CN105823873A - 检测自身免疫性肾病的免疫印迹试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测自身免疫性肾病相关抗体的免疫印迹试剂盒及其制备方法，属于生物医学领域；包括：反应膜条、酶结合物、显色底物、洗涤液、样本稀释液和终止液，所述的反应膜条由载体和固定在载体上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有：分别由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中4～8种天然或重组抗原包被而成特定组合的平行的检测线，1条高浓度为30~50μL/mL判断指示带，1条中浓度15~25μL/mL判断指示带，1条低浓度1~10μL/mL判断指示带；本发明克服单一自身抗体检测灵敏度和特异性不足、数种疾病相关自身抗体逐一单独检测在操作上的繁琐，大大提高检测效率和结果判断的准确度。

Description

检测自身免疫性肾病的免疫印迹试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测多种自身免疫性肾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，还涉及该免疫印迹试剂盒的制备方法及使用方法，属于生物医学领域。
背景技术
人体免疫系统的主要功能是识别和清除抗原性异物。正常情况下，机体对自身组织成分一般不会产生免疫应答，称为免疫耐受。一旦这种耐受被打破，就会发生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病突出表现为血清中多种自身抗体的形成及全身多脏器损伤，肾脏是最常见、最重要的受累器官之一。在各种自身免疫性肾病中，部分自身抗体既是某类疾病的标志性抗体，同时也可能是直接的致病性抗体，与病情活动及预后密切相关。
免疫性肾炎由各种病因引起的原发于肾脏的慢性肾小球疾病。又称为原发性免疫性肾炎与继发性者相区别。临床上将由全身性疾病如糖尿病、系统性红斑狼疮、痛风等引起的继发性慢性肾脏损害，按其原发病命名，如糖尿病肾病、狼疮性肾炎等。由于这些病例的诊断和治疗主要依据全身性疾病(如糖尿病等)，与原发性者有很大区别。在中国免疫性肾炎的发病率仍很高，1981年人群发生率为0.28～0.89%，是引起慢性肾功能衰竭的最重要病因之一（占60%）。不同病因引起的免疫性肾炎在症状上相似，治疗上有共同之处，但预后从轻到重各不相同。本病主要是通过免疫性反应造成的肾损伤，不同的病因可以有相同的肾损害。临床表现有不同程度的蛋白尿、血尿、管型尿、水肿、高血压及不同程度的肾功能损害。起病可急可缓，但多数病例不是从急性肾炎演变而来。因此，对免疫性肾炎的理解，应为潜在病理改变的持续性或进行性发展，使病情迁延，成为慢性，而不单纯是急性肾炎的慢性阶段。早期诊断有助于自身免疫性疾病的临床控制。
许多自身抗体在相关疾病的发病前一段时间就可从血清中检测到。几十年来，免疫学研究已发现多数自身免疫性肾病患者血清中存在着特异性自身抗体，例如狼疮性肾炎（LN）的抗C1q抗体、抗核小体（Nucleosome）抗体和抗双链DNA（dsDNA）抗体，原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）的抗髓过氧化物酶（MPO）抗体，由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发肾炎的抗蛋白酶3抗体（PR3），抗肾小球基底膜型肾小球肾炎的抗肾小球基底膜抗体（GBM），膜性肾病（MN）的抗磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体和成人特发性膜性肾病的1型血小板反应蛋白7A（THSD7A）抗体，许多特异性自身抗体是自身免疫性肾病诊断标准中重要的组成部分。
C1q分子分为头状区和胶原区：头状区可与IgG的CH2结构域结合；胶原样区有6个结合C1r和C1s的位点。
抗C1q抗体与狼疮性肾炎的发生、发展密切相关，并可以预测狼疮性肾炎病情的复发，动物实验表明，C1q和抗C1q抗体组成的免疫复合物可以沉积在肾脏，并引起补体激活、白细胞浸润、炎症损伤和蛋白尿；体外实验表明活动性狼疮肾炎患者血清患者的血清引起正常人淋巴细胞凋亡明显高于非活性狼疮肾炎患者和正常人，且凋亡的细胞比例与抗C1q抗体滴度密切相关。在狼疮肾（lupusnephritis，IN）患者中，存在着抗C1q抗体的高表达，抗C1q抗体在lN疾病中起较为重要作用。抗C1q抗体是反映系统性红斑狼疮（systemlupuserythematosus，SLE）患者并发肾脏损伤的重要指标，在IN诊断和判定其活动性方面有重要作用，与SLE的发生发展密切相关，能较好的反映SLE病情的活动性
核小体是染色质的基本单位，每个核小体由组蛋白八聚体和DNA构成。凋亡细胞是核小体的重要来源，SLE中细胞凋亡增多，导致核小体的过渡释放。由于核小体与其他狼疮自身抗原聚集在凋亡小体内，由此推测SLE循环中持续存在的凋亡细胞触发了自身抗体的产生。相同个体中抗组蛋白抗体与抗dsDNA抗体伴随出现，说明这两种自身抗体有相同的靶抗原，即由dsDNA和组蛋白构成的核小体诱导产生。狼疮病血清特异性的研究证明核小体是狼疮抗dsDNA抗体和抗组蛋白抗体的首要专一的靶抗原。
抗核小体抗体家族在临床上只出现于SLE、硬皮病和混合性结缔组织病。高水平的抗核小体IgG抗体几乎是仅在SLE中出现。目前临床实验室诊断SLE的标志性抗体为抗dsDNA抗体，这两种抗体诊断SLE的特异性高，但敏感性差，SLE患者中抗dsDNA抗体阳性率为30%～90%，特异性为90%；抗核小体抗体阳性率为58%～66%，特异性为98%。
