CN105738618B - 一种弓形虫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种单克隆杂交瘤细胞株4D5，其保藏号是CCTCC NO：C201624，分类命名：杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。本发明还提供一种弓形虫检测试剂盒，由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液构成，其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆单体由保藏号是CCTCC NO：C201624的单克隆杂交瘤细胞株4D5分泌。本发明利用了胶体金免疫层析试纸条技术，该技术检测时间短、成本低、操作简单，适合于现场检测以及流行病学调查。本发明以弓形虫SAG3为诊断抗原，与SAG1、SAG2相比，其表达量大，并且在弓形虫所有感染阶段都可以表达，更适合作为诊断抗原；临床应用结果显示本发明敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，易于向基层推广。

Description

一种弓形虫检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术，涉及一种基于弓形虫表面蛋白3(SAG3)的胶体金免疫层析快速检测技术的检测试剂盒，能够快速检测人、猪、猫、狗等的弓形虫感染。
背景技术
弓形虫病是一种在世界范围内广泛传播的人兽共患寄生虫病，它是由机会性胞内寄生虫刚地弓形虫所引起的。这种寄生虫可以入侵所有的温血动物，包括人类。免疫力正常的机体不会表现出明显症状，在免疫力低下的人群中会导致脑积水、视网膜脉络膜炎、脑炎，在免疫力系统损伤的人群中甚至会引起死亡。弓形虫病同时也对畜禽养殖业造成了重大的影响，它可以造成畜禽的流产、死胎以及新生幼畜的死亡，尤其是在绵羊和山羊之中。因此，弓形虫病在公共卫生学以及畜禽安全生产上的地位十分重要。
弓形虫病的诊断目前主要依靠血清学检测方法，乳胶凝集试验(LAT)是在畜禽中检测弓形虫的主要方法，但该方法的特异性较低。酶联免疫吸附试验(ELISA)是诊断人弓形虫病的最主要方法。但这些方法都需要较长的时间，而且需要一些设备或者受过专业训练的技术人员，不适于大规模现场检测。免疫层析试纸条技术因为其简单，易操作，而且检测时间短，结果易于观察，成本低，易于保存等特点被认为是一种理想的现场检测的方法，对临床检测具有重要意义。弓形虫表面蛋白SAG3是一种保守蛋白，在弓形虫速殖子、缓殖子以及子孢子等多个时期均可表达，并且其表达量较高，仅位于SAG1、SAG2之后；在弓形虫入侵宿主细胞时，大量的SAG3会被释放出来，与SAG1共同发挥粘附及入侵的作用，因此，SAG3是一个非常理想的诊断靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种能分泌抗弓形虫SAG3抗体的单克隆杂交瘤细胞株，该细胞株已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号是CCTCCNO：C201624，分类命名：单克隆杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。
本发明的另一个目的是提供一种抗SAG3单克隆抗体，通过以下步骤获得：
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1x106个单克隆杂交瘤细胞株4D5，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测得蛋白浓度为6.9mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80℃冰箱。
本发明的再一个目的是提供一种弓形虫检测试剂盒，是一种基于弓形虫表面蛋白3(SAG3)的胶体金免疫层析快速检测试纸条的检测试剂盒，采用双抗原夹心法快速检测弓形虫抗原，为防控弓形虫病奠定基础。
本发明的试剂盒包由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液组成；其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆单体由单克隆杂交瘤细胞4D5(保藏号：CCTCC NO：C201624)分泌，标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液为10mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液(PB)，由NaH2PO4·H2O 1.38g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，加双蒸水定容至100ml，调节pH至7.5。
本发明试剂盒通过以下步骤制备获得：
(1)胶体金溶液的制备：向圆底烧瓶中加入1ml的HAuCl4，迅速加入柠檬酸钠溶液，将水浴温度调至100℃，溶液颜色会在10min内变蓝最后变成酒红色，使溶液自然冷却到50℃，最后置于4℃封存；
