CN108474790A - 基于免疫层析处理的过敏原的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供专用于擦拭溶液、洗涤水等液态样品中的过敏原检测的、能在不进行提取处理、加热处理的情况下快速且高精度地检测过敏原的基于免疫层析处理的过敏原的检测方法、以及可用于所述方法的过敏原的检测试剂盒。过敏原的检测方法，其是在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下对液态样品实施免疫层析处理。前述免疫层析处理是下述处理：通过将在对改性和未改性的过敏原均能进行识别的单克隆抗体上结合有胶体金的胶体金标记抗体作为流动相，将对改性和未改性的过敏原均进行识别、并且与前述胶体金标记抗体识别不同的表位的单克隆抗体作为固定相，使特定的过敏原与胶体金标记抗体的复合体移动，与固定相的单克隆抗体特异性地结合，从而定性或定量地检测液态样品中的过敏原。
Description
技术领域
本发明涉及过敏原的检测方法、用于所述检测方法的试剂盒，所述检测方法的特征在于，在十二烷基硫酸钠(SDS；sodium dodecyl sulfate)的存在下对液态样品进行免疫层析处理。
背景技术
目前，据说每3人中就有1人患有某种过敏性疾病。尤其是，食物过敏是食品中包含的致敏物质(以下，称为食物过敏原)的摄取所引起的有害的免疫反应，引起皮肤炎、哮喘、消化道疾病、过敏性休克等，由于这样的食物过敏的患者增加，因而在医学上及食品产业上产生了深刻的问题。过敏性休克等机体反应有时会致死，需要实施处置以防患于未然。通过标示等来向消费者传达信息的必要性也提高，FAO/WHO联合食品标准委员会(日文为“合同食品規格委員会”)已就包含作为过敏性物质而为人所知的8种原材料的食品需要标示出包含所述过敏性物质达成一致，并对适合于各国的制度的标示方法进行了探讨(1999年6月)。在日本，考虑到以往的健康危害等的程度、频率，对于实际发生过重症的过敏症状的24个品种的食品，规定了其标示方法(自2002年4月起施行)。
为了快速且简易地检测过敏原，作为利用基于抗原-抗体的特异性反应来检测包含特定的抗原或抗体的被检测物质的免疫测定法，通过免疫反应使试样中的被检测物质与经微粒敏化的抗体或抗原结合、并对通过结合而产生的微粒的凝集状态进行测定的凝集法是简便的免疫测定法，尤其是，从能通过目视进行判断的方面考虑，是通常被使用的方法。
另外，通过免疫反应使利用包含放射性同位素、酶或荧光物质的标记物质进行了标记的抗体或抗原与试样中的被检测物质结合、并对该结合后的标记物质进行测定的放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法也已被采用。这些免疫测定法中，竞争型反应、夹心型反应已被广泛使用。这些中，作为所谓的夹心型反应的测定法，免疫层析法是已知的(例如，参见专利文献1)，具有由抗原抗体反应带来的高特异性的各种过敏原检测试剂盒已有销售。
另一方面，认为特定原材料向食品中的非有意混入也是引起与食物过敏有关的事故的原因之一，为了控制过敏原的所谓的“污染(contamination)”，逐渐强烈地认识到制造装置、原材料的管理的重要性，可在食品制造设备中使用的擦拭试剂盒也已在市场上销售。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平5-010950号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本申请的发明人已开发出免疫层析法等，所述方法用于：对于食品等被检试样，使用阴离子性表面活性剂和硫代硫酸盐、或阴离子性表面活性剂和非离子性表面活性剂等进行提取处理，及/或进行加热处理，然后使用展开液，在展开支持体上展开，通过有无胶体金的聚集，来检测过敏原。所述方法作为精度非常高的方法而为人所知，在将装置等的擦拭溶液、洗涤水等作为被检试样的食品制造场所，被检试样涉及多种，需要在装置等的每个运转日对其进行检查，因此，上述提取处理、加热处理成为降低作业效率的原因之一。本发明的课题在于提供专用于擦拭溶液、洗涤水等液态样品中的过敏原检测的、能在不进行上述提取·加热处理的情况下快速且高精度地检测过敏原的基于免疫层析处理的过敏原的检测方法、以及可用于所述方法的过敏原的检测试剂盒。
用于解决课题的手段
本申请的发明人从是否能够通过利用市售的擦拭试剂盒中包含的溶剂来简便地检测过敏原方面出发而开始进行研究，但仅将市售的擦拭试剂盒中包含的PBS(phosphatebuffered saline：磷酸缓冲生理盐水)在展开支持体上展开来进行免疫层析处理的情况下，有时不能检测出PBS中的过敏原。因此，发明人接着对通过将在以往的检测试剂盒中作为提取液使用的阴离子性表面活性剂、硫代硫酸盐、非离子性表面活性剂等添加至PBS中能否检测过敏原进行了研究，结果，确认了通过使用在PBS中仅添加SDS而得到的溶液进行免疫层析处理，能进行过敏原的检测。进而，确认了若添加有SDS，则即使在使用了PBS以外的水溶液的情况下，也能检测过敏原，另外，即使在使用了预先固定有SDS的免疫层析试纸条(strip)的情况下，也能检测过敏原，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)过敏原的检测方法，其特征在于，在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下对液态样品实施免疫层析处理。
(2)如上述(1)所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品为擦拭溶液或洗涤水。