抗dsDNA是SLE患者的特征性抗体，抗体的滴度与疾病的活动程度有相关性。抗核小体抗体可出现在SLE活动期或非活动期，抗dsDNA抗体阴性的SLE患者抗核小体抗体是一个敏感的指标。抗核小体抗体效价与疾病活动性有密切关系，在SLE的诊断和疾病监测中有重要意义。
抗蛋白酶3（PR3）抗体属于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）中的一种，是cANCA的主要靶抗原，在间接免疫荧光法检测用乙醇固定的中性粒细胞呈cANCA荧光模式，ANCA是鉴别诊断血管炎的重要标记物。抗PR3抗体是韦格拉肉芽肿病（WG）的特异性抗体。尽管其发病机制不清，但是抗PR3抗体与韦格拉肉芽肿病发病机制具有一定的相关性。
cANCA诊断WG的特异性为90%，活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时cANCA敏感性是65%，当患者出现呼吸系统、肾脏损害时其灵敏度达90%以上。
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）又称过氧化物酶，是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志，随着对MPO研究的深入，人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。
抗髓过氧化酶抗体（myeloperoxidase~antineutrophilcy~toplasmicantibody，MPO~ANCA）是抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（antineutrophilcytopasmicantibodyassociatedvasculitis，AAV）的主要自身抗体之一，是我国AAV患者血清中的最主要自身抗体。临床研究报道，MPO~ANCA阳性母亲可通过胎盘传递自身抗体，导致新生儿出现MPO~ANCA相关性血管炎（MPO~ANCAassociatedvasculitis，MPO~AAV）的临床表现肾小球肾炎和肺出血。
抗MPO抗体主要见于原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、显微镜下多动脉炎（MPA）和变应性肉芽肿血管炎（CSS），还见于结节性多动脉炎（PAN）、系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、干燥综合性（SS）和系统性硬化病（SSc）等疾病。MPO~ANCA抗体的浓度与病情的活动性相关，可用于早期诊断、判断疗效、估计复发和指导临床治疗。
肾小球基底膜是由肾小球毛细血管内外透明层及中间致密层构成的网状结构，以糖蛋白为主体。抗GBM抗体就是血清中会“攻击”基底膜的一种抗体。
抗肾小球基底膜（GBM）抗体相关疾病是一组自身免疫性疾病，该病的致病因素为血清存在抗GBM抗体。由于肺和肾小球的基底膜具有共同的抗原，因此主要的受累脏器是肺和肾脏。肾脏受累多为新月体性肾炎，肾功能损害进展迅速，少数为轻度系膜增生性肾炎，可保持肾功能正常。
抗GBM抗体阳性病人占自身免疫性肾炎的5%，在肾小球性肾炎、抗肾小球基底膜（GBM）抗体相关疾病中有80%的阳性检出率，半月体形成性肾小球肾炎患者中有20%～70%的阳性检出率，也可在增殖性肾炎中检出。
膜性肾病（membranousnephropathy，MN）是成人肾病综合征的主要病因之一。约三分之一的MN病人出现肾功能逐渐下降，并最后发展到终末期肾病。MN病因明确者为继发性膜性肾病（Secendarymembranousnephropathy，SMN），病因未明者称特发性膜性肾病（Idiotpathicmembranousnephropathy，IMN）。国外报道IMN占原发性肾病综合征的30%~40%。迄今为止，MN诊断与鉴别诊断的金指标仍是病理组织学，IMN往往有一些组织病理学上的特点，可与SMN相鉴别，但有时即使是从肾脏病理组织学也很难将二者完全区别，从而导致误诊及延误治疗。
特发性膜性肾病（IMN）是导致成人肾病综合征（NS）的常见原因。2009年，人们发现磷脂酶A2的1型受体（PLA2R1）是参与成人IMN致病主要抗体，70%IMN患者体内具有针对PLA2R1的循环抗体。如今有部分学者认为IMN是一种自身免疫性疾病。其余30%IMN的患者中可能存在其它导致疾病的内源性肾小球抗原，经最新发现部分IMN患者的血清中存在针对1型血小板反应蛋白7A域（THSD7A）而非PLA2R1的循环抗体，并且证实THSD7A是参与成人IMN发病的第二个抗原。以及针对THSD7A而非PLA2R1的循环抗体。结果提示THSD7A是参与成人IMN发病的第二个抗原，抗THSD7A抗体阳性的患者代表了明显不同的一个IMN患者亚组。这将有助于我们进一步理解MN的发病机制，并进一步将IMN从继发性MN中区别出来。
狼疮性肾炎、原发性坏死性新月体肾小球肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎、膜性肾病等是常见的自身免疫性肾病，其临床表现的特点往往被患者忽视，因此需要定期筛查。本发明的自身免疫性肾脏病免疫印迹检测试剂盒可针对多种肾病抗体进行同时检测，从而使得我们该类患者的病况有了更快速、直观、准确、全面的判断，利于对患者进行及时的诊断和正确的治疗。
发明内容
