JP2006071509A - 食品成分抽出液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなる抽出液である。本発明の抽出液によれば、食品中の未変性蛋白質は勿論のこと、強く加熱変性され難溶化した蛋白質を可溶化し、抽出することが可能となり、加工食品中のアレルゲンなどの蛋白質を見落とす危険性が著しく低減し、食物アレルギーを防止することができるという格別の効果を奏する。
Description
従って、特に表示が義務づけられた特定原材料について、その表示を検証する測定キットが必要となる。
係る問題点から、本願出願人は、特定原材料とされた食物に含まれる蛋白質全般を高感度で測定しうる測定キットの発明をなし、この発明をもとに定量性のあるエンザイムイムノアッセイ法(エライザ法)による特定原材料測定キットを作製した。
即ち、本発明に係る食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなり、特に還元剤としてトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを使用し、可溶化剤としてドデシル硫酸塩及び/又は尿素を使用するのが好ましい。
上記の還元剤としては、食品成分検出に使用される方法に悪影響を与えない還元剤であれば何れの還元剤も使用し得るが、好ましくは2−メルカプトエタノール(2-Mercaptoethanol、以下2−MEという)、ジチオスレイトール(Dithiothreitol、以下DTTという)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine、以下TCEPという)などが使用され、これらの還元剤は2種以上を併用してもよい。
これらの還元剤のうち、2−MEは異臭を有し毒性や引火性がある危険物であり、食品工場等の現場では使用しづらいため、望ましくは異臭、毒性及び引火性がなく危険物でないDTTやTCEPが使用され、より望ましくは、異臭がより少なく、より還元性の高いTCEPが使用される。
還元剤の使用量は、検体である食品の態様(例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など)、使用する還元剤種などにより適宜調整することができる。例えば、検体の20倍の抽出液を使用する場合(即ち、検体1gに対して19mlの抽出液を使用する場合等)は、抽出液において、還元剤として2−MEを使用した場合に、通常0.1〜7w/v%(以下、%は特に限定のない限り、w/v%であり、vは抽出液の容量である)、好ましくは0.2〜2%、より好ましくは0.3〜0.7%程度に調整される。DTTを使用した場合には、通常5〜35mM、好ましくは10〜30mM、より好ましくは15〜25mM程度に調整される。TCEPを使用した場合には、通常1〜20mM、好ましくは5〜15mM、より好ましくは8〜12mM程度に調整される。
還元剤が、上記範囲の下限未満であると、変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると臭気などで作業性が劣るおそれがある。
可溶化剤の使用量は、検体である食品の態様(例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など)、使用する可溶化剤種などにより適宜調整することができる。例えば、SDSを使用した場合には、通常0.1〜1.5%、好ましくは0.2〜1.0%、より好ましくは0.3〜0.6%程度に調整される。また尿素を使用した場合には、通常1〜10mM、好ましくは2〜7mM、より好ましくは3〜5mM程度に調整される。
可溶化剤が、上記の範囲の下限未満であるときは蛋白質の可溶化が不足して変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると泡立ちなどで作業性が劣るおそれがある。
液性としては、蛋白質の抽出効率などを勘案して適宜調整することができるが、通常pH6〜8程度に調整される。
操作温度は通常室温程度で行われるが、加熱変性が著しい場合には加温(40℃程度)又は加熱(80〜100℃程度)してもよい。操作時間は、検体である食品の態様(例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など)、使用する還元剤種及び可溶化剤種、操作温度などにより適宜調整し得るが、10分〜24時間程度で行うことができる。
なお、過度の操作条件を使用すると、蛋白質そのものがバラバラとなり、蛋白質がアミノ酸レベルに分解されるおそれがあり、由来蛋白質を特定することが困難になるので、係る問題点を生じない条件とすることが好ましい。
本発明の抽出液で抽出した液は、従来の蛋白質測定方法に適用することにより蛋白質含量の測定などに使用することができる。
上記の抽出液を使用した抗体の調製は常法に準じて行えばよい。
加工食品への抽出操作により、蛋白質がどれだけ抽出されたのかを検定した。試験の抽出操作は、以下のように行われた。
測定対象となるハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液PBS(pH7.0)(SDS:1%、2-ME:7%を含有)19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩(12時間以上)振とう(90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復)しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性(pH 6.0〜8.0)となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった(なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた)。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして蛋白質含有測定キット(2-D Quant Kit: Amersham Biosciences社製)で手順に従い、最終的には480nmの吸光度を読み、同時に準備した標準曲線をもとに抽出蛋白質の量を求めた。
尚、蛋白定量法としてRC.DC.ProteinAssay(Bio-Rad社製)を使用した場合も同様の傾向であった。
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例3
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例4
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例6
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例7
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例9
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例10
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例12
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例13
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
比較例1
実施例1において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(可溶化剤及び還元剤を非含有)を使用した以外は、同様に測定した。
