CN108998461A

CN108998461A - 一种重组人PM/Scl100融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN108998461A
Application number: CN201810809491.2A
Authority: CN
Inventors: 李庆春; 杨阳; 钱林; 周延庆
Original assignee: Jiangsu Hao Bo Biomedical Ltd By Share Ltd
Current assignee: Jiangsu Hao Bo Biomedical Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明涉及一种重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，合成人PM/Scl100基因并在两端添加酶切位点后，亚克隆至克隆载体构建重组质粒；将重组质粒经限制性内切酶消化后，在T4连接酶的作用下，与经过相同限制性内切酶消化后的真核表达载体连接，然后转化大肠杆菌JM109，获得重组载体；将重组载体转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒；将重组杆粒转染进入SF9细胞制得杆状病毒；将杆状病毒转染进入SF9细胞获得重组蛋白；对重组蛋白进行纯化获得所述的重组人PM/Scl100融合蛋白。本发明能够高效表达、生产重组人PM/Scl100融合蛋白，获得的重组人PM/Scl100融合蛋白的纯度高，收率高。

Description

一种重组人PM/Scl100融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和生物工程技术，具体涉及一种重组人PM/Scl100融合蛋白及其制备方法。

背景技术

系统性硬化症(SSc)是一种病因未明，以小血管结构和功能异常为主要表现，并逐渐出现皮肤和内脏器官的纤维组织增生、硬化，最后萎缩的自身免疫性疾病。该病分为局限型和弥漫型两类。系统性硬化症患者主要存在多种自身抗体，包括抗多发性肌炎-硬化症(PM/Scl)抗体、抗Scl-70抗体、抗着丝点抗体(ACA)、抗核糖核蛋白(RNP)抗体、抗核抗体(ANA)等。近年来由于对此类疾病研究的不断深入以及临床上相关免疫学检测试剂盒不断涌现，发现我国人群中SSc患者不断增多。

PM/Scl抗体是在患有多肌炎/硬皮病重叠综合征的患者体内均大量存在，它是针对细胞核PM/Scl大分子复合物的一组异构的自身抗体。研究表明，PM/Scl 75和PM/Scl 100是其中两个重要的自免抗原。同时，几乎100％的PM/Scl抗体可检测出抗原PM/Scl 100，50％-60％的PM/Scl抗体可检测出抗原PM/Scl 75。在患有多发性肌炎、硬皮病或多肌炎/硬皮病重叠综合征的群体中均会出现抗PM/Scl 100的自身抗体。因此，PM/Scl 100抗原是该自身免疫疾病最重要的诊断指标之一，对研制PM/Scl抗体检测试剂盒具有重要的临床意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够高效表达、生产的重组人PM/Scl100融合蛋白及其制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成人PM/Scl100基因并在两端添加酶切位点后，亚克隆至克隆载体构建重组质粒；

(2)将步骤(1)获得的重组质粒经限制性内切酶消化后，在T4连接酶的作用下，与经过相同限制性内切酶消化后的真核表达载体连接，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组载体；

(3)将步骤(2)获得的重组载体转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒；

(4)将步骤(3)获得的重组杆粒转染进入SF9细胞制得杆状病毒；

(5)将步骤(4)获得的杆状病毒转染进入SF9细胞获得重组蛋白；

(6)对步骤(5)获得的重组蛋白进行纯化获得所述的重组人PM/Scl100融合蛋白。

优选地，步骤(1)中，所述的合成人PM/Scl100基因的方法为：根据人PM/Scl 100kDnucleolar protein的mRNA序列合成基因序列，然后根据昆虫真核表达系统进行密码子优化，调节GC含量，优化稀有密码子。

优选地，步骤(1)中，所述的酶切位点为BamH I酶切位点和Hind III酶切位点。

优选地，步骤(1)中，添加有酶切位点后的基因序列为与SEQ ID NO.3至少具有80％以上同源性的基因序列，进一步优选为具有85％以上同源性，更优选为具有90％以上同源性，再优选为具有95％以上同源性，最优选为SEQ ID NO.3所示序列。

优选地，步骤(1)中的克隆载体为PUC18载体。

优选地，步骤(2)中的限制性内切酶为BamH I和Hind III。

本发明中的真核表达载体是具有多克隆位点并且可以通过多个调控原件在真核表达系统调控进而表达插入基因的分子生物学载体。更进一步的说是可以通过信号肽进行分泌表达或者不带有信号肽进行胞内表达的载体。本发明不限制选择使用的载体，但优选地，步骤(2)中的真核表达载体为pFastBac HTA载体。

所述的真核表达系统是可以表达外源基因的真核细胞，本发明不限制使用宿主细胞，在进一步的试验中我们选择使用SF9细胞系。

优选地，步骤(2)中，在T4连接酶的作用下进行连接的温度为23～25℃，时间为2～5小时。

优选地，步骤(4)中的杆状病毒由所述的重组杆粒转染进入SF9细胞获得病毒后，再进行多次转染进入SF9细胞进行传代培养获得。

进一步优选地，步骤(4)的具体实施方式为：将所述的重组杆粒转染进入SF9细胞中进行培养至细胞逐渐脱离贴壁培养时，收集P1代病毒，并转染SF9细胞培养至细胞逐渐脱离贴壁培养时，收集P2代病毒，并转染SF9细胞培养至细胞逐渐脱离贴壁培养时，收集P3代病毒，即为所述的杆状病毒。