(3)如上述(1)或(2)所述的过敏原的检测方法，其特征在于，采用液态样品在不进行提取处理或加热处理的情况下进行免疫层析处理。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，SDS浓度为0.05～2.0％。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品还包含至少10％的胎牛血清(FBS)。
(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品还包含硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。
(7)过敏原检测试剂盒，其特征在于，具备展开支持体和用于制备液态样品的溶剂，所述展开支持体是在对改性和未改性的过敏原均能进行识别的单克隆抗体上结合有标记物的标记抗体、和对改性和未改性的过敏原均进行识别并且与前述结合有标记物的标记抗体识别不同的表位的单克隆抗体分别被固定于规定的位置而成的。
(8)如上述(7)所述的过敏原检测试剂盒，其特征在于，还具备FBS。
(9)如上述(8)所述的过敏原检测试剂盒，其特征在于，还具备硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。
发明的效果
通过本发明，能在不进行样品的提取·加热处理的情况下，对食品制造场所中的洗涤水、擦拭液等液态样品中包含的过敏原进行检测。
具体实施方式
作为本发明的过敏原的检测方法，没有特别限制，只要是在SDS(其为阴离子性表面活性剂的一种)的存在下对液态样品实施免疫层析处理的过敏原的检测方法即可，此处，免疫层析处理是下述处理：将在对改性和未改性的过敏原均能进行识别的单克隆抗体上结合有胶体金标记抗体、胶体铂标记抗体、胶体银标记抗体等金属胶体标记抗体、使用了包含聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等有机高分子的胶乳着色粒子的胶乳胶体标记抗体、使用了过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶等的酶标记抗体等标记物的标记抗体作为流动相，将对改性和未改性的过敏原均进行识别、并且与前述胶体金标记抗体识别不同的表位的单克隆抗体作为固定相，使特定的过敏原与上述标记抗体的复合体移动，与固定相的单克隆抗体特异性地结合，从而定性或定量地检测液态样品中的过敏原。
作为本发明的免疫层析用过敏原的检测试剂盒，没有特别限制，只要是具有下述特征的检测试剂盒即可，所述特征为：具备展开支持体和用于制备液态样品的溶剂，所述展开支持体是在对改性和未改性的过敏原均能进行识别的单克隆抗体上结合有上述标记物的标记抗体、和对改性和未改性的过敏原均进行识别并且与前述结合有标记物的标记抗体识别不同的表位的单克隆抗体分别被固定于规定的位置而成的。所述检测试剂盒还可以具备用于回收液态样品的擦拭部，期望即使在从制造年月日起常温保存1年以上的情况下，也具有能满足实用性的精度·稳定性。
作为本发明的方法中的液态样品，没有特别限制，只要是存在包含过敏原的可能性的液体即可，优选为食品制造场所中的存在包含食物过敏原的可能性的溶液。具体而言，可举出：对为了制造食品等而使用的装置进行洗涤的洗涤水；为了将该洗涤水去除而使用的漂洗液；用(擦拭用)溶剂对上述洗涤水的干燥物、上述漂洗液的干燥物、为了制造食品而使用的原料或其飞散物、在为了制造该食品而使用的装置上残留的残渣、食品制造工序中的沉淀物等残留物、包装食品的包装纸、包装容器中的残留物等进行擦拭而得到的擦拭液；及通过将所述擦拭液溶解于溶剂中而得到的擦拭溶液；等等。
作为上述液态样品中的溶剂，可合适地举出自来水、纯水等水、(生理)盐水、PBS等水性溶剂，也可以是它们中的2种以上的混合液，例如，可以用水擦拭并溶解于水中，可以用(生理)盐水擦拭并溶解于水中，可以用PBS擦拭并溶解于水中，可以用水擦拭并溶解于(生理)盐水中，可以用(生理)盐水擦拭并溶解于(生理)盐水中，可以用PBS擦拭并溶解于(生理)盐水中，可以用水擦拭并溶解于PBS中，可以用(生理)盐水擦拭并溶解于PBS中，可以用PBS擦拭并溶解于PBS中。另外，也可以混有包含除了成为检测对象的过敏原以外的过敏原的食品。
作为本发明中的SDS的存在下的免疫层析处理，优选通过在不使用提取液进行提取处理的情况下及/或不进行加热处理的情况下将含有SDS的液态样品供试于免疫层析试纸条从而能检测过敏原的处理，具体而言，可举出下述处理(第一处理)：通过将免疫层析试纸条的样品用载体部浸渍于上述含有SDS的液态样品中，从而上述含有SDS的液态样品中的特定的过敏原与识别特定的过敏原的胶体金标记抗体结合，形成抗原抗体复合体；形成的抗原抗体复合体由于毛细管现象等而在免疫层析试纸条上的展开支持体上移动；在固定有单克隆抗体(其与胶体金标记抗体识别不同的表位且对改性和未改性的上述特定的过敏原进行识别)的规定的位置，捕捉上述抗原抗体复合体；通过由于胶体金在上述规定位置聚集而显出的着色线，来检测上述特定过敏原。
另外，作为其他方式，可举出下述处理(第二处理)：对于上述液态样品，通过将液态样品供试于在展开支持体上固定有SDS的SDS一体化免疫层析试纸条，从而使SDS在展开支持体上溶解；液态样品中的特定的过敏原与识别所述特定的过敏原的胶体金标记抗体结合，形成抗原抗体复合体；形成的抗原抗体复合体由于毛细管现象等而在免疫层析试纸条上的展开支持体上移动；在固定有单克隆抗体(其与胶体金标记抗体识别不同的表位且对改性和未改性的上述特定的过敏原进行识别)的规定的位置，捕捉上述抗原抗体复合体；通过由于胶体金在该规定位置聚集而显出的着色线，来检测上述特定过敏原。