本发明的目的在于针对目前缺乏多种免疫性肾病实验检查乃至体格检查专用的免疫印迹法产品，以及现有的免疫印迹试剂存在的一些，采用8种抗原中的4～8种抗原物质，组合用于对肾病的筛查、鉴别诊断、预后判断、疗效评估，使之有了更明确具体的客观实验指标，从而提出的一种检测自身免疫性肾病的免疫印迹试剂盒及其制备方法，检测自身免疫性肾病抗体的免疫印迹试剂盒，包括：反应膜条、酶结合物、显色底物、洗涤液、样本稀释液和终止液，其特征在于：所述的反应膜条由载体和固定在载体上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有：分别由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中4～8种天然或重组抗原包被而成特定组合的平行的检测线，1条高浓度为30~50μL/mL判断指示带，1条中浓度15~25μL/mL判断指示带，1条低浓度1~10μL/mL判断指示带。
进一步的，所述的载体为双面粘性的PVC板，正面与所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底衬板。
进一步的，所述的高浓度判断指示带、中浓度判断指示带、低浓度判断指示带由人IgG，或抗鼠IgG或羊IgG划线而成。
进一步的，所述的酶免结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG；所述的显色底物为四甲基联苯胺；所述的洗涤液为20×Tris缓冲液；所述样本稀释液为含封闭剂的Tris缓冲液；所述的终止液为0.1M/L硫酸。
进一步的，在同一硝酸纤维素膜或尼龙膜上，同时包被C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中的至少4天然或重组抗原，分别包被形成的4～8条平行的检测线，可同时、快捷的、准确的对狼疮性肾炎（LN），原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN），抗肾小球基底膜型肾小球肾炎，膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病等多种肾病进行检测筛查。
试剂盒的制备方法，包括有反应膜条制备方法有两种，包括贴膜法和划线法，其特征在于所述反应膜条制备方法包括以下步骤：
（1）贴膜法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）包被抗原：根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）贴膜：将干燥好的NC膜平整贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；
5）切膜：将4）中贴好的膜片按照独立检测线切成一定宽度的条带；
6）组装：通过模具，将5）中的条带按次序贴于透明的PET底衬板上；
7）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
（2）划线法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和dsDNA抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）固定抗原：使用免疫印迹点样器在一整张的硝酸纤维膜或尼龙膜上，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
进一步的，在2）步完成点样后，将膜片从免疫印迹点样器取出室温下放置1小时。
进一步的，固定抗原和质控的点样量控制在10ng~30ng。
进一步的，判断指示带的宽度均为7mm，抗原条带的宽度均为5mm。
本发明的有益效果为：本发明通过一份临床样本和一次检测反应检测多种自身抗体，克服单一自身抗体检测灵敏度和特异性不足、数种疾病相关自身抗体逐一单独检测在操作上的繁琐，大大提高检测效率和结果判断的准确度。涉及的自身免疫性肾病包括狼疮性肾炎、原发性坏死性新月体肾小球肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎、膜性肾病。另外还有：
反应膜条上包被的抗原为从动物组织中提取的天然抗原或采用昆虫细胞或杆状病毒真核表达的方式获得的重组蛋白，提高了自身免疫性疾病诊断的敏感性和特异性；
抗原包被采用全自动点样仪，保证膜条上判断指示带及各抗原带位置的准确性，且可根据检查需求进行合理排序，区别于传统的SDS~PAGE技术按分子量大小将抗原依次分开转移至印迹膜上，同时保证了抗原决定簇构象的完整性；
单人份膜条上同时包被有8种抗原，可实现一份临床样本一次实验最多同时检测8中抗体，为多种自身抗体免疫性肾病的临床诊断提供血清学依据；
具有高浓度判断指示带、中浓度判断指示带和低浓度判断指示带，使结果判断更为直观准确，为自身免疫性肾病的病程检测及治疗后提供全面指导。
附图说明
图1为本发明所述的试剂盒中反应膜条上抗原及判断指示带分布示意图；
图2为本发明所述的试剂盒中反应膜条的PVC板、硝酸纤维素膜或尼龙膜和PET底衬板的组合结构图；
图3为本发明实施例1所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图4为本发明实施例2所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图5为本发明实施例3所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图6为本发明实施例4所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图7为本发明实施例5所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图8为本发明实施例6所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图9为本发明实施例7所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图10为本发明实施例8所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图11为本发明实施例9所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图12为本发明实施例10所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图13为本发明实施例11所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图14为本发明实施例12所述的试剂盒中反应膜条上抗原组合示意图；
