JP2007278773A - イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】各アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、各アレルゲンを抽出し、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールにより抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速かつ精度よくアレルゲンを検出すること。
【解決手段】変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクロナール抗体が固定された展開支持体と、被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルと、展開液とを用い、展開液を展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いる。
【選択図】なし
【解決手段】変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクロナール抗体が固定された展開支持体と、被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルと、展開液とを用い、展開液を展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いる。
【選択図】なし
Description
本発明は、各種アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、各アレルゲンを抽出し、各アレルゲンが変性／未変性のいかなる状態にあってもＳＤＳと２−メルカプトエタノールで効率よく抽出し、さらに、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールにより抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速に検出することのできるイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法やそれに使用することができるイムノクロマト用アレルゲンの検出キットに関する。
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られている。
上記のアレルゲンを迅速で簡易に検出するため、抗原−抗体による特異的反応を利用して特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法としては、試料中の被検出物質を、微粒子に感作させた抗体または抗原と免疫反応により結合させ、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便な免疫測定法であり、特に目視判定が可能である点で一般的に用いられている方法である。
また、試料中の被検出物質に、放射性同位元素、酵素または蛍光物質からなる標識物質により標識した抗体または抗原を免疫反応により結合させ、この結合した標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測定法あるいは蛍光免疫測定法も採用されている。これらの免疫測定法では、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く使われている。これらのうち、いわゆるサンドイッチ型反応の測定法として、イムノクロマトグラフィー法が知られており（例えば、特許文献１参照。）、抗原抗体反応に起因する高い特異性に加え、簡易、迅速を特徴とする種々のアレルゲン検出キットが販売されている。
かかるイムノクロマトグラフィー法に適用される試料としては、生体試料や食品からの抽出物などあるが、試料の種類によっては、検体が存在しないにもかかわらず捕捉部位で淡い呈色を示す所謂非特異反応を生じることがあり、検査における確度の低下をもたらすことがあった。そこで、緩衝液中に、ホスホリルコリン基を有する重合体を、０.００５〜０.３ｗ／ｖ％の濃度で含有し、該重合体の数平均分子量は４０，０００以上であることを特徴とする、測定時の非特異的凝集および非特異反応を防止し、以って、高い確度で測定を可能とする展開溶媒（例えば、特許文献２参照。）が提案されている。
また、上記免疫測定法においては、タンパク質に加熱や加圧などによって変性等が生じた場合、測定結果が低くなったり、測定できないケースが認められていた。そこで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、加熱した被検試料から各アレルゲンを十分に抽出するために、変性剤及び還元剤を用いた抽出溶液を用いて抽出する方法が公定法として採用されている。しかしながら、これらをイムノクロマトグラフィー法に適応した場合、多くの非特異反応が見られるために正確な検査ができず、変性タンパク質を測定する際に問題となっていた。
本発明の課題は、各アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて、各アレルゲンを抽出し、各アレルゲンが変性／未変性のいかなる状態にあってもＳＤＳと２−メルカプトエタノールで効率よく抽出し、さらに、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールにより抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速かつ精度よくアレルゲンを検出することのできるイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法やそれに用いることができるイムノクロマト用アレルゲンの検出キットを提供することにある。
本発明者らは、加熱製品の抽出に変性剤及び還元剤（ＳＤＳと２−メルカプトエタノール）を用いた場合でも、非特異反応がなく迅速で簡易に検出することのできるイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含む展開液を用いると、前記課題を解決できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（２）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも３０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする前記（１）記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（３）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも５０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする前記（２）記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（４）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法に関する。
また本発明は、（５）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、変性及び未変性のアレルゲンを抽出するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備えたことを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（６）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記（５）記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットに関する。
本発明のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法によると、加熱製品の抽出に変性剤及び還元剤（ＳＤＳと２−メルカプトエタノール）を用いた場合でも、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールにより抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速かつ精度よく各種アレルゲンを検出することができる。