本发明中，所述的转染方法是指可以促进外源基因进入宿主细胞的方法，包括化学转染和物理转染。更进一步的试验中我们使用化学转染中的脂质体转染方法。

优选地，步骤(6)中，采用色谱柱对所述的重组蛋白进行纯化。

进一步优选地，采用镍柱进行所述的纯化。

本发明的另一个目的是提供一种采用所述的制备方法制得的重组人PM/Scl100融合蛋白。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的方法能够高效表达、生产重组人PM/Scl100融合蛋白，获得的重组人PM/Scl100融合蛋白的纯度高，收率高。

附图说明

图1为pFastBac HTA human PM/Scl 100重组质粒BamH I和Hind III双酶切鉴定图，其中M为DNA Marker，泳道1为pFastBac HTA human PM/Scl100重组质粒经BamH I和Hind III双酶切条带。

图2为pFastBac HTA human PM/Scl 100重组杆粒PCR鉴定图，其中M为DNAMarker，泳道1为pFastBac HTA human PM/Scl 100重组重组杆粒PCR。

图3为重组人PM/Scl 100融合蛋白的SDS-PAGE图，其中泳道1为实施例五中步骤(3)得到的上清液，泳道2为上样流出液，泳道3为漂洗收集液，泳道4为洗脱收集液，泳道5为Marker。

图4为人PM/Scl 100基因融合的阴性血清和阳性血清Western blot分析，其中泳道M为Marker，泳道1为阳性血清检测纯化后的PM/Scl 100，泳道2为阳性血清检测转染表达前的细胞裂解液；泳道3为阴性血清检测纯化后的PM/Scl 100。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。

实验材料：

1、菌株、细胞和载体：大肠杆菌DH10Bac和JM109感受态细胞、pFastBac HTA和PUC18载体均购自Thermo公司，SF9细胞系购自ATCC。

2、酶与试剂：

2.1、限制性内切酶、10×fastDigest buffer、T4连接酶和5×T4连接酶buffer为Thermo公司产品。

2.2、生化试剂：Grace's Insect Cells Culture Medium购自Thermo公司，Ni-NTAAgarose购自Thermo公司；胎牛血清购自CellMax公司；大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)，凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒PureLink^TMHiPure Plasmid Miniprep Kit、2×Dream Taq Hot Green PCR Buffe、SYBR^TMSafe DNA Gel Stain和II购自Thermo公司。4X Loading buffer、BioRad TGX Stain-Free^TMPRotein Gels、BioRadMolecularGel Doc^TMXR System购自Bio-Rad公司。

实施例一人PM/Scl 100基因人工合成

根据GenBank已公开的人PM/Scl 100kD nucleolar protein的mRNA序列(GenBank序列登录号：X66113.1)，基因全长序列见SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。针对昆虫真核表达系统进行密码子优化，调节GC含量，优化稀有密码子，并且在编码区两段分别添加BamHI和HindIII酶切位点，对应的碱基序列见SEQ ID NO.3。将合成好的基因片段亚克隆至PUC18载体构建PUC18-PM/Scl 100重组质粒。

实施例二带有人PM/Scl 100基因的重组pFastBac HTA的构建

1.使用质粒小量提取试剂盒提取实施例一制得的PUC18-PM/Scl 100重组质粒并进行双酶切：PUC18-PM/Scl 1002μg，BamH I 2μl，Hind III 2μl，10×FastDigest buffer5μl，补充ddH₂O使总反应体积至50.0μl，混匀，12000rpm离心5秒，37℃水浴酶切30min。

2.载体双酶切：pFastBac HTA载体2μg，BamH I 2μl，Hind III 2μl，10×fastDigest buffer 5μl，补充ddH₂O使总反应体积至50.0μl，混匀，12000rpm离心5秒，37℃水浴酶切30min。

3.使用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物：酶切产物加10μl 6×Loading buffer，1.0％琼脂糖凝胶电泳80V电压30min，经凝胶回收试剂盒回收，得到Human PM/Scl 100基因和pFastBac HTA载体的酶切产物。

4.连接反应(20μl体系)：PM/Scl 100基因酶切产物2μl，pFastBac HTA载体的酶切产物2μl，5×T4连接酶buffer 4μl，T4连接酶(3U/μl)1μl，ddH₂O10μl混匀，120000rpm离心5秒，24℃连接3小时。

5.转化大肠杆菌感受态细胞

5.1取出制备好的大肠杆菌JM109感受态细胞，放在冰水上融化。

5.2每100μl感受态细胞加上述连接产物(重组载体pFastBac HTA/human PM/Scl100)10μL、ddH₂O 1μL(阴性对照)，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30min。

5.3将离心管放置42℃水浴，热激90s。

5.4快速将离心管转移至冰浴，放置2min。

5.5每管加500μL LB培养基，在37℃摇床温和摇动(150rpm)温育1h，使细菌复苏。4000rpm离心3min，弃去约500μL上清，重悬细胞。

5.6将连接后转化产物100μL，阴性对照100μL，均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。

5.7倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到转化子。

6转化子的鉴定

6.1挑取3-5个克隆，接种于4ml LB(含100μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃250rpm培养过夜。

6.2取4ml菌液，使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，即获得了重组载体的质粒，并保留菌种。

对所提质粒进行酶切鉴定：质粒1μg，BamH I 1μl，Hind III 1μl，10×fastDigestbuffer 2μl，补充ddH₂O总反应体积至20.0μl，混匀，12000rpm离心5秒，37℃水浴酶切30min。

6.3电泳检测：取10μl质粒酶切产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电压120V跑25min。凝胶于紫外下观察，分析电泳条带。如图1所示，在2600bp处存在一条明显条带，与目的片段2655bp大小一致，证明human PM/Scl 100基因已成功插入载体中，酶切鉴定见图1。

6.4测序鉴定：对酶切鉴定正确的pFastBac HTA/human PM/Scl 100质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，和GenBank已发表的序列进行比对来鉴定重组质粒，重组PM/Scl 100蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.4。

