CN107462712A - 一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，同时提供了其及制备方法，用于猫弓形虫感染的血清检测，制备的猫弓形虫感染胶体金试纸条具有简单、快速、无需特殊仪器设备等特点。检测结果便于判读，适于临床中快速诊断和大规模流行病学调查中应用。利用间接胶体金检测方法，其中纯化的重组蛋白SAG3保证了本发明的特异性。使用金黄色葡萄球菌（SPA）进行标记，SPA容易获得，成本较低。与传统的间接血凝试验和间接免疫荧光试验相比，检测速度较快，避免接触活虫，保证了检测人员的安全。
Description
技术领域
本发明公开一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，同时提供了其及制备方法，用于猫弓形虫感染的血清检测，属于免疫学技术领域。
背景技术
弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种重要的人畜共患寄生虫病，该病寄生宿主广泛，可感染所有温血动物及部分变温动物和冷血动物。猫是该病的终末宿主同时也是中间宿主。感染弓形虫的猫，通过排出带有感染性卵囊的粪便来感染人类及动物等其他中间宿主。OIE将弓形虫病列为B类人畜共患传染病。IHA和IFA为国标中规定的检测方法。可是“国标”方法有着操作复杂、需要专业人员、耗时、检测条件要求高等诸多缺点，不适合实践中广泛推广。实验室常用的检测方法为酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法适用于具有相关条件的实验室进行操作。试验中需要有专门的试验人员，相关的仪器设备，检测时间较长等原因，所以不合适用于基层现场操作使用。
免疫胶体金技术是近些年发展较快的一种快速检测技术。本发明通过胶体金技术来建立一种检测猫弓形虫病的免疫胶体金试纸，并进行了实际样品检测，为猫弓形虫检测及实验猫的标准制定及标准化奠定基础，同时为猫弓形虫病的防治提供技术支持和理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，具有速度快、操作简单、不需特殊仪器等特点，适合临床中的现场检测及大规模的流行病学调查。
本发明还公开了一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸的制备方法，利用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），弓形虫表面抗原SAG3包被检测线（T线），兔抗SPA抗体包被质控线(C线)，以此为基础研制出本发明的检测猫弓形虫感染的免疫胶体金层析试纸条。
本发明涉及的一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸条，包括玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC）、PVC底板、吸水板；其特征在于：
金标垫上的金标抗体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纤维素膜上的检测线（T）包被弓形虫表面抗原SAG3、质控线（C）包被兔抗SPA抗体，建立了一种胶体金试纸条检测方法。
本发明涉及的一种检测猫弓形虫感染免疫胶体金层析试纸条的制备方法，是通过表达纯化SAG3重组蛋白，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金溶液对SPA进行标记，制备金标垫，组装试纸条。弓形虫表面抗原SAG3为检测线（T）、兔抗SPA抗体作为质控线（C），主要包括：
1、重组蛋白SAG3诱导表达
（a）取3μL原核表达的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培养基中，转入37℃恒温振荡培养箱中，150r/min，振荡过夜；
（b）取振荡过夜的菌液转移至300mL的LB培养基中，同时加入300μL的卡那霉素，封口后转入37℃恒温震荡培养箱中进行恒温振荡培养，1.5h~2h；
（c）加入300μL的IPTG进行诱导，4~5h后4℃离心机7000r×7min，收集菌液；
（d）取PBS对步骤c）收集的菌液进行重悬，超声破碎，离心弃上清；
（e）用2mol/L尿素对沉淀进行充分吹打溶解后离心，弃上清；反复进行5次；
（f）用8mol/L尿素对洗后的沉淀进行溶解；
（g）离心后，取上清即得；
2、SAG3重组蛋白的纯化
（a）将透析袋放入去离子水浸泡5min激活；
（b）取重组蛋白放入激活的透析袋中密封；
