CN103439502A - 一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种两步法快速检测过敏性疾病变应原诊断试剂盒及其制备方法和使用方法。该试剂盒使用时，首先将待检测血清样本和过氧化氢酶标记的变应原等体积混合后，室温孵育5-15分钟后，再将混合后的样品加到胶体金试纸条的样品孔中，5-15分钟后读结果。该试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条和吸水垫。胶体金通过链霉素蛋白和标记生物素的羊抗过氧化氢酶抗体偶联，在膜条上包被有鼠抗人IgE单克隆抗体，最终形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物，质控带包被有鼠抗羊IgG抗体。该试剂盒检测总时间为10～30分钟。该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作变应原特异性IgE检测试剂。

Description

一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种过敏性疾病变应原诊断试剂盒(胶体金法)及其制备方法，以及这种试剂盒的使用方法。

背景技术

变应性疾病(又称过敏性疾病)包括特应性皮炎、食物过敏、变应性鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变应性疾病列为21世纪重点研究和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如纤维支气管镜的开展，已对此病有了共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞(包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等)浸润。此病的发病主要涉及变应原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15～20分钟所发生的速发相反应主要与肥大细胞有关，而在激发后4～24小时所发生的迟发反应则被认为有嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞(TH)中的一个亚型TH₂。变应原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治过敏性疾病有重要意义。

过敏性疾病大多为I型变态反应性疾病，是临床多发病症，具有季节性和区域性高发的特点。多因吸入尘螨、植物花粉、毛屑等变应原或因呼吸道感染病原微生物感染而引起。

呼吸道过敏反应最常见的典型疾病是变应性鼻炎和支气管哮喘。支气管哮喘在许多国家其患病率和死亡率有增加的趋势，如美国、英国、澳大利亚、新西兰等国近一年内的哮喘发生率在10-30％之间。2003年中国城区儿童哮喘患病率调查结果显示：0-15岁儿童哮喘现患病率为0.12～3.34％，全国平均为1.54％；累计患病率为1.97％，与10年前(1988～1990抽样调查，0.11～2.03％)相比明显增加。70％患儿首次喘息发作在3岁内；以呼吸道感染和过敏为诱因导致发作者占94.62％，文章分析认为其中部分可能为过敏性鼻炎症状。该调查显示，哮喘给患儿、患儿家庭和社会经济造成了严重的影响。病人及家长医疗需求迫切。关于哮喘的诱发因素，有大量的研究表明，过敏是致喘的重要因素，其中尘螨、室尘、花粉较为重要。

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是儿童期最常见的一种慢性皮肤炎症，全世界儿童5％～20％患有特应性皮炎，其中60％进入青春期后仍有特应性皮炎表现。将近80％患者有发生呼吸道变态反应的危险，包括变应性鼻炎和哮喘。吸入性变应原，包括室内尘螨和动物皮毛，是特应性皮炎的潜在诱因。在一个双盲对照研究中，Tan等发现尘螨避免可改善特应性皮炎。由此可见，进行皮肤点刺试验或特异性血清IgE测定对确定特应性皮炎患者是否有气传变应原变态反应及采取合适的变应原避免措施很有用。

慢性荨麻疹、湿疹是常见的复发性、过敏性皮肤病，病因复杂，往往无法根治，易复发；前者为机体接触变应原后发生I型或III型变态反应及非变态反应两条途径致病，后者是由内外激发因子引起的一种迟发型变态反应。其中60～80％发病与特异性变应原有关，一次变应原的作用是发病关键，若能及时检测出患者的变应原，对预防和治疗这类疾病极有意义。

过敏性疾病变应原的诊断方法分为体内试验和体外试验，体内试验有皮内试验和点刺试验两种方法。体外试验的方法主要有免疫印迹、酶联免疫分析发、放射性免疫分析法和荧光免疫分析。