作为供试于上述免疫层析试纸条的液态样品的容量，可举出0.01～1mL、优选0.05～0.5mL、更优选0.075～0.125mL、进一步优选0.08～0.12mL。
在上述单克隆抗体上结合有胶体金的胶体金标记抗体的制作方法包括现有已知的方法，没有特别限制，例如，可举出下述方法：向已用0.2M碳酸钾溶液将pH调节成9.0而得到的胶体金溶液中，添加在2mM硼酸缓冲液(pH9.0)中溶解单克隆抗体而成的溶液，于室温进行30分钟反应，然后添加10％BSA溶液，进而进行15分钟反应，进行离心分离。另外，胶体金标记抗体载带体可通过将上述制作的胶体金标记抗体涂布于例如玻璃棉(glass wool)制结合垫(conjugate pad)并使其干燥来制作。
上述展开支持体可通过将包含单克隆抗体(其与胶体金标记抗体识别不同的表位且对改性和未改性的过敏原进行识别)的缓冲液以直线状涂布于例如硝基纤维素膜片上并使其干燥、然后进行封闭处理来制作。
作为能载带上述液态样品的样品用载体部，可例举玻璃棉制的样品垫。例如可通过将该样品用载体部、上述胶体金标记抗体载带体、前述展开支持体、优选在该展开支持体的另一端吸收展开液的吸收垫等吸收体依次连结而制成上述免疫层析试纸条。
在前述第一处理中，作为SDS的浓度，以液态样品中的终浓度计，可举出0.05～2.0％，优选为0.05～1.0％，优选为0.075～0.75％，更优选为0.1～0.5％，更优选为0.15～0.3％。需要说明的是，本发明中，浓度(％)表示w/v％。
在前述第二处理中，作为SDS的浓度，相对于液态样品的容量而言，可举出0.05～2％，优选为0.125～1％，进一步优选为0.1～0.5％。另外，上述固定有SDS的免疫层析试纸条可通过在上述免疫层析试纸条的样品用载体部进行点样(spot)并使其干燥从而与免疫层析试纸条一体化来使用。
本发明的方法中，优选在液态样品中进一步添加胎牛血清(FBS；Fetal BovineSerum)作为抗体的保护剂，作为FBS浓度，可举出液态样品的10～50％，优选为20～40％，更优选为25～35％，低于10％时，容易发生非特异反应，不理想。另外，也可通过使防腐剂、无机盐等各种添加剂在液态样品中悬浮或乳浊或溶解来制备。另外，对于上述FBS而言，也可与免疫层析试纸条一体化来使用，来代替添加至液态样品中的方式。这种情况下，优选通过在上述免疫层析试纸条的固定有胶体金标记抗体的结合垫上，以液态样品的10～50％的浓度进行点样并使其干燥来进行固定。
本发明的方法中，上述液态样品也可包含硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，其中，溶剂为自来水时，优选添加硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。作为硫代硫酸钠在液态样品中的浓度，可举出0.05～10％，优选为0.08～5％，更优选为0.5～3％，进一步优选为1～2％。作为亚硫酸钠在液态样品中的浓度，可举出0.05～10％，优选为0.08～7.5％，更优选为0.1～5％，进一步优选为1～5％。作为抗坏血酸在液态样品中的浓度，可举出0.005～1％，优选为0.008～0.5％，更优选为0.01～0.25％，进一步优选为0.075～0.125％。
作为本发明中的过敏原，可合适地例举食品中包含的食物过敏原，具体而言，可举出卵、酪蛋白、乳清、小麦、荞麦、花生、大豆、芝麻、甲壳类等中包含的过敏原。
作为上述卵中包含的过敏原，可举出卵白蛋白、卵转铁蛋白(ovotransferrin)、卵类粘蛋白等，从在整个卵中存在且含量最多方面考虑，优选卵白蛋白。作为上述酪蛋白中的过敏原，可举出作为酪蛋白的主要蛋白质的αs1酪蛋白，作为上述乳清中的过敏原，可举出作为乳清的主要蛋白质的β乳球蛋白。作为上述小麦中包含的过敏原，可举出作为小麦的主要蛋白质的小麦麦醇溶蛋白。作为上述荞麦中包含的过敏原，可举出作为荞麦的主要蛋白质的分子量24kDa和76kDa的蛋白质等荞麦过敏原。作为上述花生中包含的过敏原，可举出作为花生的主要蛋白质的Ara h1。作为上述大豆中包含的过敏原，可举出作为大豆的主要过敏原的大豆7S球蛋白。作为上述芝麻中包含的过敏原，可举出作为芝麻的主要过敏原的芝麻11S球蛋白。作为上述甲壳类中包含的过敏原，可举出原肌球蛋白。
作为为了在免疫层析处理中检测上述过敏原而使用的抗体，可举出特异性地识别上述卵白蛋白、αs1酪蛋白、β乳球蛋白、小麦麦醇溶蛋白、荞麦过敏原、Ara h1、大豆7S球蛋白、芝麻11S球蛋白、甲壳类中包含的原肌球蛋白过敏原等各过敏原的抗体，优选识别上述各过敏原中的不同的表位的2种单克隆抗体的组合。
作为用于检测上述卵中包含的过敏原的抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-11235)产生的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA3、杂交瘤(FERM BP-11236)产生的抗卵白蛋白单克隆抗体PDOA4。杂交瘤(FERM BP-11235)及杂交瘤(FERM BP-11236)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター(あて名：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室))(2010年2月22日)。