图15为本发明实施例13所述的试剂盒中反应膜条制备划线法中其中一种组合示意图。
具体实施方式
以下结合附图和优选的具体实施例详细说明：本发明公开了一种检测多种自身免疫性肾病相关抗体的免疫印迹试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，通过适当改进工艺参数而实现。特别需要指出的是，所有类似的的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明所要求保护的技术方案之内。本发明的产品及应用已经通过较佳实施实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更组合，来实现和应用本发明技术，检测自身免疫性肾病抗体的免疫印迹试剂盒，包括：反应膜条、酶结合物、显色底物、洗涤液、样本稀释液和终止液，其特征在于：所述的反应膜条由载体和固定在载体上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有：分别由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中4～8种天然或重组抗原包被而成特定组合的平行的检测线，1条高浓度为30~50μL/mL判断指示带，1条中浓度15~25μL/mL判断指示带，1条低浓度1~10μL/mL判断指示带。
进一步的，所述的载体为双面粘性的PVC板，正面与所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底衬板。
进一步的，所述的高浓度判断指示带、中浓度判断指示带、低浓度判断指示带由人IgG，或抗鼠IgG或羊IgG划线而成。
进一步的，所述的酶免结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG；所述的显色底物为四甲基联苯胺；所述的洗涤液为20×Tris缓冲液；所述样本稀释液为含封闭剂的Tris缓冲液；所述的终止液为0.1M/L硫酸。
进一步的，在同一硝酸纤维素膜或尼龙膜上，同时包被C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中的至少4天然或重组抗原，分别包被形成的4～8条平行的检测线，可同时、快捷的、准确的对狼疮性肾炎（LN），原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN），抗肾小球基底膜型肾小球肾炎，膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病等多种肾病进行检测筛查。
所述试剂盒的制备方法，包括有反应膜条制备方法有两种，包括贴膜法和划线法，其特征在于所述反应膜条制备方法包括以下步骤：
（1）贴膜法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）包被抗原：根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）贴膜：将干燥好的NC膜平整贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；
5）切膜：将4）中贴好的膜片按照独立检测线切成一定宽度的条带；
6）组装：通过模具，将5）中的条带按次序贴于透明的PET底衬板上；
7）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
（2）划线法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和dsDNA抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）固定抗原：使用免疫印迹点样器在一整张的硝酸纤维膜或尼龙膜上，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
进一步的，在2）步完成点样后，将膜片从免疫印迹点样器取出室温下放置1小时。
进一步的，固定抗原和质控的点样量控制在10ng~30ng。
进一步的，判断指示带的宽度均为7mm，抗原条带的宽度均为5mm。
所述贴膜法，参照图1、图2中所示，所述反应膜条的载体为双面粘性的PVC板13，正面与形成检测线和判断指示带之后的所述硝酸纤维素或尼龙膜14固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底衬板12。所述的高浓度判断指示带、中浓度判断指示带和低浓度判断指示带由人IgG，或鼠IgG或抗羊IgG划线而成。所述的酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG；所述的显色底物为四甲基联苯胺；所述的洗涤液为20×Tirs缓冲液；所述样本稀释液为含封闭剂的Tirs缓冲液；所述的终止液为0.1M/L硫酸。所述划线法中的反应膜条直接使用硝酸纤维素或尼龙膜14为抗原载体。