实施例三Bacmid-pFastBac HTA/human PM/Scl 100质粒的构建

1.将测序正确的重组载体pFastBac HTA/human PM/Scl 100转化大肠杆菌DH10bac感受态细胞

1.1取出制备好的大肠杆菌DH10bac感受态细胞，放在冰水上融化。

1.2每100μl感受态细胞加上述连接产物(重组载体pFastBac HTA/human PM/Scl100)1μL、ddH₂O 1μL(阴性对照)，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30min。

1.3将离心管放置42℃水浴，热激45s。

1.4快速将离心管转移至冰浴，放置2min。

1.5每管加500μL LB培养基，在37℃摇床温和摇动(150rpm)温育4h，使细菌复苏。

1.6将上述菌液5μL，阴性对照5μL，1:10、1:100、1:1000倍稀释均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的蓝白斑(40mg/mL IPTG，Bluo-Gal 100μg/mL)LB平板；

2.倒置培养皿，于37℃培养48小时，得到转化子。

3.转化子的鉴定

3.1挑取3-5个白色菌落，接种于2.5ml LB(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素)液体培养基中，37℃250rpm培养过夜。

3.2取2.5ml菌液，使用PureLink^TMHiPure Plasmid Miniprep Kit质粒抽提试剂盒抽提质粒，即获得了重组的Bacmid-pFastBac HTA/human PM/Scl100质粒，即PM/Scl 100重组杆粒。

对所提Bacmid-pFastBac HTA/human PM/Scl 100进行PCR鉴定：

M13-F 5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′(SEQ ID NO.5)

M13-R 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′(SEQ ID NO.6)

质粒2μl，M13引物R/F各1.5μl，2×Dream Taq Hot Green PCR Buffer12.5μl，补充ddH₂O使总反应体积至25.0μl，混匀，12000rpm离心5秒，进行PCR鉴定。94℃预变性3min，经94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min 30个循环，最终72℃延伸7min。

3.3电泳检测：取10μl质粒PCR产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，120V25min。将凝胶放置于紫外观察，分析电泳条带。如图2所示，在5000bp处存在一条明显条带，与目的片段5080bp大小一致，证明Bacmid-pFastBac HTA/human PM/Scl 100质粒构建成功，PCR鉴定见图2。

实施例四人PM/Scl 100杆状病毒的制备

4.1将实施例三制备的PM/Scl 100重组杆粒用无菌的ddH₂O稀释至终浓度为1ug/μL；

4.2将贴壁培养的SF9细胞轻柔吹打悬浮后，进行细胞计数；

4.3取适量的SF9细胞接种至无菌的6孔板中，且确保每孔的细胞数为8×10⁵cells，于27℃培养箱孵育30min；

4.4将100μL Grace’s Insect Cells Culture Medium与1μL PM/Scl 100重组杆粒混匀，室温放置30min得到PM/Scl重组杆粒混合液；

4.5将100μL Grace’s Insect Cells Culture Medium与8μL转染试剂II混匀，室温放置30min得到转染试剂II混合液；

4.6将上述孵育的SF9细胞从培养箱取出，去除培养基，并用Grace’s InsectCells Culture Medium清洗2次，再加入2mL Grace’s Insect Cells Culture Medium，于27℃培养箱孵育20-30min；

4.7将上述的PM/Scl重组杆粒混合液和转染试剂II混合液进行混合，于室温放置15-30min；

4.8将4.7获得的混合液滴加至经4.6处理后的含SF9细胞的6孔板中，于27℃培养箱孵育3-5h；

4.9取出6孔板中的上清，加入2mL新鲜的含有10％FBS的Grace’s Insect CellsCulture Medium，于27℃培养箱孵育72h左右，显微镜下观察细胞状态，待直径逐渐增大，并逐渐脱离贴壁培养时，收集P1代病毒，并转染SF9细胞；

4.10于27℃培养箱孵育3-4d，显微镜下观察细胞状态，待细胞直径逐渐增大，并逐渐脱离贴壁培养状态，收集P2代病毒，并转染SF9细胞；

4.11于27℃培养箱孵育4-5d，待细胞直径逐渐增大，并逐渐脱离贴壁培养状态，收集P3代病毒。

实施例五人PM/Scl 100融合蛋白的纯化

1.取实施例四制备的P3代病毒转染SF9细胞，待细胞直径逐渐增大，并逐渐脱离贴壁培养状态，收集细胞，加入适量的细胞裂解液，并以1:1000比例加入PMSF，且加入cOmplete(EDTA-free)蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上或室温裂解30min；

2.采用超声破碎仪(宁波新芝，JY92IIN)超声波破碎(超声条件：工作5s，间隙10s，输出功率250W，冰浴)超声5min至半透明；

3.10000rpm 4℃离心20min，收集沉淀，将沉淀用30ml含有8M尿素的Bindingbuffer(20mM Tris-HCl，10mM咪唑，pH 8.0)室温搅拌溶解，于冰上超声波破碎至半透明，超声条件：功率325W，超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，然后用Sigma 3K15离心机9500rpm 4℃离心20min。收集上清液进行纯化。

4.将2ml Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，用10倍柱床体积水、5倍柱床体积Binding Buffer先后洗涤树脂，将上清液直接上Ni柱，收集流出液即为上样流出液；

5.用含有8M尿素的Washing Buffer(20mM Tris-HCl，30mM咪唑，pH8.0)洗涤树脂，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平；收集流出液即为漂洗收集液；

6.用含有8M尿素的Eluting Buffer(20mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH 8.0)将His标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集流出液，即为洗脱收集液。重复此步骤，直至流出液的吸光度在平稳280nm基线处。