作为检测上述酪蛋白中包含的过敏原的抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-10263)产生的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN1、杂交瘤(FERM BP-10264)产生的抗αs1酪蛋白单克隆抗体Pas1CN2。杂交瘤(FERM BP-10263)及杂交瘤(FERM BP-10264)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2005年2月24日)。
作为检测上述乳清中包含的过敏原的抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-11237)产生的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG3、杂交瘤(FERM BP-11238)产生的抗β乳球蛋白单克隆抗体PβLG4。杂交瘤(FERM BP-11237)及杂交瘤(FERM BP-11238)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2010年2月22日)。
作为检测上述小麦中包含的过敏原的抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-10267)产生的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL1与杂交瘤(FERM BP-10268)产生的抗小麦麦醇溶蛋白单克隆抗体PGL2的组合。杂交瘤(FERM BP-10267)及杂交瘤(FERM BP-10268)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2005年2月24日)。
作为检测上述荞麦中包含的过敏原的抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-11241)产生的抗24kDa蛋白质单克隆抗体PBW5、杂交瘤(FERM BP-10273)产生的抗76kDa蛋白质单克隆抗体PBW2。杂交瘤(FERM BP-11241)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2010年2月22日)，杂交瘤(FERM BP-10273)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2005年2月24日)。
作为抗花生Ara h1单克隆抗体，可举出杂交瘤(FERM BP-11240)产生的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-5、杂交瘤(FERM BP-11239)产生的抗Ara h1蛋白质单克隆抗体PAh1-4。杂交瘤(FERM BP-11240)及杂交瘤(FERM BP-11239)已保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(2010年2月22日)。
作为抗大豆7S球蛋白单克隆抗体，可举出杂交瘤(NITE BP-02039)产生的PDSY1和杂交瘤(NITE BP-02040)产生的PDSY2。杂交瘤(NITE BP-02039)及杂交瘤(NITE BP-02040)已于2015年5月7日保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)(地址：千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)。
作为抗芝麻11S球蛋白单克隆抗体，可合适地举出杂交瘤(NITE BP-02041)产生的PDSE1和杂交瘤(NITE BP-02042)产生的PDSE2。杂交瘤(NITE BP-02041)及杂交瘤(NITEBP-02042)已于2015年5月7日保藏于NITE NPMD。
作为抗甲壳类原肌球蛋白单克隆抗体，可合适地举出杂交瘤(NITE BP-02173)产生的PDTM1和杂交瘤(NITE BP-02174)产生的PDTM2。杂交瘤(NITE BP-02173)及杂交瘤(NITE BP-02174)已于2015年12月9日保藏于NITE NPMD。
作为本发明的过敏原的检测方法中的检测精度，以液态样品中的食品蛋白质浓度计，可举出例如0.5ppm以上、优选0.1ppm以上、更优选0.05ppm以上、进一步优选0.01ppm以上。
作为使用前述免疫层析用过敏原的检测试剂盒时的溶剂，可例举水、(生理)盐水、PBS，优选PBS。另外，上述免疫层析用过敏原的检测试剂盒中，优选以成为液态样品的10～50％的浓度的方式具备FBS，也可具备硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。
以下，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的技术范围不受这些示例的限制。
[实施例1]
(各食品检测用免疫层析试纸条的制作)
制作与各食品对应的食品检测用免疫层析试纸条。
(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
1)胶体金标记抗体的制作
用2mM硼酸缓冲液(pH9.0)制备Pas1CN1单克隆抗体溶液，使其成为1mg/mL。向预先用0.2M碳酸钾溶液将pH调节成9.0的胶体金溶液(Sigma公司制)5mL中添加Pas1CN1单克隆抗体溶液500μl，于室温进行30分钟反应，然后添加10％BSA溶液635μL，进而进行15分钟反应。进行离心分离，用1％BSA溶液进行调节而使得OD525＝1.0。以成为68μL/cm2的方式将其涂布于玻璃棉制结合垫，使其干燥。