为是本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R、THSD7A、Nuclesome和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎、韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例2
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R、THSD7A和Nuclesome抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎、膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例3
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R、THSD7A和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎、膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例4
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R、Nuclesome和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、抗核小体（Nucleosome）抗体，原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN），由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎，抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和膜性肾病（MN）的检测。
实施例5
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R、Nuclesome和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例6
将C1q、MPO、PR3、GBM、PLA2R和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和膜性肾病（MN）的检测。
实施例7
将C1q、MPO、PR3、GBM、THSD7A和Nuclesome抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例8
将C1q、MPO、PR3、GBM和THSD7A抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）、诱发肾炎抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和成人特发性膜性肾病的检测。
实施例9
将C1q、MPO、PR3、GBM和PLA2R抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎、抗肾小球基底膜型肾小球肾炎和膜性肾病（MN）的检测。
实施例10
将C1q、MPO、PR3、GBM和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎，抗肾小球基底膜型肾小球肾炎的检测。
实施例11
将C1q、MPO、PR3、GBM和dsDNA抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎，抗肾小球基底膜型肾小球肾炎的检测。
实施例12
将C1q、MPO、PR3和GBM抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将上述配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带。将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照独立检测线切成一定宽度条带，其中判断指示带的宽度为7mm，抗原条带宽度为5mm。通过模具将切好的各条带按次序粘贴于透明的PET底衬板上，再用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。本实施例制备的膜条可适用于狼疮性肾炎（LN）、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）、由韦格拉肉芽肿病（WG）诱发的肾炎，抗肾小球基底膜型肾小球肾炎的检测。
实施例13
将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A抗原按照0.05~0.1mg/mL的浓度，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控按照浓度范围为30~50μg/mL的高浓度指示带、浓度范围为12~25μg/mL的中浓度指示带、浓度范围为1~10μg/mL的低浓度指示带配制成相应的包被浓度待用。将配备好的点样液通过免疫印迹点样器在一整张硝酸纤维素膜上按照指定的排列依次划线，将包被好的膜片放入37℃恒温烘箱中干燥2小时后取出，使用滚切机将其切成宽度为2mm的单人份反应膜条。
膜条上包被抗原的组合方式如下表所示：
本发明试剂盒的使用方法
样本要求：样本为人血清。使用新鲜样本或于~20℃冻存样本，冻存样本只能复溶一次，勿使用热灭活的样本。避免使用严重脂血、黄疸、溶血及污染的样本。。
1、洗涤液配制：用19份蒸馏水稀释1份20×的浓缩洗涤液，混匀，备用。
2、检测步骤
