CN102778572A - 食物特异性IgE检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种食物特异性IgE检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜。所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。本发明可根据患者具体情况进行“个性化”组合检测、操作简单，并且能够短时间获得检测结果。
Description
技术领域
本发明属于临床检验诊断学领域，是一种利用胶体金免疫层析技术和生物素-链霉亲和素系统所建立的食物特异性IgE检测试剂盒及其制备方法。
技术背景
1.特异性IgE检测的临床价值
变态反应(allergy)又称为超敏反应(hypersensitivity)是指已被抗原致敏的机体，当再次接触相同抗原时所发生的一种异常或病理性免疫应答，表现为生理功能紊乱和(或)组织损伤。引起变态反应的抗原称为变应原(allergen)。变态反应造成组织损伤或功能紊乱引起临床表现、病理症状，此类疾病称为变态反应性疾病。由免疫球蛋白E(IgE)介导的，肥大细胞核和嗜碱性粒细胞参与的变态反应称为I型超敏反应(也称为过敏反应)。吸入变应原(花粉)常引起过敏性哮喘或鼻炎等呼吸系统疾病，食入变应原(蛋、奶)常引起肠炎等消化系统疾病，不仅如此，严重过敏反应也可引起全身症状(休克)。流行病学显示食物过敏反应主要由蛋、奶、海产品等八种主要食物引起，食物过敏反应的人群在逐年增多。
特异性IgE(specific IgE，sIgE)指针对某一种特定变应原的IgE。绝大多数过敏患者血清中均会检测到特异性IgE，如对牛奶过敏者则有针对牛奶变应原的sIgE，对尘螨过敏者则有针对尘螨的sIgE。临床医学方面检测血清sIgE主要用于寻找和确定变应原。通常情况下：①当临床病史非常典型或不适宜作皮试时，可直接进行sIgE检测。②常规吸入或食物变应原皮肤试验阳性，且检测到相应变应原sIgE，如病史、皮试和sIgE均相符，则可确定变应原。因此，与总IgE相比，sIgE具有更重要的临床价值。
2.特异性IgE的检测方法
特异性IgE采用免疫化学法(用已知抗原检测未知抗体)。以固相材料包被已知变应原(抗原)；如血清中存在相应的IgE分子，会与固相材料表面的变应原结合形成免疫复合物；加入标记第二抗体(抗人IgE)，标记抗体与复合物中IgE结合，形成固相变应原-特异性IgE-抗人IgE标记抗体。游离标记物通过洗涤方式除去，最终通过检测标记物，实现sIgE的检测。从方法学角度分析，用于sIgE测定的方法主要包括放射性过敏原吸附试验、间接酶联免疫吸附试验、酶免疫斑点印迹试验和荧光酶标法。目前，国内主流检测方法有酶免疫斑点印记试验和荧光酶免疫法，两种方法均为进口试剂，检测成本很高。
酶免疫斑点印迹法：以硝酸纤维素膜(NC)为固相载体，将多种变应原(如食入过敏原：鱼、虾、蛋、奶、大豆、花生等)分点固定在测试条不同区域；将待检血清稀释合适浓度，与测试条共同置于反应槽内温育，血清中特异性IgE与固相载体表面的相应变应原结合形成免疫复合物；加入酶标记抗人IgE标记抗体，标记抗体与特异性IgE结合；反复冲洗去掉游离标记物，加入酶底物显色，通过NC膜表面的显色带，判断血清中特异性IgE抗体。
荧光酶免疫法：利用一个称为CAP的“帽状”结构塑料材料作为固相载体，吸附常见的多种变应原，形成包被抗原。加待测血清及不同浓度的标准品，血清中特异性抗体与相应变应原结合；再加上β半乳糖苷酶标记的抗人IgE，与固相表面特异性IgE结合(变应原-特异性IgE-抗IgE标记抗体)；加入的底物4-甲基伞形酮-β-半乳糖苷使之产生荧光。用荧光分光光度计读取吸光值，荧光强度与sIgE呈线形关系。据此可绘出标准曲线，得出待测血清中sIgE的量。
3.食物特异性IgE检测的特殊性和现有检测方法的缺陷
与吸入性变应原相比，食入性变应原相对简单，临床医生往往根据病史可初步判定过敏性食物，也就是说对于特定的患者而言，临床医生只需要检测一种(或几种)可疑变应原。但是，不同患者疑似过敏食物不同，检测对象(或组合)并不相同。因此，临床需要一种个性化组合的食物变应原确定(特异性IgE)检测试剂盒。当然，对于门诊病人同样要求简单、快速。