实施例六人PM/Scl 100融合蛋白的SDS-PAGE和BCA蛋白浓度检测

分别取实施例五步骤3制得的上清液、实施例五步骤4收集的上样流出液、实施例五步骤5收集的漂洗收集液、实施例五步骤6收集的洗脱收集液各30uL与10uL Bio-Rad 4XLoading buffer混匀，于99℃金属浴中放置5min；10000rpm离心30s，取10ul上清用BioRadTGX Stain-Free^TMPRotein Gels进行SDS-PAGE，180V运行30min，用BioRad MolecularGel Doc^TMXR System获取图像，结果见图3。

由图3可知，纯化的表达产物在100KDa偏上处有明显的条带，与预计PM/Scl的分子量大小(105KDa)相符，目的蛋白纯度>90％。

采用Pierce BCA Protein Assay Kit测定纯化后蛋白的浓度，达到0.48mg/ml，1L细胞培养基诱导表达可获得近11.45mg较高纯度的PM/Scl 100融合蛋白。

实施例七人PM/Scl 100融合蛋白的Western Blot分析

取纯化后的10ug PM/Scl 100重组蛋白经SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，分别取人PM/Scl 100阳性抗体血清和阴性抗体血清，室温孵育1h，TBST清洗3次，每次5min，然后用AP偶联的鼠抗人IgG的二抗孵育1h，TBST清洗3次，每次5min，用江苏浩欧博生物医药股份有限公司产BCIP/NBT显色液显影，检测PM/Scl 100融合蛋白的表达。由图4可知，发现重组制备的PM/Scl 100重组蛋白与阳性抗体血清反应出现条带，而阴性血清没有条带，证明PM/Scl 100重组蛋白已在昆虫细胞SF9中成功表达。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏浩欧博生物医药股份有限公司

<120> 一种重组人PM/Scl100融合蛋白及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2655