本発明のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法としては、変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いる方法であれば特に制限されないが、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が、２０〜１００重量％含まれている展開液を用いることが好ましく、３０〜１００重量％含まれている展開液を用いることがより好ましく、４０〜１００重量％含まれている展開液を用いることが特に好ましく、５０〜１００重量％含まれている展開液を用いることがより一層好ましい。
本発明のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットとしては、変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、変性及び未変性のアレルゲンを抽出するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備えた検出キットであれば特に制限されないが、上記展開液として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液、好ましくは少なくとも２０重量％含まれている展開液、より好ましくは少なくとも３０重量％含まれている展開液、特に好ましくは少なくとも４０重量％含まれている展開液、より一層好ましくは少なくとも５０重量％、例えば５０〜１００重量％含まれている展開液を備えたものが望ましい。
上記展開液におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度が１０重量％未満の場合、非特異反応を生じやすく好ましくない。また、展開液には、緩衝液中にウシ胎児血清（ＦＢＳ）の他、必要に応じて界面活性剤、防腐剤、無機塩などの各種添加剤を懸濁もしくは乳濁または溶解せしめて調製することができる。緩衝液は、そのｐＨが４〜１０、特にｐＨ６〜８が好ましく、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やトリス緩衝液やなどを好適に例示することができる。
上記モノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体の作製方法は従来公知の方法を含め特に制限されないが、例えば、０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液に、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にモノクローナル抗体を溶解した溶液を加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を加え、さらに１５分間反応させ、遠心分離する方法を挙げることができる。また、上記金コロイド標識抗体担持体は、上記作製した金コロイド標識抗体を、例えばガラスウール製コンジュゲートパッドに塗布し、乾燥させることにより作製することができる。
上記展開支持体は、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体を含む緩衝液を、例えば、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた後、ブロッキング処理することにより作製することができる。
ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて変性及び未変性のアレルゲンを抽出して測定サンプルを調製する際に用いられるＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液としては、０．１〜２．０％ＳＤＳ及び０．１〜２．０％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液、好ましくは０．５〜１．０％ＳＤＳ及び０．５〜１．０％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液を用いると、非特異反応を抑制しうる点で好ましい。
上記測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体としては、ガラスウール製のサンプルパッドを例示することができる。そして、このサンプル用担体、前記金コロイド標識抗体担持体、前記展開支持体、好ましくはこの展開支持体の他端に展開液の吸収する吸収パッド等の吸収体を順次連結することによりイムノクロマト測定用試験片とすることができる。そして、サンプル用担体に測定サンプルをスポットし、ウシ胎児血清を含む展開液に浸漬すると、測定サンプル中のアレルゲンは毛管現象等により移動し、金コロイド標識抗体と結合し、この抗原抗体複合体は展開支持体上をなおも毛管現象等により移動して、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が固定された所定位置で抗原抗体複合体が捕捉されて、所定位置に現れる着色ラインの有無により、アレルゲンを検出することができる。
上記変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体としては、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体を好適に例示することができる。
より具体的には、本発明者らにより作製された、抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２を挙げることができ、抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２８１）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２８２）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２８３）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３を挙げることができる。
また、抗オボアルブミンモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２を挙げることができ、抗オボムコイドモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７９）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２８０）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７７）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７８）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ２を挙げることができる。
また、抗小麦グリアジンモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２を挙げることができる。
また、抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３を挙げることができる。
抗落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３を挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。以下、寄託番号が記載されているモノクローナル抗体（ＭＡｂ）産生ハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター中央第６）に受託されている。
［イムノクロマトグラフィーによるＳＤＳ−２メルカプトエタノール変性オボアルブミンの検出］
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＯＡ２（ＦＥＲＭ−Ｐ−２０６５７）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＯＡ２（ＦＥＲＭ−Ｐ−２０６５７）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＯＡ１（ＦＥＲＭ−Ｐ−２０６５６）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＯＡ１（ＦＥＲＭ−Ｐ−２０６５６）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
１）卵タンパク質の調製
