Sm、Sm、SS－A、Ro－52、SS－B、Scl－70、Jo－1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA－M2、PM－Scl、CENP B、PCNA15天然及重组抗原包被而成的15条平行的检测线。本发明试剂盒可准确诊断出自身免疫疾病，克服了现有免疫印迹诊断方法在检测自身免疫疾病中所存在的缺点，具有敏感度高、特异性强、准确性好，操作简便，样品消耗少，结果判断客观等优点。

Description

检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种诊断疾病的试剂盒，尤其涉及一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体(anti-nucleic antibody，ANA)谱的试剂盒，本发明还涉及该诊断试剂盒的制备方法及其使用方法，属于生物医学领域。
背景技术
自身免疫疾病是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。常见的自身免疫疾病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病、慢性肝病等。
正常情况下免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。如果不加以及时有效的控制，其后果十分严重，最终甚至危害生命。在目前自身免疫疾病发病机理不清楚的情况下，最好办法就是早期发现、早期诊断与早期治疗，这是提高自身免疫疾病疗效的关键。
虽然不同的自身免疫疾病各有其特殊的临床表现和诊断标准，但其常具有一个共同特征就是患者的血清中常可以检测出高滴度的自身抗体或能与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞，其中常通过检测血清中抗核抗体(anti-nucleic antibody，ANA)来诊断自身免疫疾病。抗核抗体是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称。所用混合抗原中，nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA-M2；PM-Scl、CENP B及PCNA等是常见抗核抗体的靶成分，目前国内外还没有同时检测十五种抗核抗体的诊断试剂。
对于自身免疫疾病诊断方法多采用间接免疫荧光分析法、酶联免疫吸附法(ELISA)或免疫印迹，但各有其不足。间接免疫荧光分析法是检测自身抗体的常用技术。其实验基质为Hep-2细胞或不同灵长类肝脏组织冰冻切片，含有完整的抗原谱。许多组织经间接免疫荧光分析法着染可提示自身抗体的存在，但是不能对自身抗体的种类进行具体客观的评价，因此其特异性的证实需要其他技术如免疫印迹法、ELISA等进行二级确认试验。并且对间接免疫荧光分析法着染的鉴定有一定的主观性，因而对结果的解释可能在不同时间点、不同观察者之间、新老组织切片之间存在差异。酶联免疫吸附法(ELISA)具有成熟度高、灵敏度高、特异性强、操作方法简便快速、无放射性污染且检测结果排除了认为的主观判断，以及应用范围广等很多优点，但一次试验只能检测单一指标，通量低，检测成本较高，在自身免疫疾病的诊断应用推广方面存在着极大的局限性。免疫印迹诊断试剂是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性的优点。但是在SDS-PAGE的过程中，许多抗原决定簇的构像可能遭到破坏，不能与特异性抗体发生或者发生非特异性结合，造成结果判断错误。所以，目前对于自身免疫疾病的诊断方法还需进一步的改进。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的检测自身免疫疾病相关ANA谱的试剂盒，该试剂盒可以联合检测常用于诊断自身免疫疾病的十五种抗核抗体(ANA)，不仅大大提高了检测效率，而且相对于单检试剂更具有灵敏度高、特异性强等优点。
本发明目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测自身免疫疾病相关ANA谱的试剂盒，该试剂盒包括：反应卡、酶联试剂、显色剂、终止液、浓缩洗涤液；其中，所述反应卡由载片和固定在载片上的包被有15条平行的抗原检测线的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，该抗原检测线分别由nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENP B、PCNA彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上而形成。
为了达到更好的检测效果，优选的：
所述的检测膜条还可含有1条由抗羊IgG包被或划线而成的对照线；
检测膜条上的每一检测线对应于或置于载片反应区彼此分隔的反应槽中，反应槽为长4mm、宽2mm、高1mm的长方槽，使每一检测线形成一独立的检测区域。
所述的酶联试剂优选为碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG；
所述的显色剂优选为5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸；
所述的终止液优选为1×磷酸盐缓冲液；
所述的浓缩洗涤液优选为10×磷酸盐缓冲液；
为了达到更好的检测效果，所述的15种抗原优选为天然抗原或真核表达重组抗原，可分别按照以下方法制备得到：
(1)天然抗原提取：nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、dsDNA、核小体、组蛋白及核糖体P蛋白为利用丙酮法从犊牛胸腺组织提取的天然蛋白；AMA-M2从猪心组织提取的天然蛋白；其具体的提取方法如下：犊牛胸腺和猪心冻存于-80℃超低温冰箱，首先，4℃下分别以磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris-HCl缓冲液为提取液提取ANA，用-20℃预冷的丙酮沉淀提取ANA成干粉，与Sigma公司兔胸腺丙酮粉一起做聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和垂直转印(Western blot)，转印至硝酸纤维膜上，ID和IBT检测抗ANA抗体，其次，硫酸铵不同饱和浓度分步沉淀猪心丙酮粉抗原，PEG6000不同浓度分步沉淀犊牛胸腺及兔胸腺丙酮粉抗原。