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

atggcgccac ccagtacccg ggagcccagg gtcctgtcgg cgaccagcgc aaccaaatcc 60

gacggagaga tggtgctgcc aggcttcccg gacgccgaca gctttgtgaa gtttgctctt 120

gggtccgtgg tggcagtcac caaggcatct gggggcctac cacagtttgg cgatgagtat 180

gatttttacc gaagttttcc tggcttccaa gcattttgcg aaacacaggg agacaggttg 240

cttcagtgca tgagcagagt aatgcagtac catgggtgtc gcagcaacat taaggatcga 300

agtaaagtga ctgagctgga agacaagttt gatttactag ttgatgccaa tgatgtaatt 360

ctggagagag tgggtatttt actggatgaa gcctcaggtg taaacaagaa tcaacagcct 420

gtcctccctg ccggcttgca ggtccccaaa acggtagtgt ccagctggaa ccgtaaggca 480

gcagaatatg gcaaaaaagc aaaatctgaa actttccggc tgcttcatgc aaaaaatatc 540

atccgacctc agctcaagtt tcgagagaag attgacaatt ccaacacacc atttcttcct 600

aaaatcttca tcaaacccaa tgctcagaaa cctctccctc aagctctctc taaggaaagg 660

cgggaacgcc cacaggatcg tcctgaggac ttggacgtcc cccctgcact ggctgatttc 720

atccatcagc agagaaccca gcaggttgag caagacatgt ttgcacatcc ttatcaatat 780

gaactaaatc actttacccc agcagatgca gtgcttcaaa agccacaacc ccagttatac 840

agacctatag aagagacacc atgccatttc atatcctccc tggatgaact cgtggaactc 900

aacgaaaagc tcttgaattg tcaggaattt gcagttgact tggagcacca ctcttacagg 960

agcttcctgg gactgacctg cctgatgcaa atttctactc ggacggaaga cttcatcatt 1020

gacaccctcg agcttcgaag tgacatgtac attctcaatg agagcctcac agacccagcc 1080

atcgttaagg tctttcatgg tgctgattca gacatagaat ggctacagaa agactttggg 1140

ttgtatgtag taaacatgtt tgatactcat caggcagcac gccttcttaa cctgggcagg 1200

cactcactcg atcatctcct gaaactctac tgcaacgtgg actcaaacaa gcaatatcag 1260

ctggctgatt ggagaatacg ccctctgccc gaggagatgc tcagctacgc ccgggatgac 1320

acccattacc tgctatatat ctatgacaaa atgaggctgg agatgtggga gcgcggcaac 1380

gggcagcccg tgcagctgca ggtggtgtgg caacggagca gggacatctg cctcaagaaa 1440

ttcatcaaac ctatcttcac ggatgagtcc taccttgaac tctataggaa gcagaagaag 1500

caccttaaca cacagcagtt gacagccttt cagctgctgt ttgcctggag ggataaaaca 1560

gctcgcaggg aagatgaaag ttacggatat gtactgccaa accacatgat gctgaaaata 1620

gctgaagaac tgcctaagga acctcagggc atcatagctt gctgcaaccc agtaccgccc 1680

cttgtgcggc agcagatcaa cgaaatgcac cttttaatcc agcaggcccg agagatgccc 1740

ctgctcaagt ctgaagttgc agccggagtg aagaagagcg gaccgctgcc cagtgctgag 1800

agattggaga atgttctctt tggacctcac gactgctccc atgcccctcc ggatggctat 1860

ccaatcatcc caaccagtgg atctgtgcca gttcagaagc aggcgagcct cttccctgat 1920

gaaaaagaag ataacttgct gggtaccaca tgcctgattg ccacagctgt catcacgtta 1980

tttaatgaac ctagtgctga agacagtaaa aagggtccat tgacagttgc acagaaaaaa 2040

gcccagaaca tcatggagtc ctttgaaaat ccatttagga tgtttctgcc ctcactggga 2100

caccgtgctc ccgtctctca ggcagcgaag ttcgatccat caaccaaaat ctatgaaatc 2160

agcaaccgtt ggaagctggc ccaggtacaa gtacaaaaag actctaaaga agctgtcaag 2220

aagaaggcag ctgagcaaac agctgcccgg gaacaggcaa aggaggcgtg caaagctgca 2280

gcagaacagg ccatctccgt ccgacagcag gtcgtgctag aaaatgctgc aaagaagaga 2340

gagcgagcaa caagcgaccc aaggaccaca gaacagaaac aagagaagaa acgactcaaa 2400

atttccaaga agccaaagga cccagagcca ccagaaaaag agtttacgcc ttacgactac 2460

agccagtcag acttcaaggc ttttgctgga aacagcaaat ccaaagtttc ttctcagttt 2520

gatccaaata aacagacccc gtctggcaag aaatgcattg cagccaaaaa aattaaacag 2580

tcggtgggaa acaaaagcat gtcctttcca actggaaagt cagacagagg cttcaggtac 2640

aactggccac agaga 2655

<210> 2

<211> 885

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Ala Pro Pro Ser Thr Arg Glu Pro Arg Val Leu Ser Ala Thr Ser

1 5 10 15

Ala Thr Lys Ser Asp Gly Glu Met Val Leu Pro Gly Phe Pro Asp Ala

20 25 30

Asp Ser Phe Val Lys Phe Ala Leu Gly Ser Val Val Ala Val Thr Lys

35 40 45

Ala Ser Gly Gly Leu Pro Gln Phe Gly Asp Glu Tyr Asp Phe Tyr Arg

50 55 60

Ser Phe Pro Gly Phe Gln Ala Phe Cys Glu Thr Gln Gly Asp Arg Leu

65 70 75 80

Leu Gln Cys Met Ser Arg Val Met Gln Tyr His Gly Cys Arg Ser Asn

85 90 95

Ile Lys Asp Arg Ser Lys Val Thr Glu Leu Glu Asp Lys Phe Asp Leu

100 105 110

Leu Val Asp Ala Asn Asp Val Ile Leu Glu Arg Val Gly Ile Leu Leu

115 120 125

Asp Glu Ala Ser Gly Val Asn Lys Asn Gln Gln Pro Val Leu Pro Ala

130 135 140

Gly Leu Gln Val Pro Lys Thr Val Val Ser Ser Trp Asn Arg Lys Ala

145 150 155 160

Ala Glu Tyr Gly Lys Lys Ala Lys Ser Glu Thr Phe Arg Leu Leu His

165 170 175

Ala Lys Asn Ile Ile Arg Pro Gln Leu Lys Phe Arg Glu Lys Ile Asp

180 185 190

Asn Ser Asn Thr Pro Phe Leu Pro Lys Ile Phe Ile Lys Pro Asn Ala

195 200 205

Gln Lys Pro Leu Pro Gln Ala Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Arg Pro

210 215 220

Gln Asp Arg Pro Glu Asp Leu Asp Val Pro Pro Ala Leu Ala Asp Phe

225 230 235 240

Ile His Gln Gln Arg Thr Gln Gln Val Glu Gln Asp Met Phe Ala His

245 250 255

Pro Tyr Gln Tyr Glu Leu Asn His Phe Thr Pro Ala Asp Ala Val Leu

260 265 270

Gln Lys Pro Gln Pro Gln Leu Tyr Arg Pro Ile Glu Glu Thr Pro Cys

275 280 285

His Phe Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Val Glu Leu Asn Glu Lys Leu

290 295 300

Leu Asn Cys Gln Glu Phe Ala Val Asp Leu Glu His His Ser Tyr Arg

305 310 315 320

Ser Phe Leu Gly Leu Thr Cys Leu Met Gln Ile Ser Thr Arg Thr Glu

325 330 335

Asp Phe Ile Ile Asp Thr Leu Glu Leu Arg Ser Asp Met Tyr Ile Leu

340 345 350

Asn Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ala Ile Val Lys Val Phe His Gly Ala

355 360 365

Asp Ser Asp Ile Glu Trp Leu Gln Lys Asp Phe Gly Leu Tyr Val Val

370 375 380

Asn Met Phe Asp Thr His Gln Ala Ala Arg Leu Leu Asn Leu Gly Arg

385 390 395 400

His Ser Leu Asp His Leu Leu Lys Leu Tyr Cys Asn Val Asp Ser Asn

405 410 415

Lys Gln Tyr Gln Leu Ala Asp Trp Arg Ile Arg Pro Leu Pro Glu Glu

420 425 430

Met Leu Ser Tyr Ala Arg Asp Asp Thr His Tyr Leu Leu Tyr Ile Tyr

435 440 445

Asp Lys Met Arg Leu Glu Met Trp Glu Arg Gly Asn Gly Gln Pro Val

450 455 460

Gln Leu Gln Val Val Trp Gln Arg Ser Arg Asp Ile Cys Leu Lys Lys

465 470 475 480

Phe Ile Lys Pro Ile Phe Thr Asp Glu Ser Tyr Leu Glu Leu Tyr Arg

485 490 495

Lys Gln Lys Lys His Leu Asn Thr Gln Gln Leu Thr Ala Phe Gln Leu

500 505 510

Leu Phe Ala Trp Arg Asp Lys Thr Ala Arg Arg Glu Asp Glu Ser Tyr

515 520 525

Gly Tyr Val Leu Pro Asn His Met Met Leu Lys Ile Ala Glu Glu Leu

530 535 540

Pro Lys Glu Pro Gln Gly Ile Ile Ala Cys Cys Asn Pro Val Pro Pro

545 550 555 560

Leu Val Arg Gln Gln Ile Asn Glu Met His Leu Leu Ile Gln Gln Ala

565 570 575

Arg Glu Met Pro Leu Leu Lys Ser Glu Val Ala Ala Gly Val Lys Lys

580 585 590

Ser Gly Pro Leu Pro Ser Ala Glu Arg Leu Glu Asn Val Leu Phe Gly

595 600 605

Pro His Asp Cys Ser His Ala Pro Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile Pro