2)抗体固定化膜片的制作
用PBS制备Pas1CN2单克隆抗体溶液，使其成为4mg/mL，以直线状将其涂布于硝基纤维素膜片，并使其干燥。然后，用包含0.1％牛明胶的TBS，于37℃进行1小时封闭，然后用TBS洗涤，使其干燥。
3)免疫层析试纸条的组装
除了抗体固定化膜片以外，另行准备作为样品用载体部的玻璃棉制样品垫、液态样品吸收用的玻璃棉制吸收垫，按照样品垫、抗体固定化膜片、吸收垫的顺序分别贴合，制作免疫层析试纸条。
(2)β乳球蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PβLG3的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PβLG4的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作β乳球蛋白检测用免疫层析试纸条。
(3)卵白蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PDOA3的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PDOA4的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作卵白蛋白检测用免疫层析试纸条。
(4)小麦麦醇溶蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PGL1的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PGL2的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作小麦麦醇溶蛋白检测用免疫层析试纸条。
(5)荞麦过敏原检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PBW5的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PBW2的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作荞麦过敏原检测用免疫层析试纸条。
(6)花生Ara h1蛋白质检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PAh1-5的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PAh1-4的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作花生Ara h1蛋白质检测用免疫层析试纸条。
(7)大豆7S球蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PDSY2的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PDSY1的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作大豆7S球蛋白检测用免疫层析试纸条。
(8)芝麻11S球蛋白检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PDSE2的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PDSE1的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作大豆7S球蛋白检测用免疫层析试纸条。
(9)甲壳类蛋白质检测用免疫层析试纸条的制作
除了在1)胶体金标记抗体的制作中制备PDTM2的单克隆抗体溶液、在2)抗体固定化膜片的制作中制备PDTM1的单克隆抗体溶液之外，按照与上述(1)酪蛋白检测用免疫层析试纸条的制作同样的步骤，制作甲壳类蛋白质检测用免疫层析试纸条。
[液态样品的制作]
本实施例中，制备用于检测各食物过敏原的以下的各食品蛋白质。
(食品蛋白质的制备1)
(未加热食品蛋白质的制备)
1)未加热卵蛋白质的制备
未加热卵蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
2)未加热酪蛋白的制备
未加热酪蛋白蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
3)未加热乳清的制备
未加热乳清蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
4)未加热小麦蛋白质的制备
未加热小麦蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
5)未加热荞麦蛋白质的制备
未加热荞麦蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
6)未加热花生蛋白质的制备
未加热花生蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
7)未加热大豆蛋白质的制备
未加热大豆蛋白质由用粉碎机(Millser，日文为“ミルサー”)将大豆粉碎、并且用丙酮脱脂而得到的粉末制备。
8)未加热芝麻蛋白质的制备