(2)制备金标蛋白溶液：将胶体金溶液pH调节至8.2，再逐滴加入单克隆抗体4D5，至其终浓度为12.5μg/ml，加入5％的牛血清蛋白溶液(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌振荡30min，之后4℃冰箱静置2h，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解4℃保存；
(3)试纸条制备：试纸条由PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫所组成，上端为手持部分，即吸水垫部分；中端为反应区，即硝酸纤维素膜区域，其中C线为质控线，按照2mg/ml包被羊抗鼠IgG，T线为检测线，按照2mg/ml包被抗弓形虫SAG3单克隆抗体，硝酸纤维素膜最佳封闭条件为1h；在硝酸纤维素膜之上放有金标垫，吸附1:5稀释的金标蛋白溶液；下端为样品区(检测孔)，即样品垫区域；将试纸条各部分组装完毕后，在切割机上将试纸条切割成4mm宽的条带，密封保存备用。
本发明试剂盒的应用：
(1)检测程序：将待检血清用样品稀释液稀释，其最佳稀释倍数为1:200，取100μl加入到试纸条下端的样品区中，静置10-15min后观察；
(2)结果判定：样品检测的试纸条中，能够清晰的看到T线和C线，线条单一、清楚、背景色浅，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阳性；样品检测的试纸条中，未能清晰的看到T线，但C线出现清晰的红色，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阴性，T线和C线均未出现红色，则检测结果无效。
在所有检测的试纸条上全部能清晰的看到C线的前提下，在阳性标准血清的试纸条上可以看到清晰的红色T线以及红色C线，在阴性标准血清的试纸条上可以看到清晰的C线但看不到T线，并且线条单一、清楚、背景色浅，才可以对样品检测的结果进行判定，否则应重做。
本试剂盒检测样品为血清，全血标本请于37℃放置2小时或4℃过夜后于离心机中1000g离心10分钟，取上清检测。
本发明的有益之处是：本发明以弓形虫SAG3为诊断抗原，与SAG1、SAG2相比，其表达量大，并且在弓形虫所有感染阶段都可以表达，更适合作为诊断抗原；本发明利用了胶体金免疫层析试纸条技术，该技术检测时间短、成本低、操作简单，适合于现场检测以及流行病学调查；临床应用结果显示本发明敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，易于向基层推广。
附图说明
图1是试纸条结构示意图。
图2是试纸条结果判定示意图。
图3是腹水纯化SDS-PAGE。
图4是试纸条特异性检测。
图5是试纸条灵敏性检测。
图6是试纸条稳定性检测。
具体实施方式
本技术结合附图和具体实施例作进一步说明，应该理解，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例一试剂盒制备
本发明的试剂盒包含：试纸条、标准品、对照品、样品稀释液；其中标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液为10mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液(PB)，由NaH2PO4·H2O 1.38g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，加双蒸水定容至100ml，调节pH至7.5。
本发明试剂盒通过以下步骤制备获得：
(1)抗SAG3单克隆抗体的制备：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1x106个单克隆杂交瘤细胞株4D5(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：C201624，保藏日：2016.2.1)，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测定蛋白浓度，结果为6.9mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80℃冰箱；
(2)胶体金溶液的制备：向圆底烧瓶中加入1ml的HAuCl4，迅速加入柠檬酸钠溶液，将水浴温度调至100℃，溶液颜色会在10min内变蓝最后变成酒红色，使溶液自然冷却到50℃，最后置于4℃封存；
(3)制备金标蛋白溶液：将胶体金溶液pH调节至8.2，再逐滴加入单克隆抗体，至其终浓度为12.5μg/ml，加入5％的牛血清蛋白溶液(BSA)溶液使其终浓度为1％，继续搅拌振荡30min，之后4℃冰箱静置2h，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解4℃保存；