皮肤试验的原理是使微量无害的变应原进入皮肤，与皮下肥大细胞表面的特异性IgE抗体结合，经过一系列的酶激活，使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等多种化学介质，从而使局部血管扩张、通透性增加，出现丘疹和红晕反应。临床上根据反应情况，对I型变态反应性疾病的病因进行诊断。其试验的方法有多种，较常用的有皮内试验和皮肤点刺试验(SPT)。皮内试验变应原液是进入真皮，而SPT变应原液仅进入表皮。

过敏性疾病变应原的诊断，是一个系统性排除筛查试验，往往为了确诊患者的过敏原，需要进行几十种疑是变应原的筛查，初次筛查利用体内皮肤试验，会给患者带来很大不必要的痛苦。在过敏性疾病变应原诊断的流程中，先通过体外诊断试剂盒初筛确诊具体变应原，然后通过体内试验确认过敏变应原。所以过敏性疾病变应原体内诊断和体外诊断的方法是相辅相成，体外诊断避免了用体内试验带来的不必要痛苦和危害。

过敏性疾病变应原体外诊断的主要原理为变应原与患者血清中的特异性IgE结合，然后再与酶标、放射性同位素标记、荧光素标记的二抗结合，再与底物反应，病人血清中的特异性IgE与底物反应的强度成正比。

现上市的过敏性疾病变应原体外诊断试剂盒为免疫印迹和酶联免疫分析为原理的试剂盒，操作时间长(150min～240min)，操作步骤复杂(包括孵育，洗脱等步骤)，配套设备昂贵(10～30万元)，操作需要经过专业培训的技术员来操作。严重的影响了变应原体外检测方法的普及，目前国内大多三甲医院才拥有变应原体外检测的能力，我国大多基层医院和部队野外医院均不能开展变应原体外诊断的方法。本发明提供的过敏原体外诊断试剂盒反应时间快(10～30min)，操作简单，无配套设备，灵敏度高，适合我们不同级别医院的使用。

胶体金免疫分析法相比其它免疫分析法快速(10～30min)、简便，不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行，廉价，可立刻拿到结果，不必等待，稳定性好，可长期保存。胶体金免疫分析方法是21世纪生化检验POCT(point of care Testing即床边检验)发展方向之一。胶体金免疫分析方法已经广泛用于传染病、肿瘤疾病的早期诊断和预防，但结合过敏原的特殊性质，变应原提取液是一个复合物，含有致敏蛋白、非致敏蛋白、色素等分子，传统的胶体金分析方法用于变应原检测，灵敏度低。本发明采用两步法胶体金分析方法，将鼠抗人IgE代替变应原包被在胶体金膜上，将过氧化氢酶标记的变应原和血清样本在加样前孵育，血清样本中的sIgE充分和过氧化氢酶标记的变应原结合反应，然后再加到样品孔中，结合了sIgE的过氧化氢酶标记的变应原和胶体金上的羊抗过氧化氢酶多克隆抗体结合，再流动到膜上和鼠抗人IgE反应结合形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物后显色。本发明提供的变应原特异性抗体IgE快速诊断试剂盒，通过技术上的改进克服了传统胶体金法在变应原使用上的技术瓶颈，诊断快速，操作简单，能够广泛的应用医疗机构。

发明内容

本发明提供了一种变应原特异性IgE抗体快速检测试剂盒，该试剂盒快速(10-30min)，简便，不要任何设备，操作也极其简单，无需要专业人员，携带方便，可随时随地进行检测，价廉，稳定性好。

本发明快速检测特异性IgE试剂盒，包括过氧化氢酶标记的变应原和胶体金诊断试纸条。

本发明中，被过氧化氢酶标记的变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种。

优选本发明被过氧化氢酶标记的变应原为变应原组合。本发明优选的变应原组合如下：

变应原组合I，为吸入组变应原，包括：屋尘螨/粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛/猫毛、蟑螂、律草花粉、霉菌混合(枝状枝孢/烟曲霉/链格孢)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/杨白腊/榆树)变应原。

变应原组合II，为吸入组变应原，包括：春季花粉I(柳杉/杉木/杨树/榆树/柳树)、春季花粉II(桦树/槭树/栎树/胡桃/油菜)、多价真菌I(产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉)、多价真菌II(匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母)、多价真菌III(好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/洋白蜡/榆树)变应原。