未加热芝麻蛋白质由用粉碎机(Millser)将芝麻粉碎、并且用丙酮脱脂而得到的粉末制备。
9)未加热甲壳类蛋白质的制备
甲壳类蛋白质由按照“关于包含过敏性物质的食品的检查方法(参考)(2014年3月26日，日本消费者厅)”中记载的标准品标准的方法制作的粉末制备。
(食品蛋白质的制备2)
(加热食品蛋白质的制备)
将使上述各未加热食品蛋白质分别于75℃加热30分钟、于100℃加热10分钟、于120℃加热4分钟而得到的产物分别记为75℃加热卵蛋白质、100℃加热卵蛋白质、120℃加热卵蛋白质、75℃加热酪蛋白蛋白质、100℃加热酪蛋白蛋白质、120℃加热酪蛋白蛋白质、75℃加热乳清蛋白质、100℃加热乳清蛋白质、120℃加热乳清蛋白质、75℃加热小麦蛋白质、100℃加热小麦蛋白质、120℃加热小麦蛋白质、75℃加热荞麦蛋白质、100℃加热荞麦蛋白质、120℃加热荞麦蛋白质、75℃加热花生蛋白质、100℃加热花生蛋白质、120℃加热花生蛋白质、75℃加热大豆蛋白质、100℃加热大豆蛋白质、120℃加热大豆蛋白质、75℃加热芝麻蛋白质、100℃加热芝麻蛋白质、120℃加热芝麻蛋白质、75℃加热甲壳类蛋白质、100℃加热甲壳类蛋白质、120℃加热甲壳类蛋白质，对于各食品，进行75℃加热食品蛋白质、100℃加热食品蛋白质、120℃加热食品蛋白质的各加热食品蛋白质的制备。
(参考例1)
对于在进行食物过敏原的检测时，仅通过使用以往的检测法(试剂盒)的溶剂，在未进行提取处理、加热处理的情况下是否也能检测过敏原进行了研究。使用上述各未加热食品蛋白质及各加热食品蛋白质作为食品蛋白质，以终浓度成为0.1ppm的方式分别溶解于PBS 10mL中，作为由36种组成的液态样品组1。向所述的液态样品组1的各样品中添加FBS而使得FBS的终浓度成为30％，准备0.1mL所得的溶液，使用对应的食品检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将结果示于表1。
[表1]
(结果)
由表1表明，在使用了未加热卵蛋白质；75℃、100℃、及120℃加热卵蛋白质；及未加热芝麻蛋白质的模型液态样品中，未能检测到过敏原。
(参考例2)
对于在将现有方法中作为构成加热用提取液的成分而为人所知的作为非离子性表面活性剂中的一种的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)、SDS、和硫代硫酸钠添加至液态样品中时，在不进行加热处理的情况下是否也对过敏原的检测有贡献进行了研究。使用上述各未加热食品蛋白质及各加热食品蛋白质作为食品蛋白质，以终浓度成为0.5ppm的方式分别溶解于PBS 10mL中，作为由36种组成的液态样品组2。向所述液态样品组2中添加Tween20、SDS和硫代硫酸钠，使得终浓度成为0.2％Tween20、0.5％SDS、0.1％硫代硫酸钠，制备36种的添加有三种的液态样品组，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用对应的食品检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将结果示于表2。
[表2]
(结果)
由表2表明，即使在不进行提取·加热处理的情况下，在添加了0.2％Tween20、0.5％SDS和0.1％硫代硫酸钠的情况下，在全部的包括未加热卵蛋白质；75℃、100℃、及120℃加热卵蛋白质；及未加热芝麻蛋白质在内的上述由36种组成的添加有三种的液态样品组的各样品中，均能检测到过敏原。
[实施例2]
对于在不进行提取·加热处理的情况下，通过将上述Tween20、SDS、和硫代硫酸钠单独添加至液态样品中，是否对使用了免疫层析试纸条的过敏原的检测有贡献进行了研究。使用未加热卵蛋白质作为食品蛋白质，以终浓度成为0.5ppm的方式溶解于PBS 10mL中，制成未加热卵液态样品。准备4份所述的未加热卵液态样品，以终浓度分别成为0.2％Tween20、0.5％SDS、0.1％硫代硫酸钠的方式，制备添加了Tween20的未加热卵液态样品、添加了SDS的未加热卵液态样品、添加了硫代硫酸钠的未加热卵液态样品。另外，将在未加热卵液态样品中添加了Tween20、SDS、硫代硫酸钠中的全部的情况作为阳性对照。进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用对应的食品检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将结果示于表3。
[表3]
(结果)
由表3表明，在向液态样品中添加了终浓度为0.5％的SDS的情况下，能够检测到卵白蛋白，但在单独添加了Tween20或硫代硫酸钠的情况下，未能检测到过敏原。
[实施例3]
[SDS的最适浓度]
对液态样品中的SDS的最适浓度进行了研究。使用上述各未加热食品蛋白质9种作为食品蛋白质，以终浓度成为0.5ppm的方式分别溶解于PBS 10mL中，作为由9种组成的未加热食品液态样品组。以终浓度成为0.1、0.25、0.5、1.0、5.0％的方式，向所述的未加热食品液态样品组的各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用对应的食品检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理。将结果示于表4。
[表4]
(结果)