然而，现有食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，无论是荧光酶免疫法还是酶免疫印记法，均不能满足临床的上述愿望。现有商品化试剂盒常常由生产厂家将多种变应原预先包被于固相材料表面，形成特定检测组合，不能根据患者的具体需要进行“个性化”选择。此种测定模式不仅增加患者就医成本，而且，也浪费宝贵医学资源。另一方面，无论是荧光酶免疫法，还是酶免疫印迹法，由于复杂操作过程和较长反应时间，使整个检测过程一般需要3-4小时。如此长的检测时间，使患者不能在短时间内拿到检测报告。患者需要择日取报告，再次就医。对于初诊患儿如医生怀疑某种食物过敏，往往需要快速实验室诊断，此时只需快速筛查进行排除或初步确认，而现有商品化试剂盒不能满足临床或患者的这一要求。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种简单、快速(10分钟)、并可根据患者具体情况选择不同食物特异性IgE的组合方式进行检测的食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，以解决现有商品化食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，不能根据患者具体情况进行“个性化”组合检测、以及操作时间长，不能在短时间获得检测结果等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种食物特异性IgE检测试剂盒，包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜，所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
本发明试剂盒结构与原理示意图如图1所示，试剂盒的作用过程如下：
1、将提取的食物蛋白作为已知抗原，分别标记生物素制备得到生物素标记的变应原(已知抗原)，生物素标记变应原不直接包被固相载体(NC膜)，而是作为瓶装诊断试剂供检测对象选择；
2、将鼠抗人IgE单克隆抗体标记胶体金颗粒，制备成胶体金标记抗体，胶体金标记抗体能够与人IgE结合形成免疫复合物，呈现紫红色；
3、分别将生物素标记牛血清白蛋白(BBC)和羊抗鼠IgG多克隆抗体吸附在NC膜的检测区(T)和质控区(C)，其中再让BBC与链霉亲和素(SA)结合。如此，可确保检测区富集标记生物素的生物分子，质控区结合标记有胶体金的鼠抗人IgE单克隆抗体。
4、检测时，选择一种生物素标记的变应原(如牛奶变应原)，与稀释的待检血清混合后，滴加在测试反应板的加样孔处，如果待测血清中含有针对牛奶的特异性IgE，特异性IgE与生物素标记牛奶结合形成免疫复合物，该复合物随层析流迁移至胶体金标记抗体所在位置的金标垫时，将胶体金标记抗体溶解并与之发生特异性结合，形成生物素抗原-特异性IgE-金标鼠抗人IgE三分子复合物。当此复合物迁移至检测区时，生物素分子与链霉亲和素结合，三分子复合物被富集在检测区并呈现紫红色。同时，游离胶体金标记抗体(过剩)迁移至质控区时，NC膜表面的羊抗鼠IgG多克隆抗体与胶体金标记抗体(鼠IgG)结合，形成免疫复合物并呈现紫红色。
如果待检标本中不存在针对牛奶的特异性IgE，即使形成IgE-金标抗体复合物，因为复合物没有生物标记抗原，不能被检测区的链霉亲和素捕获，检测区无紫红色条带出现。
优选的，所述多种生物素标记的变应原包括牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、蟹变应原、花生变应原、黄豆变应原、腰果变应原和小麦变应原这八种常见食入性变应原。
优选的，所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为8-12微克/毫升，优选10微克/毫升，所述胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的蛋白浓度为3-9微克/毫升，优选5微克/毫升。所述生物素标记牛血清白蛋白的蛋白浓度为10-20微克/毫升，优选15微克/毫升；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为5-10微克/毫升，优选8微克/毫升；所述链霉亲和素的浓度为12-22微克/毫升，优选20微克/毫升。
本发明还提供一种制备所述的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)制备生物素标记的变应原
1)将常规方法纯化好的食物变应原测定蛋白浓度并调整为5-10mg/ml，置于0.1M，pH9.5的NaHCO3缓冲液中，透析、过夜，并用紫外吸收法测定蛋白浓度，计算蛋白总量，得蛋白溶液；
2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与变应原的摩尔比为(18-22)∶1的比例，优选20∶1，将生物素滴加入蛋白溶液中，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h；
3)将反应后的液体用0.01M pH7.4磷酸缓冲盐水溶液于4℃透析24小时，充分除去未结合的生物素，即制成生物素标记的变应原；
(2)制备胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体