(2)重组抗原的真核表达：Ro-52、PM-Scl、CENP B、PCNA利用Bac toBac杆状病毒表达系统表达重组蛋白。具体方法如下：分别参考SS-A、PM-Scl、CENP B、PCNA基因序列，设计相对应的引物，PCR扩增Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA基因，将其克隆到pFastBacHTc中，通过转化E.Coli DH10Ba，筛选克隆，抽提重组Bacmid/cystatin，后者经Cellfectin介导转染Sf9细胞，获取重组病毒，扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达，其中重组蛋白带有5×His标签。SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白。优化表达条件，并采用昆虫细胞悬浮培养技术进行抗原表达。
(3)对十五种抗原的鉴定、纯化分离：用阳性标准血清(由美国亚特兰大疾病控制中心提供CDC-ANA#1至#11)鉴定抗原；硫酸铵盐析-透析-离子交换柱-葡聚糖凝胶柱-免疫亲和层析等方法分离纯化十五种抗原(纯度可达到90％以上)。
本发明中，所述的自身免疫疾病可以是系统性红斑狼疮(SLE)，混合性结缔组织病(MCTD)、干燥综合症(SS)、系统性硬皮病(PSS)、多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)或类风湿性关节炎(RA)。
本发明在免疫印迹诊断方法的基础上进行了改进，对所用抗原从动物组织中进行提取或采用真核表达的方式得到重组蛋白，将它们进行纯化分离后，直接包被于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，弥补了免疫印迹诊断方法所用抗原不具有天然结构的缺点，提高了自身免疫疾病诊断的敏感度、特异性和准确性；并且检测膜条固定在载片上，其中每一抗原对应一分隔开来的反应槽，形成独立的检测区域，操作更加简便，样品消耗少，结果判断不受人为的主观因素的影响。
本发明试剂盒的使用方法：
样品要求：静脉取血2-5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清标本保存2-8℃，在24小时内不能测试的标本应放-20℃，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测试。
1、加样
用样品稀释液(磷酸盐缓冲液)按照1∶100稀释待检样本，反应卡的每一反应槽中加入100ul稀释待检样本，放入孵育震荡器。37℃反应30分钟。
2、洗板
样本反应结束后，弃去反应液，振荡洗涤3×5min。
3、加入酶标二抗
碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG的抗体10倍稀释，向每一反应槽中加入100ul，放入孵育振荡器，37℃反应30分钟。反应结束后洗膜。
4、检测
每一反应槽加入配置好的显色液100ul，室温10min观察结果。如有一条或一条以上的检测条带显色，即患有自身免疫疾病。
附图说明
图1本发明试剂盒中的反应卡示意图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1  本发明试剂盒的制备
1、天然抗原的制备
(1)天然抗原提取：nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、dsDNA、核小体、组蛋白及核糖体P蛋白为利用丙酮法从犊牛胸腺组织提取的天然蛋白；AMA-M2从猪心组织提取的天然蛋白。具体方法如下：
犊牛胸腺和猪心冻存于-80℃超低温冰箱，首先，4℃下分别以磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris-HCl缓冲液为提取液提取ANA，用-20℃预冷的丙酮沉淀提取ANA成干粉，与Sigma公司兔胸腺丙酮粉一起做聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和垂直转印(Western blot)，转印至硝酸纤维膜上，ID和IBT检测抗ANA抗体，其次，硫酸铵不同饱和浓度分步沉淀猪心丙酮粉抗原，PEG6000不同浓度分步沉淀犊牛胸腺及兔胸腺丙酮粉抗原。
(2)重组抗原的真核表达：Ro-52、PM-Scl、CENP B、PCNA利用Bac toBac杆状病毒表达系统表达重组蛋白。具体方法如下：
分别参考Ro-52、PM-Scl、CENP B、PCNA基因序列，设计相对应的引物，PCR扩增Ro-52、PM-Scl、CENP B、PCNA基因，将其克隆到pFastBacHTc中，通过转化E.Coli DH10Bac筛选克隆，抽提重组Bacmid/cystatin，后者经Cellfectin介导转染Sf9细胞，获取重组病毒，扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达，其中重组蛋白带有5×His。SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白。优化表达条件，并采用昆虫细胞悬浮培养技术进行抗原表达。
(3)对十五种抗原的鉴定、纯化分离：用阳性标准血清(由美国亚特兰大疾病控制中心提供CDC-ANA#1至#11)鉴定抗原；硫酸铵盐析-透析-离子交换柱-葡聚糖凝胶柱-免疫亲和层析等方法分离纯化十五种抗原。
2、包被
将0.1-1ul的含有1-100ng的上述十五种相关疾病特异性抗原及抗羊IgG的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液用全自动点样仪划线于硝酸纤维素膜上，4℃包被16-24个小时。具体的，如图1所示，其中用于划线的形式不局限于所表示的形式，各种抗原的排列顺序可以进行任意调整。
3、封闭
用50-200ul的含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脱脂奶粉，5-10％的蔗糖的0.01-0.1M的磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液，37℃封闭0.5-3小时，用含有经10倍稀释的浓缩洗液洗涤。晾干后，于2-8℃保存备用。
4、固定载片
将所制备的检测膜条固定在载片上，其中每一抗原或检测线对应或放置于载片反应区中一个彼此分隔的反应槽中，形成独立的检测区域，得到反应卡。
5、试剂盒的组装
反应卡1个，标准品1×0.02ml、酶联试剂1×3ml、样品稀释液1×100ml、浓缩洗涤液1×50ml、显色液1×30ml。
实施例2  本发明试剂盒的使用方法
样品要求：静脉取血2-5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清标本保存2-8℃，在24小时内不能测试的标本应放-20℃，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测试。
1、加样