610 615 620

Thr Ser Gly Ser Val Pro Val Gln Lys Gln Ala Ser Leu Phe Pro Asp

625 630 635 640

Glu Lys Glu Asp Asn Leu Leu Gly Thr Thr Cys Leu Ile Ala Thr Ala

645 650 655

Val Ile Thr Leu Phe Asn Glu Pro Ser Ala Glu Asp Ser Lys Lys Gly

660 665 670

Pro Leu Thr Val Ala Gln Lys Lys Ala Gln Asn Ile Met Glu Ser Phe

675 680 685

Glu Asn Pro Phe Arg Met Phe Leu Pro Ser Leu Gly His Arg Ala Pro

690 695 700

Val Ser Gln Ala Ala Lys Phe Asp Pro Ser Thr Lys Ile Tyr Glu Ile

705 710 715 720

Ser Asn Arg Trp Lys Leu Ala Gln Val Gln Val Gln Lys Asp Ser Lys

725 730 735

Glu Ala Val Lys Lys Lys Ala Ala Glu Gln Thr Ala Ala Arg Glu Gln

740 745 750

Ala Lys Glu Ala Cys Lys Ala Ala Ala Glu Gln Ala Ile Ser Val Arg

755 760 765

Gln Gln Val Val Leu Glu Asn Ala Ala Lys Lys Arg Glu Arg Ala Thr

770 775 780

Ser Asp Pro Arg Thr Thr Glu Gln Lys Gln Glu Lys Lys Arg Leu Lys

785 790 795 800

Ile Ser Lys Lys Pro Lys Asp Pro Glu Pro Pro Glu Lys Glu Phe Thr

805 810 815

Pro Tyr Asp Tyr Ser Gln Ser Asp Phe Lys Ala Phe Ala Gly Asn Ser

820 825 830

Lys Ser Lys Val Ser Ser Gln Phe Asp Pro Asn Lys Gln Thr Pro Ser

835 840 845

Gly Lys Lys Cys Ile Ala Ala Lys Lys Ile Lys Gln Ser Val Gly Asn

850 855 860

Lys Ser Met Ser Phe Pro Thr Gly Lys Ser Asp Arg Gly Phe Arg Tyr

865 870 875 880

Asn Trp Pro Gln Arg

885

<210> 3

<211> 2691

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

ggatccgatg gctcccccct ccacccgtga gccccgcgtg ctctccgcta ctagcgctac 60

caagtccgac ggcgagatgg tcctgcctgg ttttcctgac gctgacagct tcgtgaaatt 120

cgctctcggc agcgtcgtgg ccgtcaccaa agccagcggt ggtctccccc agttcggcga 180

cgaatacgac ttctaccgtt ccttccccgg tttccaggct ttctgcgaga cccagggcga 240

ccgtctcctc cagtgcatga gccgcgtgat gcaataccat ggctgccgct ccaacatcaa 300

agaccgcagc aaggtgaccg agctcgaaga caagttcgac ctgctggtgg acgctaatga 360

cgtgatcctg gagcgtgtcg gtatcctcct ggatgaggcc tccggtgtga acaaaaacca 420

gcaacctgtc ctgcctgccg gtctccaagt ccccaagacc gtggtgtcca gctggaaccg 480

taaggccgcc gagtatggta aaaaggctaa gagcgagact ttccgcctcc tgcacgctaa 540

gaacatcatc cgcccccagc tcaaattccg tgagaagatc gacaacagca acaccccctt 600

cctgcctaag atctttatca agcctaatgc ccagaaacct ctcccccagg ctctgagcaa 660

ggagcgccgt gaacgccccc aagatcgtcc tgaggatctc gatgtgcctc ccgccctcgc 720

cgacttcatc catcagcaac gcactcagca agtcgagcag gatatgttcg cccaccctta 780

ccagtacgag ctgaaccatt tcactcctgc cgacgctgtg ctgcaaaaac cccagcccca 840

gctctaccgc cccatcgaag agaccccctg tcactttatc tccagcctcg acgaactcgt 900

ggagctcaac gaaaagctcc tcaactgtca ggagttcgcc gtcgacctgg agcatcacag 960

ctaccgctcc ttcctgggcc tgacctgtct gatgcagatc agcacccgca ccgaggattt 1020

catcattgat actctggagc tgcgctccga tatgtacatc ctcaatgaaa gcctcaccga 1080

ccccgccatc gtgaaggtgt tccatggcgc cgatagcgac attgagtggc tgcaaaagga 1140

tttcggcctc tacgtcgtca acatgttcga cacccaccag gctgcccgtc tgctgaacct 1200

cggccgtcac agcctggacc acctgctgaa gctctattgc aacgtggact ccaacaagca 1260

gtatcagctg gctgactggc gtattcgtcc tctccccgag gaaatgctgt cctacgctcg 1320

tgacgacacc cactatctcc tgtacatcta cgacaagatg cgtctggaaa tgtgggaacg 1380

cggcaacggc caacctgtgc agctccaagt ggtctggcag cgcagccgtg atatctgcct 1440

caagaagttt atcaagccca tcttcactga cgaatcctac ctggagctgt atcgcaagca 1500

gaaaaaacac ctgaacaccc aacaactgac tgctttccag ctgctgttcg cctggcgcga 1560

taagactgct cgccgcgaag atgaatccta tggctacgtc ctccccaacc atatgatgct 1620

gaagatcgct gaggagctcc ccaaggagcc tcagggcatt atcgcttgct gcaatcctgt 1680

gccccccctc gtccgccagc agattaacga aatgcacctg ctgattcagc aagctcgcga 1740

gatgcccctg ctcaaaagcg aggtggctgc cggcgtgaaa aagtccggtc ctctcccctc 1800