用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液pH至8.0-8.4左右(IgG等电点附近)；于20毫升0.001％胶体金溶液(即0.001g胶体金溶于100ml纯净水中)中加入抗体(抗体加入量为0.4-0.8mg,优选0.6mg)，搅拌5-10分钟；再加入10％(10g/100ml)牛血清白蛋白(BSA)，至BSA终浓度为0.5％，搅拌混匀15min；再加入5％(5g/100ml)PEG20000(聚乙二醇，分子量为20,000)至PEG20000终浓度为0.1％，再持续搅拌混匀15min；4℃静置过夜；离心14000rpm30分钟，小心弃上清；沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A=1.5左右(1cm/540nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存。
(3)用常规方法制备NC膜；
(4)组装测试反应板；
将样品垫(吸水材料制成)、包被有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的金标垫、NC膜、吸水材料依次组装在不吸水的支撑片上。
优选的，制备NC膜包括如下步骤：
(1)膜处理
取一张硝酸纤维素膜，做标记后放在Tris缓冲盐水溶液(TBS/NaN3，pH8.0)中浸泡5-10分钟；
(2)组装点样装置
将浸泡过的硝酸纤维膜放在平铺的垫子上，放上蛋白点样板子，板子两侧的孔要在硝酸纤维膜上，上面留出贴标记纸的地方，用夹子固定；
(3)点样
划分好检测区和质控区，将生物素化牛血清白蛋白点样于检测区(T)，将羊抗鼠IgG多克隆抗体点样于质控区；点样后，室温温育2小时；
吸出检测区包被溶液，用TBS洗涤两次后吸干洗液，再加入链霉亲和素溶液，室温继续温育2小时，确保链霉亲和素与生物素稳定结合；
(4)封闭
取出硝酸纤维膜，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗10分钟，再用2％聚乙烯醇溶液室温封闭1小时；
(5)漂洗
弃去封闭液，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗三次，每次10分钟；
(6)风干。
本发明还提供了一种用于所述试剂盒的测试反应板。所述测试反应板包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水材料、不吸水的支撑片；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水材料依次粘贴在不吸水的支撑片上；所述样品垫上设有加样孔；所述金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有吸附了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和吸附了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；检测区和质控区上设有观察口；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、常规的食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒检测过程需要3-4小时，而且操作繁琐，而本发明试剂盒只需要10分钟即可得到检测结果，具有使用简单、快捷方便的优点，满足了临床快速筛查的需要，极大的节省了患者的就医时间；
2、本发明的试剂盒能够有效节约检测成本，检测时可根据临床医生初步判定的过敏性食物，将一种(或几种)可疑变应原进行组合检测即可，解决了现有商品化试剂盒常常由生产厂家将多种变应原预先包被于固相材料表面，形成特定检测组合，不能根据患者的具体需要进行“个性化”选择，而造成患者就医成本增加的问题。
3、本发明的简化了试剂的制备方法。传统方法胶体金层析法检测sIgE时采用双抗原夹心法。此种方法需要制备金标记过敏原，而在标记过程中，需要将pH值调整到标记蛋白的等电点附近，但食物蛋白复杂，等电点差异较大，很难制备良好的标记抗原，而本发明不需要标记过敏原，回避标记多种食物蛋白的困难，采用制备胶体金标记抗人IgE，胶体金标记抗体为常规技术，单一蛋白成分，标记过程非常容易。
附图说明
图1是本发明试剂盒结构与原理示意图。
图2是本发明测试反应板结果判定示意图，其中a为阳性结果，b为阴性结果。
图中：
1、不吸水的支撑片 2、样品垫 3、金标垫
4、NC膜 5、生物素标记变应原 6、特异性IgE
7、胶体金标记抗体 8、链霉亲和素 9、生物素标记牛血清白蛋白
10羊抗鼠IgG多克隆抗体 11、吸水材料 12、观察口
13、检测区 14、质控区。 15、加样孔
图1中，A-H分别代表蛋、奶、蟹、虾、小麦、花生、腰果和黄豆八种变应原。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