（c）将透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃条件下进行搅拌透析5h；
（d）按第（3）步分别通过4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素进行梯度透析，用PBS将尿素置换；
（e）将步骤4）产物4℃、12000 r/min条件下离心5min，取上清-20℃保存；
（f）SDS-PAGE电泳；
3、胶体金试纸条的制备
取21mm的NC膜贴于PVC底板上；金标垫压在NC膜上，样品垫压在金标垫上，吸水纸压在NC膜上粘在底板上；取试纸条进行抗体的包被划线，检测线（T）划纯化的SAG3蛋白、质控线（C）划兔抗SPA抗体。
本发明的积极效果在于：
制备的猫弓形虫感染胶体金试纸条具有简单、快速、无需特殊仪器设备等特点。检测结果便于判读，适于临床中快速诊断和大规模流行病学调查中应用。利用间接胶体金检测方法，其中纯化的重组蛋白SAG3保证了本发明的特异性。使用金黄色葡萄球菌（SPA）进行标记， SPA容易获得，成本较低。与传统的间接血凝试验和间接免疫荧光试验相比，检测速度较快，避免接触活虫，保证了检测人员的安全。
附图说明
图1 SDS-PAGE；
图2 胶体金溶液图；
图3 胶体金透射电镜图；
图4 透射电镜观察金标探针；
图5 特异性试验结果图；
图6 敏感性试验结果图；
图7 重复性试验结果图。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。
实施例1
一、表面抗原SAG3重组蛋白的表达及纯化
1、重组蛋白SAG3诱导表达
（1）取3μL原核表达的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培养基中，转入37℃恒温振荡培养箱中，150r/min，振荡过夜；
（2）取振荡过夜的菌液转移至300mL的LB培养基中，同时加入300μL的卡那霉素，封口后转入37℃恒温震荡培养箱中进行恒温振荡培养，1.5h~2h；
（3）加入300μL的IPTG进行诱导，4~5h后4℃离心机7000r×7min，收集菌液；
（4）取PBS对步骤3）收集的菌液进行重悬，超声破碎，离心弃上清；
（5）用2mol/L尿素对沉淀进行充分吹打溶解后离心，弃上清；反复进行5次以上；
（6）用8mol/L尿素对洗后的沉淀进行溶解；
（7）离心后，取上清即得SAG3重组蛋白；
2、SAG3重组蛋白的纯化
（1）将透析袋放入去离子水浸泡5min激活；
（2）取重组蛋白SAG3放入激活的透析袋中密封；
（3）将透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃条件下进行搅拌透析5h；
（4）按第（3）步分别通过4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素进行梯度透析，用PBS将尿素置换；
（5）将步骤4）产物4℃、12000 r/min条件下离心5min，取上清-20℃保存；
（6）SDS-PAGE电泳
实施例2
猫弓形虫感染免疫胶体金试纸条的制备
（1）胶体金溶液的制备
选择柠檬酸三钠还原法来进行制备，取99mL 四馏水中加入1mL的氯金酸溶液（1%），加入1mL柠檬酸三钠溶液（1%），制备40nm胶体金颗粒。
（2）胶体金颗粒的鉴定
通过透射电镜技术对胶体金进行鉴定，取胶体金溶液滴于镍网上，用滤纸吸干后，电镜进行观察。优质的胶体金颗粒大小均一，成分散状分布无聚集。
（2）金标抗体最佳pH确定
利用0.2mol/L的K2CO3溶液来对胶体金溶液pH进行调试，通过观察颜色的变化来进行判断。
（3）金标抗体的制备
利用摸索好的最佳K2CO3加入量，对胶体金进行标记，标记后的金标抗体溶于复溶液中4℃保存待用。
（4）检测线T包被浓度的选择
对T线包被的蛋白进行1mg/mL，0.5 mg/mL，0.25 mg/mL，0.125 mg/mL进行稀释。按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线包被浓度。
（5）质控线C包被浓度的选择
在确定T线包被浓度的情况下对C线进行摸索，分别按2mg/mL，1mg/mL，0.5 mg/mL，0.25mg/mL进行稀释。按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线抗体的最佳包被浓度。
结果
（1）SDS-PAGE
纯化后的重组蛋白，经SDS-PAGE电泳分析后，SAG3目的条带单一，大小为43KDa（图1）。
（2）胶体金溶液的制备
胶体金溶液颜色呈酒红色，溶液透明无杂质（图2）。