cgctgaacgt ctcgagaacg tgctcttcgg tcctcacgat tgttcccatg ctcctcccga 1860

cggctacccc atcatcccta ctagcggcag cgtgcctgtc cagaagcagg cttccctgtt 1920

ccccgacgag aaggaagaca acctcctggg caccacctgc ctgatcgcta ctgccgtcat 1980

caccctgttc aatgagcctt ccgccgagga ttccaaaaag ggtcccctga ctgtggccca 2040

gaagaaggct cagaacatca tggaatcctt tgagaatccc ttccgcatgt tcctccctag 2100

cctgggccat cgcgctcctg tgtcccaggc tgctaaattc gaccccagca ccaagatcta 2160

cgagatttcc aaccgctgga agctcgctca agtgcaggtc cagaaggaca gcaaggaggc 2220

tgtcaagaag aaagccgccg agcaaaccgc tgctcgcgaa caggccaaag aggcttgcaa 2280

ggccgccgct gaacaagcca tctccgtccg ccaacaagtc gtgctcgaga acgccgctaa 2340

gaagcgcgaa cgtgctacta gcgatccccg caccactgag caaaagcagg aaaagaagcg 2400

cctgaagatc tccaagaagc ccaaagaccc tgagcccccc gaaaaagaat tcactcccta 2460

tgactattcc cagagcgact ttaaggcttt cgccggcaat agcaagagca aggtcagctc 2520

ccagttcgac cctaacaaac agactccttc cggtaagaaa tgtatcgccg ccaagaaaat 2580

caagcagagc gtcggcaata agtccatgtc cttccccacc ggcaagtccg accgtggttt 2640

tcgttacaac tggccccaac gtcaccatca ccatcatcat taaccaagct t 2691

<210> 4

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr

1 5 10 15

Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Ala Pro Pro

20 25 30

Ser Thr Arg Glu Pro Arg Val Leu Ser Ala Thr Ser Ala Thr Lys Ser

35 40 45

Asp Gly Glu Met Val Leu Pro Gly Phe Pro Asp Ala Asp Ser Phe Val

50 55 60

Lys Phe Ala Leu Gly Ser Val Val Ala Val Thr Lys Ala Ser Gly Gly

65 70 75 80

Leu Pro Gln Phe Gly Asp Glu Tyr Asp Phe Tyr Arg Ser Phe Pro Gly

85 90 95

Phe Gln Ala Phe Cys Glu Thr Gln Gly Asp Arg Leu Leu Gln Cys Met

100 105 110

Ser Arg Val Met Gln Tyr His Gly Cys Arg Ser Asn Ile Lys Asp Arg

115 120 125

Ser Lys Val Thr Glu Leu Glu Asp Lys Phe Asp Leu Leu Val Asp Ala

130 135 140

Asn Asp Val Ile Leu Glu Arg Val Gly Ile Leu Leu Asp Glu Ala Ser

145 150 155 160

Gly Val Asn Lys Asn Gln Gln Pro Val Leu Pro Ala Gly Leu Gln Val

165 170 175

Pro Lys Thr Val Val Ser Ser Trp Asn Arg Lys Ala Ala Glu Tyr Gly

180 185 190

Lys Lys Ala Lys Ser Glu Thr Phe Arg Leu Leu His Ala Lys Asn Ile

195 200 205

Ile Arg Pro Gln Leu Lys Phe Arg Glu Lys Ile Asp Asn Ser Asn Thr

210 215 220

Pro Phe Leu Pro Lys Ile Phe Ile Lys Pro Asn Ala Gln Lys Pro Leu

225 230 235 240

Pro Gln Ala Leu Ser Lys Glu Arg Arg Glu Arg Pro Gln Asp Arg Pro

245 250 255

Glu Asp Leu Asp Val Pro Pro Ala Leu Ala Asp Phe Ile His Gln Gln

260 265 270

Arg Thr Gln Gln Val Glu Gln Asp Met Phe Ala His Pro Tyr Gln Tyr

275 280 285

Glu Leu Asn His Phe Thr Pro Ala Asp Ala Val Leu Gln Lys Pro Gln

290 295 300

Pro Gln Leu Tyr Arg Pro Ile Glu Glu Thr Pro Cys His Phe Ile Ser

305 310 315 320

Ser Leu Asp Glu Leu Val Glu Leu Asn Glu Lys Leu Leu Asn Cys Gln

325 330 335

Glu Phe Ala Val Asp Leu Glu His His Ser Tyr Arg Ser Phe Leu Gly

340 345 350

Leu Thr Cys Leu Met Gln Ile Ser Thr Arg Thr Glu Asp Phe Ile Ile

355 360 365

Asp Thr Leu Glu Leu Arg Ser Asp Met Tyr Ile Leu Asn Glu Ser Leu

370 375 380

Thr Asp Pro Ala Ile Val Lys Val Phe His Gly Ala Asp Ser Asp Ile

385 390 395 400

Glu Trp Leu Gln Lys Asp Phe Gly Leu Tyr Val Val Asn Met Phe Asp

405 410 415

Thr His Gln Ala Ala Arg Leu Leu Asn Leu Gly Arg His Ser Leu Asp

420 425 430

His Leu Leu Lys Leu Tyr Cys Asn Val Asp Ser Asn Lys Gln Tyr Gln

435 440 445

Leu Ala Asp Trp Arg Ile Arg Pro Leu Pro Glu Glu Met Leu Ser Tyr

450 455 460

Ala Arg Asp Asp Thr His Tyr Leu Leu Tyr Ile Tyr Asp Lys Met Arg

465 470 475 480

Leu Glu Met Trp Glu Arg Gly Asn Gly Gln Pro Val Gln Leu Gln Val

485 490 495