穐山ら（特定原材料（卵）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究．食品衛生学雑誌，44, 2003, 213-219）に従い、市販鶏卵より卵タンパク質を調製した。
穐山ら（特定原材料（卵）測定の厚生労働省通知ＥＬＩＳＡ法の複数機関による評価研究．食品衛生学雑誌，44, 2003, 213-219）に従い、市販鶏卵より卵タンパク質を調製した。
２）モデル食肉製品
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１に示す配合にて各濃度の卵タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１に示す配合にて各濃度の卵タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
３）加熱温度・時間
加熱は、７５℃、３０分で行った。
４）サンプルの前処理
加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．１〜２．０％ＳＤＳ及び０．１〜２．０％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
加熱は、７５℃、３０分で行った。
４）サンプルの前処理
加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。検出用サンプル１ｇを量り取り、それに０．１〜２．０％ＳＤＳ及び０．１〜２．０％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１時間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
（４）イムノクロマトグラフィーによる非特異反応の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表２に示す各溶液を３０μｌ、卵タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表２に示す各溶液を３０μｌ、卵タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
２．結果
各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
表３〜６に示したように、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで抽出したサンプルにおいても非特異反応が確認されなかった展開液は、牛胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）であった。そこで、牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いて検出感度の確認を行った。その結果を表７に示す。ＳＤＳが０．５％〜１．０％及び２−メルカプトエタノールが０．５％〜１．０％のとき非特異反応がなく、卵タンパク質を２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出方法を用いた場合でも、展開液に牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いることで、変性剤による非特異反応がなく、迅速に検出できるイムノクロマトキットを構築することが可能となった。
［イムノクロマトグラフィーによるＳＤＳ−２メルカプトエタノール変性カゼインの検出］
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰαｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６４）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰαｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６４）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰαｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６３）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、０．１％牛皮ゼラチンを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰαｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６３）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、０．１％牛皮ゼラチンを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。乳タンパクは穐山らの方法に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より調製した。また、検出用サンプルは表８に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。乳タンパクは穐山らの方法に従い、ホルスタイン種の新鮮乳より調製した。また、検出用サンプルは表８に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。
（４）イムノクロマトグラフィーによる非特異反応の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表９に示す各溶液を３０μｌ、乳タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表９に示す各溶液を３０μｌ、乳タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
２．結果
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
表１０〜１３のように、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで抽出したサンプルでも非特異反応が確認されなかった展開液は、牛胎児血清であった。そこで、牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いて検出感度の確認を行った。その結果、表１４のようにＳＤＳが０．５％〜１．０％及び２−メルカプトエタノールが０．５％〜１．０％のときに非特異反応がなく、乳タンパク質を２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出方法を用いた場合でも、展開液に牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いることで、変性剤による非特異反応がなく、迅速に検出できるイムノクロマトキットを構築することが可能となった。
［イムノクロマトグラフィーによるＳＤＳ−２メルカプトエタノール変性小麦タンパク質の検出］
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６８）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６８）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６７）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１．０％牛皮ゼラチンを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２６７）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１．０％牛皮ゼラチンを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。卵タンパク質は、穐山らの方法に従い、市販小麦粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表１５に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。卵タンパク質は、穐山らの方法に従い、市販小麦粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表１５に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