1）将检测膜条放入孵育盘中，有编码的一面朝上。
2）用1mL孵育缓冲液润湿检测膜条，1分钟后移弃缓冲液。
3）加入1mL已稀释的样本，室温孵育30分钟（置摇床轻摇）。
4）移弃已稀释的样本，不留残液。
5）用1.5mL洗涤液洗涤检测膜条，轻摇，每次5分钟，洗涤完后弃除洗涤液，重复3次。
6）加入1mL酶联物溶液，室温孵育30分钟（置摇床轻摇）。
7）移弃酶联物溶液。
8）重复步骤5。
9）加入1mLTMB底物溶液，室温避光孵育10分钟（置摇床轻摇）。
10）移弃底物溶液。
11）用1.5mL蒸馏水洗涤，同时轻摇，1分钟后移弃蒸馏水。
12）加入1mL终止液，室温孵育5分钟。
13）移弃终止液。
14）用滤纸吸干检测膜条上残留的液体。
3、结果判断
完成后，可采用目测、手工黏贴到扫描仪扫描固定卡然后借助特定的判读软件或使用全自动的判读分析仪器对检测结果进行判读，结果可判断为阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性或输出为量化的数值。

Claims (9)

1.检测自身免疫性肾病抗体的免疫印迹试剂盒，包括：反应膜条、酶结合物、显色底物、洗涤液、样本稀释液和终止液，其特征在于：所述的反应膜条由载体和固定在载体上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有：分别由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中4～8种天然或重组抗原包被而成特定组合的平行的检测线，1条高浓度为30~50μL/mL判断指示带，1条中浓度15~25μL/mL判断指示带，1条低浓度1~10μL/mL判断指示带。
2.根据专利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的载体为双面粘性的PVC板，正面与所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底衬板。
3.根据专利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的高浓度判断指示带、中浓度判断指示带、低浓度判断指示带由人IgG，或抗鼠IgG或羊IgG划线而成。
4.根据专利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶免结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG；所述的显色底物为四甲基联苯胺；所述的洗涤液为20×Tris缓冲液；所述样本稀释液为含封闭剂的Tris缓冲液；所述的终止液为0.1M/L硫酸。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：在同一硝酸纤维素膜或尼龙膜上，同时包被C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八种抗原中的至少4天然或重组抗原，分别包被形成的4～8条平行的检测线，可同时、快捷的、准确的对狼疮性肾炎（LN），原发性坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN），抗肾小球基底膜型肾小球肾炎，膜性肾病（MN）和成人特发性膜性肾病等多种肾病进行检测筛查。
6.权利要求1～5任一项所述试剂盒的制备方法，包括有反应膜条制备方法有两种，包括贴膜法和划线法，其特征在于所述反应膜条制备方法包括以下步骤：
（1）贴膜法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）包被抗原：根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜栽成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）贴膜：将干燥好的NC膜平整贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；
5）切膜：将4）中贴好的膜片按照独立检测线切成一定宽度的条带；
6）组装：通过模具，将5）中的条带按次序贴于透明的PET底衬板上；
7）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
（2）划线法：
1）配制点样溶液：将C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和dsDNA抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG质控配制成相应的包被浓度；
2）固定抗原：使用免疫印迹点样器在一整张的硝酸纤维膜或尼龙膜上，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成独立的检测线和判断指示带；
3）干燥：将包被好的膜片条放入37℃恒温干燥2个小时；
4）切条：用切纸机将组装好的条带切成单人份反应膜条。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：在2）步完成点样后，将膜片从免疫印迹点样器取出室温下放置1小时。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：固定抗原和质控的点样量控制在10ng~30ng。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：判断指示带的宽度均为7mm，抗原条带的宽度均为5mm。
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