JP2007278773A - イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクロナール抗体が固定された展開支持体と、被検試料から、SDSと2−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルと、展開液とを用い、展開液を展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも10重量%含まれている展開液を用いる。
【選択図】なし
Description
1.材料及び方法
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPDOA2(FERM−P−20657)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μl加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPDOA1(FERM−P−20656)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含むTBSで37℃、1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
穐山ら(特定原材料(卵)測定の厚生労働省通知ELISA法の複数機関による評価研究.食品衛生学雑誌,44, 2003, 213-219)に従い、市販鶏卵より卵タンパク質を調製した。
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表1に示す配合にて各濃度の卵タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、5mmで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
加熱は、75℃、30分で行った。
4)サンプルの前処理
加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル1gを量り取り、それに0.1〜2.0%SDS及び0.1〜2.0%2−メルカプトエタノールを含むPBSを19ml加え撹拌し、沸騰水中で1時間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として表2に示す各溶液を30μl、卵タンパク質を含まない測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを+、非特異反応がないものを−で表した。
1.材料及び方法
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPαs1CN2(FERM−BP−10264)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPαs1CN1(FERM−BP−10263)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、0.1%牛皮ゼラチンを含むTBSで37℃、1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。乳タンパクは穐山らの方法に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より調製した。また、検出用サンプルは表8に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として表9に示す各溶液を30μl、乳タンパク質を含まない測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを+、非特異反応がないものを−で表した。
1.材料及び方法
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPGL2(FERM−BP−10268)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μlを加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPGL1(FERM−BP−10267)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1.0%牛皮ゼラチンを含むTBSで37℃、1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。卵タンパク質は、穐山らの方法に従い、市販小麦粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表15に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として表16に示す各溶液を30μl、小麦タンパク質を含まない測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを+、非特異反応がないものを−で表した。
1.材料及び方法
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPBW2(FERM−BP−10274)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μl加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPBW1(FERM−BP−10272)とPBW2(FERM−BP−10273)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含むTBSで37℃、1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。そばタンパク質は、穐山らの方法に従い、市販そば粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表22に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として表23に示す各溶液を30μl、そばタンパク質を含まない測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを+、非特異反応がないものを−で表した。
Claims (6)
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、SDSと2−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも10重量%含まれている展開液を用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも30重量%含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項1記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも50重量%含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項2記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαs1カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量24kDaと76kDaのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるArah1から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する2種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、変性及び未変性のアレルゲンを抽出するためのSDSと2−メルカプトエタノールを含有する緩衝液と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、SDSと2−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清(FBS)又はウシ胎児血清(FBS)を含む展開液とを備えたことを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαs1カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量24kDaと76kDaのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるArah1から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する2種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項5記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
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