（４）イムノクロマトグラフィーによる非特異反応の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表１６に示す各溶液を３０μｌ、小麦タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表１６に示す各溶液を３０μｌ、小麦タンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
２．結果
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
表１７〜２０のように、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで抽出したサンプルでも非特異反応が確認されなかった展開液は、牛胎児血清であった。そこで、牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いて検出感度の確認を行った。その結果、表２１のようにＳＤＳが０．５％〜１．０％及び２−メルカプトエタノールが０．５％〜１．０％のときに非特異反応がなく、小麦タンパク質を２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出方法を用いた場合でも、展開液に牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いることで、変性剤による非特異反応がなく、迅速に検出できるイムノクロマトキットを構築することが可能となった。
［イムノクロマトグラフィーによるＳＤＳ−２メルカプトエタノール変性そばタンパク質の検出］
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７４）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
１．材料及び方法
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７４）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７２）とＰＢＷ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７３）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７２）とＰＢＷ２（ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０２７３）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。そばタンパク質は、穐山らの方法に従い、市販そば粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表２２に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。そばタンパク質は、穐山らの方法に従い、市販そば粉末より調整した。また、検出用サンプルは、表２２に示す配合のモデル食肉製品を供試し、加熱温度・時間、サンプルの前処理は前記同様の条件で行った。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
（４）イムノクロマトグラフィーによる非特異反応の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表２３に示す各溶液を３０μｌ、そばタンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として表２３に示す各溶液を３０μｌ、そばタンパク質を含まない測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、非特異反応を確認した。
２．結果
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
次に各展開液に対する非特異反応の判定結果を示す。非特異反応が確認されたものを＋、非特異反応がないものを−で表した。
表２４〜２７のように、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで抽出したサンプルでも非特異反応が確認されなかった展開液は、牛胎児血清であった。そこで、牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いて検出感度の確認を行った。その結果、表２８のようにＳＤＳが０．５％〜１．０％及び２−メルカプトエタノールが０．５％〜１．０％のときに非特異反応がなく、そばタンパク質を２ｐｐｍまで検出することができた。このことから、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いた抽出方法を用いた場合でも、展開液に牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いることで、変性剤による非特異反応がなく、迅速に検出できるイムノクロマトキットを構築することが可能となった。
Claims (6)
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも３０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項１記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも５０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項２記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、変性及び未変性のアレルゲンを抽出するためのＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールを用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備えたことを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009069779A1 (ja) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Morinaga & Co., Ltd. | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
| JP2009258094A (ja) * | 2008-03-18 | 2009-11-05 | Hitachi Chem Co Ltd | クロマトグラフィー分析用ストリップ及びその製造方法 |
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| JP2013033062A (ja) * | 2012-10-30 | 2013-02-14 | Morinaga & Co Ltd | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
| CN103439502A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-12-11 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法 |
| JP2017129422A (ja) * | 2016-01-19 | 2017-07-27 | プリマハム株式会社 | イムノクロマト処理によるアレルゲンの検出方法 |
| CN112526142A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-19 | 杭州福德敏生物技术有限公司 | 一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法 |
| CN115575639A (zh) * | 2022-10-09 | 2023-01-06 | 中国海洋大学 | 一种利用量子点荧光探针同时检测多种食物过敏原的方法 |