(4)试纸条制备：参见图1，试纸条由PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫所组成，上端为手持部分，即吸水垫部分；中端为反应区，即硝酸纤维素膜区域，其中C线为质控线，按照2mg/ml包被羊抗鼠IgG，T线为检测线，按照2mg/ml包被抗弓形虫SAG3单克隆抗体，硝酸纤维素膜最佳封闭条件为1h；在硝酸纤维素膜之上放有金标垫，按照1:5稀释金标抗体复合物，吸附金标抗体复合物；下端为样品区，即样品垫区域；将试纸条各部分组装完毕后，在切割机上将试纸条切割成4mm宽的条带，密封保存备用；
(5)检测程序：将待检血清用样品稀释液稀释，其最佳稀释倍数为1:200，取100μl加入到试纸条下端的样品区中，静置10-15min后观察；
(6)结果判定：样品检测的试纸条中，能够清晰的看到T线和C线，线条单一、清楚、背景色浅，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阳性；样品检测的试纸条中，未能清晰的看到T线，但C线出现清晰的红色，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阴性，T线和C线均未出现红色，则检测结果无效。参见图2。
在所有检测的试纸条上全部能清晰的看到C线的前提下，在阳性标准血清的试纸条上可以看到清晰的红色T线以及红色C线，在阴性标准血清的试纸条上可以看到清晰的C线但看不到T线，并且线条单一、清楚、背景色浅，才可以对样品检测的结果进行判定，否则应重做。
本试剂盒检测样品为血清，全血标本请于37℃放置2小时或4℃过夜后于离心机中1000g离心10分钟，取上清检测。
实施例二抗弓形虫SAG3单克隆抗体的纯化
1.材料
单克隆抗体腹水由本实验室保存；硫酸铵、正辛酸等试剂均为国产分析纯；冷冻干燥机、酶标仪购自Thermo公司；离心机购自HITACHI。
2.单克隆抗体纯化
采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，首先从冰箱中取出腹水，置于冰上融化，然后12000rpm离心30min，取上清，弃去沉淀的杂质；将腹水和醋酸盐缓冲液按照1:2的比例混合，室温搅拌下按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃过夜，使其充分沉淀；4℃条件下，12000rpm，离心30min，弃去沉淀，上清经过滤纸过滤，加入1/10体积的0.1M pH＝7.4的PBS，用2M NaOH调节pH至7.4，冰浴条件下30min内加入饱和硫酸铵溶液，搅拌1h之后静置4h，4℃条件下，10000rpm，离心30min，弃去上清，沉淀即为纯化的单克隆抗体，其余腹水经过冷冻干燥后置于-80℃保存。
3.透析
沉淀用0.1M pH＝7.4的PB缓冲液溶解，并在50-500倍体积的PB缓冲液中4℃透析过夜，将透析过后的单抗收集起来，采用Bradford法测定浓度，置于-20℃保存。
4.结果
抗弓形虫SAG3单克隆抗体浓度为6.9mg/ml，纯化结果如图3，其中M：蛋白Marker；1:未纯化后单克隆抗体；2:纯化后单克隆抗体。
实施例三胶体金免疫层析快速检测试纸条的性能评价
1.材料
猪弓形虫阳性血清、猪隐孢子虫阳性血清、猪链球菌阳性血清、猪沙门氏菌阳性血清、猪囊尾蚴阳性血清、猪球虫阳性血清、猪附红细胞体阳性血清、猪旋毛虫阳性血清弓形虫天然全蛋白，猪弓形虫阴性血清由本实验室保存。
2.特异性试验
利用本研究建立的胶体金免疫层析快速检测试纸条检测方法分别检测猪弓形虫阳性血清、猪隐孢子虫阳性血清、猪链球菌阳性血清、猪沙门氏菌阳性血清、猪囊尾蚴阳性血清、猪球虫阳性血清、猪附红细胞体阳性血清、猪旋毛虫阳性血清，以此确定本方法的特异性。
3.灵敏性检测
将制备的弓形虫天然全蛋白用10mM PB(pH 7.5)分别稀释至1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml，然后加入到制备好的胶体金试纸条上，静置10-15min，检测该方法的灵敏性。
4.稳定性检测
将制备好的试纸条在4℃存储16周，然后在进行特异性以及灵敏性试验，检测所制备试纸条的稳定性。
5.结果
特异性结果如图4，灵敏性结果如图5，稳定性结果如图6，显示本技术特异性强，稳定性好，检测下限为100ng/ml弓形虫天然全蛋白。图4中1：猪弓形虫阳性血清；2：猪链球菌阳性血清；3：猪沙门氏菌阳性血清；4：猪囊尾蚴阳性血清；5：猪球虫阳性血清；6：猪隐孢子虫阳性血清；7：猪附红细胞体阳性血清；8：猪旋毛虫阳性血清。图5中1：猪阴性血清；2：弓形虫天然全蛋白1mg/ml；3：弓形虫天然全蛋白100μg/ml；4：弓形虫天然全蛋白10μg/ml；5：弓形虫天然全蛋白1μg/ml；6：弓形虫天然全蛋白100ng/ml；7：弓形虫天然全蛋白10ng/ml；8：弓形虫天然全蛋白1ng/ml。图6中1：猪弓形虫阴性血清；2：弓形虫天然全蛋白10μg/ml；3：弓形虫天然全蛋白100ng/ml；4：猪链球菌阳性血清。
实施例四本试剂盒对采集部分样品的检测结果
应用本试剂盒对310份猪血清样品进行了检测，将待检血清用样品稀释液按照1:200稀释，取100μl加入到试纸条上的检测孔中，静置10-15min后观察。结果显示检测出阳性样本23份，阳性率为7.42％，阴性样本287份，阴性率为92.58％，结果如表1所示。