如图1、图2所示，一种测试反应板，其组成包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水材料、不吸水的支撑片；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水材料依次粘贴在不吸水的支撑片上；所述样品垫上设有加样孔；所述金标垫上含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；检测区和质控区上设有观察口；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
实施例2
一种食物特异性IgE检测试剂盒，其组成包括：
(1)实施例1的测试反应板；
(2)生物素标记的八种变应原——牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、蟹变应原、花生变应原、黄豆变应原、腰果变应原和小麦变应原，每种生物素标记的变应原分别装于试剂瓶中，和测试反应板配套使用。
所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1、制备生物素标记变应原
(1)制备八种食物蛋白提取液
A：鸡蛋白提取液
取数个生鸡蛋的蛋清约100ml，按1∶5的体积比加入-20℃预冷丙酮，于4℃环境中浸泡去脂24h，其间搅拌2次，换液数次至丙酮澄清。而后3000rpm离心30min，弃去丙酮，将沉淀于低温环境通风挥干丙酮后称重，按8ml/g的比例溶于PBS缓冲液(0.01M,pH7.4)，于4℃环境中提取24h，其间搅拌数次。最后，以12000rpm低温冷冻离心20min，收集上清液，冷冻抽干。
B：牛奶蛋白提取液
取鲜牛奶50ml，3000rpm冷冻离心15分钟，拨开上层脂肪，取清液，即为脱脂牛奶。用饱和硫酸铵盐析法使脱脂牛奶中的蛋白质析出，沉淀用100ml0.2M pH9.5NaHCO3(含0.1％NaN3)溶解。9000rpm冷冻离心1小时后取上清液，在蒸馏水中透析，冷冻抽干。
C：虾蛋白提取液
新鲜的活虾去壳，将肉分离出来。称10g肉，加入30ml0.2M NaHCO3(pH9.5)溶液和少量的酶抑制剂，混匀后用粉碎机粉碎2分钟。再加入50ml0.2M NaHCO3(pH9.5)溶液，粉碎2分钟，然后4℃搅拌过夜。10000rpm冷冻离心1小时，取上清液先在dd H2O中透析，再在50mM NH4HCO3中透析，冷冻抽干。
D：蟹蛋白提取液
制备过程同虾。
E：花生蛋白提取液
花生10g加入100ml提取液(含0.9％生理盐水、0.1％NaN3和0.25M EDTA)，混匀5分钟后用粉碎机粉碎30分钟，4℃搅拌过夜。然后9000rpm冷冻离心1小时，取上清液在0.01M NaHCO3(pH9.5)溶液中透析，冷冻抽干。
F：黄豆蛋白提取液
黄豆45g在水中浸泡过夜，换一次水，最后加水至140ml。加入280ml0.3M NaHCO3(pH9.5)溶液，混匀后用粉碎机粉碎30分钟，4℃搅拌过夜。9000rpm冷冻离心1小时，取上清液用1.2um滤膜过滤，然后在50mM NH4HCO3溶液中透析。将透析过的提取液再用1.2um滤膜过滤，冷冻抽干。
G：腰果蛋白提取液
制备过程同花生。
H：小麦蛋白提取液
称取面粉25g，加入125ml氯仿，室温下搅拌1个小时。再加入125ml丙酮，混匀后过滤并用125ml丙酮洗，然后放在空气中，等丙酮挥发后称量固体为24g。将固体用400ml0.01mol/LpH7.4PBS缓冲液(含2gSDS，0.4g NaN3和少量的Leupeptin)溶解，在沸水中搅拌1小时，9000rpm离心30分钟。取上清液先在dd H2O中透析，再在50mMNH4HCO3中透析，最后1.2um滤膜过滤，冷冻抽干。
(2)制备生物素标记变应原溶液
将纯化好的变应原测定蛋白浓度并调整为约5-10mg/ml，装入透析袋中，置于0.1M，pH9.5的NaHCO3缓冲液中，透析、过夜，中间换液数次，并用紫外吸收法测定蛋白浓度，计算蛋白总量。
(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与抗原的摩尔比为18-22(优选20)∶1的比例，将生物素缓慢、逐滴加入蛋白溶液中，边滴加边搅拌，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h。
(3)将反应后的液体用0.01M pH7.4磷酸缓冲盐水溶液(PBS)于4℃透析24小时，其中换液数次，充分除去未结合的生物素，即制成生物素标记变应原。
(4)将标记生物素后的八种变应原，分别装于试剂瓶中，和测试板配套使用。
上述缓冲溶液配置如下：
0.01M H7.4磷酸缓冲盐水溶液
0.1M pH9.5碳酸氢钠缓冲溶液(NaHCO3缓冲液)
(2)制备胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体
(1)原料：鼠抗人IgE单克隆抗体(腹水经蛋白A亲和层析纯化，IgG类)商品化试剂，英国ABCAM公司产品，货号：ab7382)。胶体金颗粒(商品化试剂，购自上海杰一生物技术有限公司，货号JY-SJ102)。