变应原组合III，为吸入组变应原，包括：夏秋花粉I(向日葵/苍耳/灰藜/大麻)、夏秋花粉II(玉米花粉/高粱花粉/莎草花粉/蓖麻花粉)、蒿属花粉、律草花粉、豚草花粉、多价真菌I、多价真菌II、多价真菌III变应原。

变应原组合IV，为食物变应原，包括：牛奶、鸡蛋清、海虾、花生/大豆/腰果、鱼/虾/蟹、牛肉/羊肉、小麦面、芒果/苹果/橘子变应原。

其中，“/”表示“和”。

其中，植物花粉变应原采集于野外生长和人工种植的花粉，过200～300目筛子筛出杂质；昆虫变应原和真菌变应原均为人工培养后灭活；动物皮屑变应原均取自健康的动物。

将以上原料脱脂、干燥、缓冲液提取、离心分离、过滤、超滤后制备包被膜条变应原。

本发明可将变应原组合I、变应原组合II。变应原组合III、变应原组合IV分别包装在同一包装袋中，作为一次检测试验。

本发明所述的胶体金诊断试纸条包括样品孔、金标垫、膜条和吸水垫。

试纸条中的样品孔，为玻璃纤维膜。

试纸条中的金标垫，为吸附有胶体金复合物的玻璃纤维膜。其中胶体金复合物为胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体。

试纸条中的膜条，为包被有鼠抗人IgE单克隆抗体和鼠抗羊IgG单克隆抗体的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、PVDF。

试纸条中的吸水垫，为多层滤纸。

试纸条中的样品孔、金标垫、膜条和吸水垫均贴在PVC底板上。在PVC底板中央贴上包被好鼠抗人IgE单克隆抗体和鼠抗羊IgG单克隆抗体的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜或PVDF膜条，膜条上缘粘贴吸水滤纸，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔。

本发明中试验条的组装优选，贴吸水垫：吸水滤纸上沿必须和已贴好膜的板子的上沿吻合，吸水纸下沿必须压膜的0.05cm～0.1cm；贴胶体金标记抗体复合物：金标垫上沿必须压着膜的下沿，并超过膜下沿的0.1cm～0.2cm；贴样品孔：样品垫上沿必须压着金标垫的下沿二分之一处。

本发明提供了一种过敏性疾病变应原检测方法，其包括过氧化氢酶标记的变应原试剂和胶体金试纸条。

本发明的一种变应原特异性抗体IgE快速检测试剂盒可以通过如下方法制备，包括：

(1)将变应原用过氧化氢酶标记，其变应原包括：昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原、食物变应原。其中，变应原组合I，为吸入组变应原，包括：屋尘螨/粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛/猫毛、蟑螂、律草花粉、霉菌混合(枝状枝孢/烟曲霉/链格孢)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/杨白腊/榆树)变应原。

其中，变应原组合II，为吸入组变应原，包括：春季花粉I(柳杉/杉木/杨树/榆树/柳树)、春季花粉II(桦树/槭树/栎树/胡桃/油菜)、多价真菌I(产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉)、多价真菌II(匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母)、多价真菌III(好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/洋白蜡/榆树)变应原。

其中，变应原组合III，为吸入组变应原，包括：夏秋花粉I(向日葵/苍耳/灰藜/大麻)、夏秋花粉II(玉米花粉/高粱花粉/莎草花粉/蓖麻花粉)、蒿属花粉、律草花粉、豚草花粉、多价真菌I、多价真菌II、多价真菌III变应原。

其中，变应原组合IV，为食物变应原，包括：牛奶、鸡蛋清、海虾、花生/大豆/腰果、鱼/虾/蟹、牛肉/羊肉、小麦面、芒果/苹果/橘子变应原。

(2)胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体的制备

1、胶体金颗粒的制备

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、41nm和50nm。

2、链霉素蛋白和胶体金颗粒的结合

①0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。

②于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。

③加入5mll％PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液(切忌倾倒)。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A540nm＝1.5左右为宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1％BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。