表1试纸条临床试验结果
阳性(％) 阴性(％)
检出率(％) 23(7.42) 287(92.58)
结果判定：样品检测的试纸条中，能够清晰的看到T线和C线，线条单一、清楚、背景色浅，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阳性；样品检测的试纸条中，未能清晰的看到T线，但C线出现清晰的红色，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阴性，T线和C线均未出现红色，则检测结果无效。
在所有检测的试纸条上全部能清晰的看到C线的前提下，在阳性标准血清的试纸条上可以看到清晰的红色T线以及红色C线，在阴性标准血清的试纸条上可以看到清晰的C线但看不到T线，并且线条单一、清楚、背景色浅，才可以对样品检测的结果进行判定，否则应重做。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种单克隆杂交瘤细胞株4D5，其特征在于，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学，保藏号是CCTCC NO：C201624，分类命名：单克隆杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。
2.一种由杂交瘤细胞株4D5分泌的抗SAG3单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4D5的保藏号是CCTCC NO：C201624，其特征在于，通过以下步骤获得：
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106个单克隆杂交瘤细胞株4D5，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33 μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4 ℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测得蛋白浓度为6.9 mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80 ℃冰箱。
3.一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液组成，其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆抗体由单克隆杂交瘤细胞株4D5分泌，所述单克隆杂交瘤细胞株4D5的保藏号是CCTCC NO：C201624，标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液pH为7.5，由NaH2PO4·H2O 1.38g，Na2HPO4·12 H2O 3.58g，加双蒸水定容至100 ml制得。
4.根据权利要求3所述的一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过以下步骤制备制得：
（1）胶体金溶液的制备：向圆底烧瓶中加入1 ml的HAuCl4，迅速加入柠檬酸钠溶液，将水浴温度调至100 ℃，溶液颜色会在10 min内变蓝最后变成酒红色，使溶液自然冷却到50℃，最后置于4 ℃封存；
（2）制备金标蛋白溶液：将胶体金溶液pH调节至8.2，再逐滴加入权利要求2所述的抗SAG3单克隆抗体，至其终浓度为12.5 μg/ml，加入5%的牛血清蛋白溶液使其终浓度为1%，继续搅拌振荡30 min，之后4℃冰箱静置2 h，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解4℃保存；
（3）试纸条制备：试纸条由PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成，上端为手持部分，即吸水垫部分；中端为反应区，即硝酸纤维素膜区域，其中C线为质控线， T线为检测线，在硝酸纤维素膜之上放有金标垫，下端为样品区，即样品垫区域；将试纸条各部分组装完毕后，在切割机上将试纸条切割成4 mm宽的条带，密封保存备用；
所述试纸条制备中，C线按照2 mg/ml包被羊抗鼠IgG，T线按照2 mg/ml包被单克隆抗体，硝酸纤维素膜最佳封闭条件为1 h；金标垫吸附1:5稀释的金标蛋白溶液。
5.根据权利要求3所述的一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，试纸条使用的判断标准为：能清晰的看到T线和C线，线条单一、清楚、背景色浅，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阳性；样品检测的试纸条中，未能清晰的看到T线，但C线出现清晰的红色，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阴性，T线和C线均未出现红色，则检测结果无效。
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