(2)方法
透析抗体
待标记抗体装入透析管中，并用0.005M NaCl溶液，透析以去除盐成分。
标记过程
用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液pH至8.0-8.4左右(IgG等电点附近)；于20毫升胶体金溶液(0.001％)中加入抗体(抗体加入量为0.4-0.8mg,优选0.6mg)，搅拌5-10分钟；再加入10％牛血清白蛋白(BSA)，至BSA终浓度为0.5％，搅拌混匀15min；再加入5％PEG20000(聚乙二醇，分子量为20,000)至PEG20000终浓度为0.1％，再持续搅拌混匀15min；4℃静置过夜；离心14000rpm30分钟，小心弃上清；沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A=1.5左右(1cm/540nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
3.制备NC膜
所需原料：
NC膜
生物素化牛血清白蛋白(美国Sigma公司产品)
羊抗鼠IgG多克隆抗体，用于与鼠IgG特异性反应(蛋白A亲和层析纯，美国Sigma公司产品，货号：ab47050)
制备方法：
(1)膜处理
取一张硝酸纤维素膜(7cm×8cm)，做标记后放在Tris缓冲盐水溶液(TBS/NaN3，pH8.0)中浸泡5-10分钟；
(2)组装点样装置
将浸泡过的硝酸纤维膜放在平铺的垫子上，放上蛋白点样板子，板子两侧的孔要在硝酸纤维膜上，上面留出贴标记纸的地方，用夹子固定；
(3)点样
划分好检测区(T)和质控区(C)，将生物素化牛血清白蛋白(浓度10～20微克/毫升，优选15微克/毫升，点样体积400～600微升，优选500微升)点样于检测区(T)，将羊抗鼠IgG多克隆抗体(浓度5～10微克/毫升，优选8微克/毫升，点样体积400～600微升，优选500微升))点样于质控区(C)；点样后，室温温育2小时；
吸出检测区包被溶液，用TBS/NaN3洗涤两次后吸干洗液，再加入链霉亲和素溶液(浓度12～22微克/毫升，优选20微克/毫升，点样体积400～600微升，优选500微升)，室温继续温育2小时，确保链霉亲和素与生物素稳定结合；
(4)封闭取出硝酸纤维膜用蒸馏水冲洗三次，TBS洗10分钟，再用2％聚乙烯醇(PVA)溶液(称取2克聚乙烯醇溶于100毫升蒸馏水)室温封闭1小时；
(5)漂洗弃去封闭液，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗三次，每次10分钟；
(6)风干将NC膜放在干燥的纸上，自动干燥，贴标记纸，裁剪备用。
TBS/NaN3(硝酸纤维膜处理液)
4.试剂盒组装
按图1所示顺序进行测试反应板组装，组装时胶体金进行胶体金标记抗体点样后需要真空干燥，内置干燥剂后真空包装，4℃保存；
将测试反应板和装于试剂瓶中的生物素标记的变应原，组装成试剂盒。
实施例3
一种实施例2所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)准备
将测试反应板和生物素标记变应原取出，室温放置20分钟左右；
(2)测试
根据临床需要选择生物素标记变应原(一种或几种)，取1∶10稀释血清(用0.85％生理盐水稀释待测血清)和生物素标记过敏原各200微升，混合静置反应5分钟后滴加于测试板的加样孔(S+R)位置，静置10分钟观看结果。
(3)结果判定
如图2所示，当观察口出现单一测试线(质控区(C))时，结果为阴性；出现两个测试线时，(质控区(C)和检测区(T))结果为阳性；未出现测试线结果无效。
实施例4
本发明中试剂盒的性能参数如下：
稳定性：不小于12个月
检测敏感度：10ng/ml
特异性：过敏原之间交叉反应率小于0.5％
检测时间：不大于10分钟。
用36例蟹过敏患者血清和43例正常对照血清，以目前在临床检测广泛应用的德国MEDIWISS的IgE Allergy Screen检测试剂盒(酶免疫印记法)为参照品，比对结果如表所示。从表1中数据可计算本发明试剂盒的特异性为97.6，敏感度为94.4。
表1本发明试剂盒与参照品的检测结果
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (8)