（3）胶体金颗粒的鉴定
透射电镜观察颗粒大小基本一致，约40nm左右，分散均匀，没有聚集（图3）。
（4）金标抗体最佳pH确定
确定胶体金标记抗体的最佳pH值为加入4µL，0.2mol/L K2CO3。
（3）金标抗体的制备
通过颜色变化和透射电镜观察，在加入6μg的SPA时胶体金颜色不再变化。电镜观察金颗粒周围有一圈蛋白晕，无聚集现象出现，表明标记成功（图4）。
（4）检测线T包被浓度的选择
将实施例1制备的重组蛋白SAG3稀释到0.5mg/mL时依然可以看到较为清晰的条带，故选择0.5mg/mL为T线的最佳包被浓度。
（5）质控线C包被浓度的选择
结果显示当抗体浓度在1mg/mL时C线颜色较深，所以最终确定C线的最佳包被浓度为1mg/mL。
试验例1
胶体金免疫层析试纸条性能测试
测试试纸条的性能，需要进行一系列的试验，主要包括：特异性试验、敏感性试验、重复性试验、保存期试验。
（1）特异性试验
本试验分别选取了猫弓形虫阳性参照血清、阴性参照血清、猫杯状病毒标准血清、猫传染性胃肠炎病毒标准血清，进行交叉反应试验。
（2）敏感性试验
选取猫弓形虫阳性参照血清按照1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280比例进行倍比稀释。取健康猫只血清做阴性参照。等待5-10min观察结果。
（3）重复性试验
选择三个批次的本发明试纸条进行重复性试验，分别滴加猫弓形虫阳性参照血清和阴性参照血清进行重复性试验。根据显色情况来评判试纸条的重复性。
（4）稳定性试验
按摸索的最佳条件进行试纸条的组装，放于室温、4℃、37℃，进行封闭干燥储存。分别在1d、7d、30d、60d、90d、120d后进行试验。观察试纸条显色深浅的变化来确定最佳保存期限。
（7）试纸条的初步应用
应用本发明建立好的胶体金检测方法来进行临床样品检测。共检测了96份猫血清。计算样品的阳性率。与市售的商品化试剂盒进行对比。
结果
（1）特异性试验
本发明分别选取了猫弓形虫阳性参照血清、猫阴性参照血清、猫杯状病毒标准血清、猫传染性胃肠炎病毒标准血清，进行试纸条特异性检测。猫弓形虫参照血清T、C线均显色；猫阴性血清，猫杯状病毒阳性血清和猫传染性胃肠炎病毒血清检测线（T）均不显色，质控线（C）均发生颜色变化，说明试纸条特异性较好（图5）。
（2）敏感性试验
当稀释至1：640时可看到T线有轻微的条带，在1：1280时T线已经没有颜色变化。所以本试验的敏感性为1：640（图6）。
（3）重复性试验
选取三个不同批次的试纸条来检测猫弓形虫参照阳性血清和阴性血清，分别进行批间和批内重复，结果显示较一致，说明试纸条的重复性较好（图7）。
（4）保存期试验
按优化好的条件进行试纸条的组装后，分别封闭干燥存放于室温、37℃、4℃环境当中。分别在1d、7d、30d、60d、90d、120d，进行试验。试纸条在4℃保存的效果较好，可达到120d。室温保存的试纸条相对较好，保存期可达到90d。37℃保存的试纸条效果相对差些，保存期在90d时已经失效。
（5）试纸条的初步应用
应用组装好的免疫胶体金试纸条检测方法来对临床96份样品进行检测，其中55份显示为阳性，阳性率为57.29%。市售间接血凝试剂盒的阳性率为56.25%。
<110>吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211>1038
<212> DNA
<213>刚地弓形虫（Toxoplasmagodii）
<400> 1
1 GAGCACGGAC TGTTCGTCGC CGCAGGGAAA TCGAGAAGTA AGATAACCTA TTTTGGCACG
61 CTCACTCAGA AGGCTCCGAA CTGGTACCGC TGCTCTTCAA CGAGGGCGAA TGAAGAGGTC
121 GTAGGACATG TGACGCTGAA CAAAGAGCAC CCTGATATGA CAATTGAATG CGTCGACGAC
181 GGCTTGGGCG GAGAGTTTTT GCCGCTCGAA GGCGCGACGT CGTCGTACCC GCGAGTATGT
241 CACATTGATG CCAAGGACAA GGGCGACTGC GAGCGCAACA AGGGCTTTCT GACCGACTAC
301 ATACCGGGCG CGAAGCAGTA CTGGTACAAG ATAGAAAAGG TGGAGAACAA CGGCGAGCAA
361 TCCGTTCTGT ACAAATTCAC AGTTCCTTGG ATATTCCTTC CGCCCGCCAA GCAGCGATAC