由表4表明，在液态样品中的SDS的终浓度为0.1、0.25、0.5％的情况下，在全部的未加热食品液态样品中，均检测到过敏原。尤其是确认了下述结果：SDS的浓度为0.1％时，在酪蛋白、小麦及花生中，检测灵敏度特别地提高，SDS的浓度为0.25％时，在卵及乳清中，检测灵敏度特别地提高，SDS的浓度为0.5％时，在芝麻中，检测灵敏度特别地提高。然而，SDS的终浓度为1％时，在乳清、荞麦和大豆中，未能检测到过敏原，SDS的终浓度为5％时，在全部的未加热食品液态样品中，均未能检测到过敏原。
[实施例4]
(擦拭液的研究1)
考虑到实际的工厂设备的情况，对使用生理盐水、火腿(日文为“ハム”)提取液、或纯水代替PBS的情况下能否检测过敏原进行了研究。以终浓度成为0.5ppm的方式将上述9种的未加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的未加热食品·生理盐水液态样品组1、9种的未加热食品·火腿提取液液态样品组1、和9种的未加热食品·纯水液态样品组1。以终浓度成为0.5ppm的方式将上述9种的100℃加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的100℃加热食品·生理盐水液态样品组1、9种的100℃加热食品·火腿提取液液态样品组1、和9种的100℃加热食品·纯水液态样品组1。进而，以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用对应的食品检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将使上述9种的未加热食品蛋白质和上述9种的100℃加热食品蛋白质混合在SDS/PBS中而得到的样品作为阳性对照。将结果示于表5。需要说明的是，火腿提取液通过下述方式制备：将相对于生理盐水而言为2％的重量的火腿供于混合机中，然后进行过滤。
[表5]
(结果)
由表5表明，确认了即使在将PBS替换为生理盐水、火腿提取液、纯水的情况下，若在展开液中添加0.25％SDS，则也能在全部的未加热或100℃加热的食品蛋白质的液态样品中检测到过敏原。
[实施例5]
(擦拭液的研究2)
以终浓度成为0.1ppm的方式，将上述(擦拭液的研究1)中的上述9种的未加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的未加热食品·生理盐水液态样品组2、9种的未加热食品·火腿提取液液态样品组2、和9种的未加热食品·纯水液态样品组2，以终浓度成为0.1ppm的方式将上述9种的100℃加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的100℃加热食品·生理盐水液态样品组2、9种的100℃加热食品·火腿提取液液态样品组2、和9种的100℃加热食品·纯水液态样品组2。进而，以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，进行与实施例4相同的研究。将结果示于表6。
[表6]
(结果)
由表6表明，确认了即使在使各食品蛋白质的浓度为0.1ppm时，即使在将液态样品的溶剂替换为生理盐水、火腿提取液、纯水的情况下，若添加0.25％SDS，则也能在上述的全部的未加热或100℃加热的食品蛋白质的液态样品中检测到过敏原。
[实施例6]
(擦拭液的研究3)
以终浓度成为0.05ppm的方式将上述(擦拭液的研究1)中的上述9种的未加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的未加热食品·生理盐水液态样品组3、9种的未加热食品·火腿提取液液态样品组3、和9种的未加热食品·纯水液态样品组3，以终浓度成为0.05ppm的方式将上述9种的100℃加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的100℃加热食品·生理盐水液态样品组3、9种的100℃加热食品·火腿提取液液态样品组3、和9种的100℃加热食品·纯水液态样品组3。进而，以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，进行与实施例4相同的研究。将结果示于表7。
[表7]
(结果)
由表7表明，即使在液态样品中的食品浓度为0.05ppm的情况下，在卵、酪蛋白、乳清、小麦、荞麦、花生、大豆、芝麻中也能检测到过敏原。从包含甲壳类的蛋白质的液态样品中未能检测到过敏原。
[实施例7]
(擦拭液的研究4)
以终浓度成为0.01ppm的方式将上述(擦拭液的研究1)中的上述9种的未加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的未加热食品·生理盐水液态样品组4、9种的未加热食品·火腿提取液液态样品组4、和9种的未加热食品·纯水液态样品组4，以终浓度成为0.01ppm的方式将上述9种的100℃加热食品蛋白质分别溶解于10mL的生理盐水、10mL的火腿提取液、10mL的纯水中，制备9种的100℃加热食品·生理盐水液态样品组4、9种的100℃加热食品·火腿提取液液态样品组4、和9种的100℃加热食品·纯水液态样品组4。进而，以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，进行与实施例4相同的研究。将结果示于表8。
[表8]
(结果)
由表8表明，即使在液态样品中的食品浓度为0.01ppm的情况下，在卵、小麦、荞麦、芝麻中也能检测到过敏原。
[实施例8]
分别以终浓度成为0.25％的方式向不含任何食品蛋白质的PBS、生理盐水、火腿提取液、纯水10mL中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用与各食品对应的食品检测用免疫层析试纸条，进行与实施例4相同的研究。将结果示于表9。