1.一种食物特异性IgE检测试剂盒，包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜；其特征在于：所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多种生物素标记的变应原包括牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、蟹变应原、花生变应原、黄豆变应原、腰果变应原和小麦变应原。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为8-12微克/毫升；所述胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的蛋白浓度为3-9微克/毫升；所述生物素标记牛血清白蛋白的蛋白浓度为10-20微克/毫升；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为5-10微克/毫升；所述链霉亲和素的浓度为12-22微克/毫升。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为10微克/毫升；所述胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的蛋白浓度为5微克/毫升；所述生物素标记牛血清白蛋白的蛋白浓度为15微克/毫升；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为8微克/毫升；所述链霉亲和素的浓度为20微克/毫升。
5.一种制备权利要求1-3任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备生物素标记的变应原
1)将常规方法纯化好的食物变应原测定蛋白浓度并调整为5-10mg/ml，置于0.1M，pH9.5的NaHCO3缓冲液中，透析、过夜，并用紫外吸收法测定蛋白浓度，计算蛋白总量，得蛋白溶液；
2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与变应原的摩尔比为(18-22)∶1的比例，优选20∶1，将生物素滴加入蛋白溶液中，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h；
3)将反应后的液体用0.01M pH7.4磷酸缓冲盐水溶液于4℃透析24小时，充分除去未结合的生物素，即制成生物素标记的变应原；
(2)制备胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；
(3)用常规方法制备NC膜；
(4)组装测试反应板；
将样品垫、包被有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的金标垫、NC膜、吸水材料依次组装在不吸水的支撑片上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：制备NC膜包括如下步骤：
①膜处理
取一张硝酸纤维素膜，做标记后放在Tris缓冲盐水溶液中浸泡5-10分钟；
②组装点样装置
将浸泡过的硝酸纤维膜放在平铺的垫子上，放上蛋白点样板子，板子两侧的孔要在硝酸纤维膜上，上面留出贴标记纸的地方，用夹子固定；
③点样
划分好检测区和质控区，将生物素化牛血清白蛋白点样于检测区，将羊抗鼠IgG多克隆抗体点样于质控区；点样后，室温温育2小时；
吸出检测区包被溶液，用TBS洗涤两次后吸干洗液，再加入链霉亲和素溶液，室温继续温育2小时，确保链霉亲和素与生物素稳定结合；
④封闭
取出硝酸纤维膜，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗10分钟，再用2％聚乙烯醇溶液室温封闭1小时；
⑤漂洗
弃去封闭液，用蒸馏水冲洗三次，TBS洗三次，每次10分钟；
⑥风干。
7.根据权利要求5或6所述的所述的方法，其特征在于：制备胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体包括如下步骤：
调节胶体金溶液pH至8.0-8.4；于胶体金溶液中加入鼠抗人IgE单克隆抗体，搅拌5-10分钟；再加入10％牛血清白蛋白，调整至牛血清白蛋白浓度为0.5％，搅拌混匀后再加入5％PEG20000至PEG20000终浓度为0.1％，持续搅拌，4℃静置过夜，离心后弃上清；沉淀用含有0.5毫克/毫升的PEG20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度A=1.5，加叠氮钠防腐，4℃保存。
8.一种用于权利要求1-4任一项所述试剂盒的测试反应板，其特征在于：所述测试反应板包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水材料、不吸水的支撑片；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水材料依次粘贴在不吸水的支撑片上；所述样品垫上设有加样孔；所述金标垫上含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；检测区和质控区上设有观察口；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
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