以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

3、生物素标记的羊抗过氧化氢酶IgG抗体的制备

①用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。

②用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L，PH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml。

③每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

④按每250ug生物素酯加入20ul1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。

⑤以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

4、胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体的制备

将制备好的胶体金和链霉素蛋白复合物与生物素标记的羊抗过氧化氢酶IgG抗体按1∶1比例混合，37℃孵育1h，制备得胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体复合物。

5、胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备

用喷点仪将胶体金标记的羊抗过氧化氢酶IgG喷在玻璃纤维素膜上，真空干燥2h。

(3)胶体金膜条的制备

将鼠抗人IgE和鼠抗羊IgG抗体稀释到一定浓度，用喷点仪喷在硝酸纤维膜上，37℃干燥4h，形成样品带和质控带。

(4)试纸条的组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。

本发明还提供了一种变应原特异性抗体IgE快速检测试剂盒的使用方法，其包括：

(1)待测血清50μl和50μl过氧化氢酶标记变应原试剂混合后室温孵育5～15min。

(2)然后将孵育后的混合液加到对应变应原胶体金检测试剂样品孔中，5～15min之内读数，实际操作时间不超过1min。

最终形成胶体金-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体-过氧化氢酶-变应原-特异性人IgE抗体-鼠抗人IgE抗体复合物，质控带包被有鼠抗羊IgG抗体。该试剂盒检测总时间为10～30分钟。该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作变应原特异性IgE检测试剂盒。

本发明提供的过敏原特异性抗体IgE快速检测试剂盒相对现市场上的变应原体外诊断试剂盒的优点在于：

(1)快速(10～30min)、简便，不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行，廉价，可立刻拿到结果，不必等待，稳定性好，可长期保存。

(2)将过敏性疾病的检测推广到更基层的医疗机构，间接发展和壮大了变应原医疗机构。

附图说明

图1：一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒胶体金检测试纸条外观图

图2：一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒原理图

具体实施方式

实施例1过敏原特异性抗体IgE快速检测试剂盒的制备

1、过氧化氢酶标记的变应原的制备

(I)将变应原组合I、变应原组合II、变应原组合III和变应原组合IV均稀释到5μg/ml。

其中：

变应原组合I，为吸入组变应原，包括：屋尘螨/粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛/猫毛、蟑螂、律草花粉、霉菌混合(枝状枝孢/烟曲霉/链格孢)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/杨白腊/榆树)变应原；

变应原组合II，为吸入组变应原，包括：春季花粉I(柳杉/杉木/杨树/榆树/柳树)、春季花粉II(桦树/槭树/栎树/胡桃/油菜)、多价真菌I(产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉)、多价真菌II(匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母)、多价真菌III(好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/洋白蜡/榆树)变应原；

变应原组合III，为吸入组变应原，包括：夏秋花粉I(向日葵/苍耳/灰藜/大麻)、夏秋花粉II(玉米花粉/高粱花粉/莎草花粉/蓖麻花粉)、蒿属花粉、律草花粉、豚草花粉、多价真菌I、多价真菌II、多价真菌III变应原；

变应原组合IV，为食物变应原，包括：牛奶、鸡蛋清、海虾、花生/大豆/腰果、鱼/虾/蟹、牛肉/羊肉、小麦面、芒果/苹果/橘子变应原。

(II)称取2.5mgHRP溶解于1ml纯化水中，然后加入0.2ml新配0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌30分钟。

(III)将上述(II)所得溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

(IV)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5，然后加入5μg/ml的变应原在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h。

(V)加入2.5％的Proclin液，混匀。

(VI)将上述(V)所得溶液装入透析袋中，对0.1M PH7.4PBS透析，4℃过夜后分装，5ml/瓶。

2、胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体的制备

(1)胶体金颗粒的制备

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、41nm和50nm

(2)链霉素蛋白和胶体金颗粒的结合

①0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。

②于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。

③加入5ml1％PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液(切忌倾倒)。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A540nm＝1.5左右为宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1％BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。