[表9]
(结果)
食品蛋白质的浓度为0ppm时，在全部的项目中均显示阴性。因此，确认了在本发明的方法中在不存在各食品蛋白质(过敏原)的情况下不会被检出。
[实施例9]
(洗涤水的研究1)
考虑到实际的食品工厂设备的情况，对在使用自来水洗涤设备的情况下能否检测到过敏原进行了研究。以终浓度成为0.1ppm、0.05ppm、0.01ppm的方式将未加热卵蛋白质分别溶解于纯水或自来水中，制备6种10mL的液态样品。另外，准备以终浓度成为0.25％的方式向不含卵蛋白质的纯水、自来水10mL中添加SDS而得到的样品作为阴性对照(0ppm)。以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用卵检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将结果示于表10。
[表10]
(结果)
由表10表明，对于纯水而言，在未加热卵蛋白质浓度为0.1ppm、0.05ppm、0.01ppm的情况下为阳性，但对于自来水而言，仅在0.1ppm的情况下为阳性，确认了在自来水中的灵敏度下降。
[实施例10]
(洗涤水的研究2)
对在向自来水中添加了硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸的情况下能否检测到过敏原进行了研究。以终浓度成为0.1ppm、0.05ppm、0.01ppm的方式向包含5％、2％、1％、0.1％硫代硫酸钠的自来水、包含5％、2％、1％、0.1％亚硫酸钠的自来水、包含0.1％、0.01％抗坏血酸的自来水中分别添加未加热卵蛋白质，制成30种的10mL的液态样品。将均不含卵蛋白质的自来水、包含5％、2％、1％、0.1％硫代硫酸钠的自来水、包含5％、2％、1％、0.1％亚硫酸钠的自来水、包含0.1％、0.01％抗坏血酸的自来水10mL作为阴性对照(0ppm)。以终浓度成为0.25％的方式向各样品中添加SDS，进而分别以FBS的终浓度成为30％的方式添加FBS，使用卵检测用免疫层析试纸条，供试于免疫层析处理，20分钟后判定结果。将结果示于表11。
[表11]
(结果)
由表11表明，在向自来水中添加了硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸的情况下，未加热卵蛋白质0.05ppm时全部为阳性。此外，确认了：在添加了1％或2％硫代硫酸钠的情况下，在添加了1％、2％或5％亚硫酸钠的情况下，在添加了0.1％抗坏血酸的情况下，能检测到0.01ppm的卵过敏原，为与表10所示的纯水的情况同等程度的检测灵敏度。另外，确认了在不存在未加热卵蛋白质的情况下，全部显示阴性，不会被检出。
[实施例11]
(一体化试剂盒的研究)
在卵白蛋白检测用免疫层析试纸条的前端的样品垫上，以相对于供于免疫层析的样品的容量(0.1mL)而言成为0.125～1％的方式涂布SDS，以相对于供于免疫层析的样品的容量(0.1mL)而言成为30％的方式涂布FBS，使其干燥，然后，将包含未加热卵蛋白质0.5ppm的PBS 0.1mL供于试验。将结果示于表12。
[表12]
| SDS(％) | 0.125 | 0.250 | 0.500 | 1.000 |
| 判定 | + | + | + | + |
(结果)
由表12表明，在0.125％、0.250％、0.500％、1.000％的情况下均显示阳性。
产业上的可利用性
能快速且高精度地检测在食品制造设备中的洗涤水、漂洗液中所含的过敏原的本发明的过敏原的检测方法、能用于该检测方法的本发明的过敏原的检测试剂盒在食品产业中有用。
由受理局填写
由国际局填写
Claims (9)
1.过敏原的检测方法，其特征在于，在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下对液态样品实施免疫层析处理。
2.如权利要求1所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品为擦拭溶液或洗涤水。
3.如权利要求1或2所述的过敏原的检测方法，其特征在于，采用液态样品在不进行提取处理或加热处理的情况下进行免疫层析处理。
4.如权利要求1～3中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，SDS浓度为0.05～2.0％。
5.如权利要求1～4中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品还包含至少10％的胎牛血清(FBS)。
6.如权利要求1～5中任一项所述的过敏原的检测方法，其特征在于，液态样品还包含硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。
7.过敏原检测试剂盒，其特征在于，具备展开支持体和用于制备液态样品的溶剂，所述展开支持体是在对改性和未改性的过敏原均能进行识别的单克隆抗体上结合有标记物的标记抗体、和对改性和未改性的过敏原均进行识别并且与所述结合有标记物的标记抗体识别不同的表位的单克隆抗体分别被固定于规定的位置而成的。
8.如权利要求7所述的过敏原检测试剂盒，其特征在于，还具备FBS。
9.如权利要求8所述的过敏原检测试剂盒，其特征在于，还具备硫代硫酸钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。
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