用样品稀释液按照1∶100稀释待检样本，如上述实施1所制备检测试剂的反应槽中加入100ul，放入孵育震荡器。37℃反应30分钟。
2、洗板
样本反应结束后，弃去反应液，振荡洗涤3×5min。
3、加入酶标二抗
碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG的抗体10倍稀释，向每一反应槽中加入100ul，放入孵育振荡器，37℃反应30分钟。反应结束后洗膜。
4、检测
每一反应槽加入配置好的显色液100ul，室温10min观察结果。
试验例1  本发明试剂盒临床检测自身免疫疾病的试验
取225例自身免疫疾病患者，其中系统性红斑狼疮患者(SLE)45人、硬皮症患者(MCTD)38人、干燥综合征患者(SS)14人、肌炎(DM)患者45人、多发性肌炎患者(PM)25人、混合型结缔组织病(MCTD)患者22人、原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者36人；
另选75例正常对照(对照组)。
标本收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血3ml。分离血清，置一20℃冰箱保存。采用本发明试剂盒(实施例1所制备)检测nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA-M2；PM-Scl、CENP B及PCNA。严格按试剂盒说明书操作。
统计学方法应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析和q检验；率的比较用x2检验。试验结果见表1。
表1  对300份血清检测的显色结果
名称 SLE MCTD SSc SS PM DM PBC 健康人   阳性符合率 特异性
 nRNP/Sm   18   22   0   3   3   0   0   0   94   96.3
 Sm   43   0   0   0   0   0   0   0   95.6   100
 SS-A   18   2   1   14   1   4   0   0   89   95.3
 Ro-52   44   10   7   14   5   11   0   0   99   81.3
 SS-B   5   3   0   14   0   2   0   0   86   97
 Scl-70   0   0   37   0   0   0   0   0   97.3   100
 Jo-1   0   0   0   0   0   44   0   0   97.8   100
 dsDNA   28   13   0   10   8   0   0   0   80   96.3
 核小体   41   0   0   0   0   0   0   0   91   100
 组蛋白   35   0   0   0   1   4   0   0   78   97.3
 核糖体P蛋白   39   0   0   0   3   2   0   0   87   97.3
 PM-Scl   0   0   0   0   14   0   0   0   56   100
 CENP B   0   1   29   0   0   3   0   0   76   98.3
 PCNA   29   6   0   0   5   7   0   0   65   90
 AMA-M2   23   0   0   0   0   0   36   0   87   100
从试验结果可见，本发明试剂盒可以准确的检测或诊断出自身免疫疾病(包括系统性红斑狼疮、硬皮症、干燥综合征、肌炎、多发性肌炎、混合型结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化)，具有敏感度高、特异性强、准确性好，操作简便，样品消耗少，结果判断客观等优点。

Claims (9)

1、一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，包括：反应卡、酶联试剂、显色剂、终止液和浓缩洗涤液，其特征在于：所述反应卡由载片和固定在载片之上的包被有15条平行的抗原检测线的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，该抗原检测线分别由nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENP B和PCNA彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上而形成。
2、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜还含有1条由抗羊IgG划线而成的对照线。
3、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上的每一检测线对应于或者置于载片反应区中彼此分隔的一个相对独立的反应槽中。
4、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮，混合性结缔组织病、干燥综合症、系统性硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎、或类风湿性关节炎。
5、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶联试剂为碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG；所述的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸；所述的终止液为1×磷酸盐缓冲液；所述的浓缩洗涤液为10×磷酸盐缓冲液。
6、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白或AMA-M2为天然抗原。
7、按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白或核糖体P蛋白采用丙酮法从犊牛胸腺组织中提取得到。
8、按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的天然AMA-M2从采用丙酮法猪心组织中提取得到。
9、按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达Ro-52、PM-Scl、CENP B或PCNA基因，分别得到Ro-52、PM-Scl、CENP B或PCNA重组抗原。
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