以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

(3)生物素标记的羊抗过氧化氢酶IgG抗体的制备

①用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。

②用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L，PH8.0)稀释羊抗过氧化氢酶IgG抗体溶液至1-3mg/ml。

③每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

④按每250ug生物素酯加入20ul1mol/L NH₄Cl终止反应，室温放置10分钟。

⑤以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

3、胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备

用喷点仪将胶体金标记的羊抗过氧化氢酶IgG喷在玻璃纤维素膜上，真空干燥2h。

4、胶体金膜条的制备

将鼠抗人IgE和鼠抗羊IgG抗体稀释到一定浓度，用喷点仪喷在硝酸纤维膜上，37℃干燥4h，形成样品带和质控带。

5、试纸条的组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。

实施例2质量检验

本发明试剂盒质量标准依据中华人民共和国《药典》三部，最低检出限、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、精密性均符合国家标准(表1)。

表1：过敏原特异性抗体IgE快速检测试剂盒质量标准和检验

实施例3稳定性考察

将过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒置于37℃8天，然后用标准血清试验，CV＜15％(表2)。

表2：稳定性试验

实施例4临床性能评估

过敏原特异性抗体IgE快速检测试剂盒(金标)，临床性能评估，主要以Phadia100为对照检测试剂，在3家临床试验中心共纳入1000例患者，评价该试剂盒的灵敏度和特异性(表3)。

表3：临床性能评估

Claims (8)

1.一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒，包括过氧化氢酶标记的变应原和胶体金诊断试纸条；其中，所述变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种；所述的胶体金诊断试纸条包括样品孔、金标垫、膜条和吸水垫。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的过氧化氢酶标记变应原包括昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原、食物变应原。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于变应原是变应原组合I，为吸入组变应原，包括：屋尘螨/粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛/猫毛、蟑螂、律草花粉、霉菌混合(枝状枝孢/烟曲霉/链格孢)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/杨白腊/榆树)变应原。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于变应原是变应原组合II，为吸入组变应原，包括：春季花粉I(柳杉/杉木/杨树/榆树/柳树)、春季花粉II(桦树/槭树/栎树/胡桃/油菜)、多价真菌I(产黄青霉/黑曲霉/康氏木霉/总状毛霉/匐枝根霉)、多价真菌II(匐柄霉/弯孢霉/大孢芽枝菌/蠕孢菌/面包酵母)、多价真菌III(好食串株菌/玉米黑粉菌/禾谷镰刀菌/麦散黑粉菌/头孢菌)、树花粉组合(柳树/三角杨树/圆柏/英国梧桐/洋白蜡/榆树)变应原。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于变应原是变应原组合III，为吸入组变应原，包括：夏秋花粉I(向日葵/苍耳/灰藜/大麻)、夏秋花粉II(玉米花粉/高粱花粉/莎草花粉/蓖麻花粉)、蒿属花粉、律草花粉、豚草花粉、多价真菌I、多价真菌II、多价真菌III变应原。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于变应原是变应原组合IV，为食物变应原，包括：牛奶、鸡蛋清、海虾、花生/大豆/腰果、鱼/虾/蟹、牛肉/羊肉、小麦面、芒果/苹果/橘子变应原。

7.如权利要求1-6任一所述的试剂盒，其中试纸条中的样品孔，为玻璃纤维膜；试纸条中的金标垫，为吸附有胶体金复合物的玻璃纤维膜，胶体金复合物为胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过氧化氢酶IgG抗体；试纸条中的膜条，为包被有鼠抗人IgE单克隆抗体和鼠抗羊IgG单克隆抗体的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、PVDF；试纸条中的吸水垫，为多层滤纸。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中偶联有羊抗过氧化氢酶抗体的胶体金按如下方法制备：

1)将链霉素蛋白偶联到胶体金颗粒上；

2)将生物素偶联到羊抗过氧化氢酶抗体上；

3)将1)和2)混合，37℃孵育形成胶体金-链霉素-生物素-羊抗过氧化氢酶抗体复合物。

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