Val Trp Gln Arg Ser Arg Asp Ile Cys Leu Lys Lys Phe Ile Lys Pro

500 505 510

Ile Phe Thr Asp Glu Ser Tyr Leu Glu Leu Tyr Arg Lys Gln Lys Lys

515 520 525

His Leu Asn Thr Gln Gln Leu Thr Ala Phe Gln Leu Leu Phe Ala Trp

530 535 540

Arg Asp Lys Thr Ala Arg Arg Glu Asp Glu Ser Tyr Gly Tyr Val Leu

545 550 555 560

Pro Asn His Met Met Leu Lys Ile Ala Glu Glu Leu Pro Lys Glu Pro

565 570 575

Gln Gly Ile Ile Ala Cys Cys Asn Pro Val Pro Pro Leu Val Arg Gln

580 585 590

Gln Ile Asn Glu Met His Leu Leu Ile Gln Gln Ala Arg Glu Met Pro

595 600 605

Leu Leu Lys Ser Glu Val Ala Ala Gly Val Lys Lys Ser Gly Pro Leu

610 615 620

Pro Ser Ala Glu Arg Leu Glu Asn Val Leu Phe Gly Pro His Asp Cys

625 630 635 640

Ser His Ala Pro Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile Pro Thr Ser Gly Ser

645 650 655

Val Pro Val Gln Lys Gln Ala Ser Leu Phe Pro Asp Glu Lys Glu Asp

660 665 670

Asn Leu Leu Gly Thr Thr Cys Leu Ile Ala Thr Ala Val Ile Thr Leu

675 680 685

Phe Asn Glu Pro Ser Ala Glu Asp Ser Lys Lys Gly Pro Leu Thr Val

690 695 700

Ala Gln Lys Lys Ala Gln Asn Ile Met Glu Ser Phe Glu Asn Pro Phe

705 710 715 720

Arg Met Phe Leu Pro Ser Leu Gly His Arg Ala Pro Val Ser Gln Ala

725 730 735

Ala Lys Phe Asp Pro Ser Thr Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Arg Trp

740 745 750

Lys Leu Ala Gln Val Gln Val Gln Lys Asp Ser Lys Glu Ala Val Lys

755 760 765

Lys Lys Ala Ala Glu Gln Thr Ala Ala Arg Glu Gln Ala Lys Glu Ala

770 775 780

Cys Lys Ala Ala Ala Glu Gln Ala Ile Ser Val Arg Gln Gln Val Val

785 790 795 800

Leu Glu Asn Ala Ala Lys Lys Arg Glu Arg Ala Thr Ser Asp Pro Arg

805 810 815

Thr Thr Glu Gln Lys Gln Glu Lys Lys Arg Leu Lys Ile Ser Lys Lys

820 825 830

Pro Lys Asp Pro Glu Pro Pro Glu Lys Glu Phe Thr Pro Tyr Asp Tyr

835 840 845

Ser Gln Ser Asp Phe Lys Ala Phe Ala Gly Asn Ser Lys Ser Lys Val

850 855 860

Ser Ser Gln Phe Asp Pro Asn Lys Gln Thr Pro Ser Gly Lys Lys Cys

865 870 875 880

Ile Ala Ala Lys Lys Ile Lys Gln Ser Val Gly Asn Lys Ser Met Ser

885 890 895

Phe Pro Thr Gly Lys Ser Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Asn Trp Pro Gln

900 905 910

Arg His His His His His His

915

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

agcggataac aatttcacac agg 23

Claims

1.一种重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）合成人PM/Scl100基因并在两端添加酶切位点后，亚克隆至克隆载体构建重组质粒；

（2）将步骤（1）获得的重组质粒经限制性内切酶消化后，在T4连接酶的作用下，与经过相同限制性内切酶消化后的真核表达载体连接，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组载体；

（3）将步骤（2）获得的重组载体转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒；

（4）将步骤（3）获得的重组杆粒转染进入SF9细胞制得杆状病毒；

（5）将步骤（4）获得的杆状病毒转染进入SF9细胞获得重组蛋白；

（6）对步骤（5）获得的重组蛋白进行纯化获得所述的重组人PM/Scl100融合蛋白。

2. 根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的合成人PM/Scl100基因的方法为：根据人PM/Scl 100 kD nucleolar protein的mRNA序列合成基因序列，然后根据昆虫真核表达系统进行密码子优化，调节GC含量，优化稀有密码子。

3. 根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的酶切位点为BamH I酶切位点和Hind III酶切位点。

4. 根据权利要求1至3中任一项所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，添加有酶切位点后的基因序列为与SEQ ID NO.3至少具有80%以上同源性的基因序列。

5.根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中的克隆载体为PUC18载体。

6. 根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中的限制性内切酶为BamH I和Hind III。

7. 根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中的真核表达载体为pFastBac HTA载体。

8.根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）中的杆状病毒由所述的重组杆粒转染进入SF9细胞获得病毒后，再进行多次转染进入SF9细胞进行传代培养获得。

9.根据权利要求1所述的重组人PM/Scl100融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，采用色谱柱对所述的重组蛋白进行纯化。

10.一种采用权利要求1至9中任一项所述的制备方法制得的重组人PM/Scl100融合蛋白。