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103674657B (zh) * | 2013-12-24 | 2014-08-20 | 朱之炜 | 血清或血浆样本中的抗原抗体免疫复合物处理试剂盒及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000065820A (ja) * | 1998-08-19 | 2000-03-03 | Allergen Free Technology Kenkyusho:Kk | タンパク質抽出用水溶液及び抽出方法並びにアレルゲン分析方法 |
| JP2001305134A (ja) * | 2000-04-21 | 2001-10-31 | Shinto Fine Co Ltd | ダニアレルゲンの簡易検査キット及びそれを用いる検知方法 |
| JP2002267670A (ja) * | 2001-03-07 | 2002-09-18 | Asahi Beer Yakuhin Kk | 特異的結合を利用する検体分析方法 |
| JP2004085425A (ja) * | 2002-08-28 | 2004-03-18 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 物質の検出試薬及び検出方法 |
| JP2005106811A (ja) * | 2004-08-13 | 2005-04-21 | Morinaga & Co Ltd | イムノアッセイ |
| JP2006071509A (ja) * | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Nippon Meat Packers Inc | 食品成分抽出液 |
-
2006
- 2006-04-04 JP JP2006103678A patent/JP4690928B2/ja active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000065820A (ja) * | 1998-08-19 | 2000-03-03 | Allergen Free Technology Kenkyusho:Kk | タンパク質抽出用水溶液及び抽出方法並びにアレルゲン分析方法 |
| JP2001305134A (ja) * | 2000-04-21 | 2001-10-31 | Shinto Fine Co Ltd | ダニアレルゲンの簡易検査キット及びそれを用いる検知方法 |
| JP2002267670A (ja) * | 2001-03-07 | 2002-09-18 | Asahi Beer Yakuhin Kk | 特異的結合を利用する検体分析方法 |
| JP2004085425A (ja) * | 2002-08-28 | 2004-03-18 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 物質の検出試薬及び検出方法 |
| JP2005106811A (ja) * | 2004-08-13 | 2005-04-21 | Morinaga & Co Ltd | イムノアッセイ |
| JP2006071509A (ja) * | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Nippon Meat Packers Inc | 食品成分抽出液 |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2008330507B2 (en) * | 2007-11-30 | 2014-05-22 | Morinaga & Co., Ltd. | Method of extracting food component, food inspection method and food inspection kit |
| JP2009133712A (ja) * | 2007-11-30 | 2009-06-18 | Morinaga & Co Ltd | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
| US8859212B2 (en) * | 2007-11-30 | 2014-10-14 | Morinaga & Co., Ltd. | Method of extracting food component, food inspection method and food inspection kit |
| US20100304499A1 (en) * | 2007-11-30 | 2010-12-02 | Yuriko Oyama | Method of extracting food component, food inspection method and food inspection kit |
| WO2009069779A1 (ja) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Morinaga & Co., Ltd. | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
| JP2009258094A (ja) * | 2008-03-18 | 2009-11-05 | Hitachi Chem Co Ltd | クロマトグラフィー分析用ストリップ及びその製造方法 |
| CN102317780A (zh) * | 2009-02-23 | 2012-01-11 | 普利玛食品株式会社 | 利用免疫层析法的变应原检测方法 |
| CN102317780B (zh) * | 2009-02-23 | 2016-02-17 | 普利玛食品株式会社 | 利用免疫层析法的变应原检测方法 |
| CN105651994A (zh) * | 2009-02-23 | 2016-06-08 | 普利玛火腿株式会社 | 利用免疫层析法的变应原检测方法 |
| KR101331817B1 (ko) | 2009-02-23 | 2013-11-22 | 뿌리마하무가부시끼가이샤 | 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법 |
| WO2010095469A1 (ja) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | プリマハム株式会社 | イムノクロマト法によるアレルゲン検出方法 |
| JP5735411B2 (ja) * | 2009-02-23 | 2015-06-17 | プリマハム株式会社 | イムノクロマト法によるアレルゲン検出方法 |
| JP2013033062A (ja) * | 2012-10-30 | 2013-02-14 | Morinaga & Co Ltd | 食品成分抽出方法及び食品検査方法並びに食品検査キット |
| CN103439502B (zh) * | 2013-06-28 | 2015-12-23 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法 |
| CN103439502A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-12-11 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种快速检测特异性抗体IgE试剂盒及其制备方法 |
| JP2017129422A (ja) * | 2016-01-19 | 2017-07-27 | プリマハム株式会社 | イムノクロマト処理によるアレルゲンの検出方法 |
| WO2017126525A1 (ja) * | 2016-01-19 | 2017-07-27 | プリマハム株式会社 | イムノクロマト処理によるアレルゲンの検出方法 |
| CN108474790A (zh) * | 2016-01-19 | 2018-08-31 | 普利玛火腿株式会社 | 基于免疫层析处理的过敏原的检测方法 |
| KR20230104883A (ko) | 2020-11-10 | 2023-07-11 | 뿌리마하무가부시끼가이샤 | 알레르겐 검출 키트 |
| CN112526142A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-19 | 杭州福德敏生物技术有限公司 | 一种鸡蛋免疫荧光检测试纸条及应用和检测方法 |
| CN115575639A (zh) * | 2022-10-09 | 2023-01-06 | 中国海洋大学 | 一种利用量子点荧光探针同时检测多种食物过敏原的方法 |
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