421 AAGGTTGGAT GCCGATACCC GAACCACGAG TATTGCTTTG TTGAGGTCAC CGTCGAACCC
481 ACGCCGCCAA TGGTCGAAGG CAAGAGAGTG ACCTGCGGGT ACCCCGAGTC CGGCCCCGTG
541 AATCTCGAGG TGGACTTGTC AAAGGACGCG AACTTTATCG AGATTCGGTG CGGCGAACAG
601 CACCACCCGC AGCCGTCGAC CTACACGCTG CAGTACTGCT CAGGTGACTC GGTGGACCCG
661 CAGAAGTGTT CGCCGCAGTC CCTGACGAAC ATTTTTTATG ACTACAGCTC TTCGTGGTGG
721 AAGGGGAAAC TGAACGGGCC TGACGGGGCA ACTCTCACCA TTCCACCCGG CGGGTTCCCC
781 GAAGAAGACA AATCTTTTCT TGTCGGGTGT TCACTCACTG TGGACGGGCC GCCCTTCTGC
841 AACGTCAAAG TGAGAGTTGC CGGGAACCCC AGAAAGTGGG GGAGAGGCGG AGGCGGCCAT
901 CCAGGAAGCG GAGGATTGCA GCCGGGAACT GAAGGGGAAA GTCAAGCTGG AACAGAAAGT
961 TCAGCCGGCG CGAGTTCGCG AATGGCTTCC GTTGCCCTGG CGTTCCTTCT CGGTCTCCTT
1021 GTGCATGTGG CTGCCTAA
Claims (2)
1.一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，包括玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC）、PVC底板、吸水板；其特征在于：
金标垫上的金标抗体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纤维素膜上的检测线（T）包被弓形虫表面抗原SAG3、质控线（C）包被兔抗SPA抗体。
2. 权利要求1所述的一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：通过表达纯化SAG3重组蛋白，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金溶液对SPA进行标记，制备金标垫，组装试纸条；其中，
1）重组蛋白SAG3诱导表达
（a）取3μL原核表达的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培养基中，转入37℃恒温振荡培养箱中，150r/min，振荡过夜；
（b）取振荡过夜的菌液转移至300mL的LB培养基中，同时加入300μL的卡那霉素，封口后转入37℃恒温震荡培养箱中进行恒温振荡培养，1.5h~2h；
（c）加入300μL的IPTG进行诱导，4~5h后4℃离心机7000r×7min，收集菌液；
（d）取PBS对步骤c）收集的菌液进行重悬，超声破碎，离心弃上清；
（e）用2mol/L尿素对沉淀进行充分吹打溶解后离心，弃上清；反复进行5次；
（f）用8mol/L尿素对洗后的沉淀进行溶解；
（g）离心后，取上清即得；
2）SAG3重组蛋白的纯化
（a）将透析袋放入去离子水浸泡5min激活；
（b）取重组蛋白放入激活的透析袋中密封；
（c）将透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃条件下进行搅拌透析5h；
（d）按第（3）步分别通过4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素进行梯度透析， 用PBS将尿素置换；
（e）将步骤4）产物4℃、12000 r/min条件下离心5min，取上清-20℃保存；
（f）SDS-PAGE电泳；
3）胶体金试纸条的制备
取21mm的NC膜贴于PVC底板上；金标垫压在NC膜上，样品垫压在金标垫上，吸水纸压在NC膜上粘在底板上；取试纸条进行抗体的包被划线，检测线（T）划纯化的SAG3蛋白、质控线（C）划兔抗SPA抗体。
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2017
- 2017-06-21 CN CN201710475252.3A patent/CN107462712A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20171212 |