(1)抗体の調製
本抽出液を用いてのエライザ法での特定原材料蛋白質の定量に先立ち、まず本抽出法で抽出された変性蛋白質にも反応できる抗体を準備した。
この抗体の作製に使用する蛋白質抗原の準備は以下のように行われた。測定対象の食品1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩(12時間以上)振とう(90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復)しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性(pH 6.0〜8.0)となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった(なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた)。なお、操作温度は室温程度とした。
上記で得られた、抽出液を抗原としてウサギ又はマウスに、抗体を得る常法に従い免疫し、特定原材料由来蛋白質検出に用いる抗体を得、エライザ法による定量に使用した。
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。その具体的抽出操作は、以下のように行った。
添加回収試験はハードビスケットで行った。具体的には、小麦粉130g、水10g、砂糖50g、サラダ油70gに、一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質(卵:最終製品濃度10ppm)を添加し、180℃12分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液PBS(pH7.0)(SDS:1%、2-ME:7%を含有)19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩(12時間以上)振とう(90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復)しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性(pH 6.0〜8.0)となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった(なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた)。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして、エライザ法による測定に使用した。
卵蛋白質検出用エライザのプレートを準備するために、卵抗体(10μg/ml)の100μl をエライザプレート(Nunc 社製)に分注し、4℃で一晩コーティングし、洗浄液(150mM NaCl と0.05%Tween20 加20mM トリス塩酸緩衝液、pH7.4)で洗浄し、ブロッキング溶液(0.1%RSA(シグマ社製)加トリス塩酸緩衝液、pH7.4)で25℃1時間ブロッキングした。
係るプレートに、試料として上記抽出液ならびに同様の抽出操作を施した標準液(0ng/ml〜50ng/ml)を各ウェルに100μlずつ加え、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で(20〜25℃)で1時間静置し反応させた。
反応後、上記で添加した液を捨て、各ウェルに洗浄液250μlずつを入れ、これを捨てる操作を5回繰り返し、洗浄を行った。次いで、各ウェルにビオチン結合抗体液(抗卵抗体をビオチン化したもの)を、各ウェル100μlずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で(20〜25℃)で1時間静置し反応させた。反応後、ビオチン結合抗体液を捨て、各ウェルに洗浄液250μlずつを入れ、これを捨てる操作を5回繰り返し、洗浄を行った。
各ウェルに、発色酵素(ペルオキシダーゼ)−ストレプトアビジン結合物(ペルオキシダーゼをストレプトアビジンと結合させたもの)溶液を、各ウェルに100μlずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で(20〜25℃)で、30分間静置し反応させた。反応終了後、発色酵素−ストレプトアビジン結合物溶液を捨て、各ウェルに洗浄液250μlずつを入れ、これを捨てる操作を5回繰り返し、同様に洗浄を行った。各ウェルに発色基質としてのTMBを100μlずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で(20〜25℃)で20分間静置し遮光条件下で発色させた。各ウェルに反応停止液(1M H2SO4)を100μlずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し発色を停止した。攪拌後プレートリーダーで、測定波長450nm の吸光度を測定した。
なお、検量線(吸光度と卵濃度の関係)を得るために、段階希釈により準備した数段階の卵蛋白質希釈液を同じプレートにて同時期に添加反応させ、吸光度を測定した。この検量線と試料の吸光度測定で得られた値より試料中の卵濃度(ppm)を決定し、最初の添加量に対する回収%を求めた。
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例16
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例17
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例19
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例20
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例22
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例23
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例25
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例26
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
比較例2
実施例14において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(可溶化剤及び還元剤を非含有)を使用した以外は、同様に測定した。
なお、卵検出用エライザ法に代えて、下記の蛋白質検出キットを使用した場合の発色酵素、発色基質、反応停止液、測定波長は以下の通りであった。
牛乳:(発色酵素としてホースラディッシュペルオキシダーゼ、発色基質としてTMBを使用、反応停止液として1M H2SO4を使用、測定波長450nm)
落花生・そば:(発色酵素としてアルカリフォスファターゼ、発色基質としてpNPPを使用、反応停止液として1M NaOHを使用、測定波長405nm)
ウェスタンブロット法による定性試験を行い、各抽出液による対象蛋白質の各バンドの有無を目視により調べた。
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。具体的抽出操作は、前記エライザ法と同様に以下のように行った。
即ち、小麦粉130g、水10g、砂糖50g、サラダ油70gに一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質(卵:最終製品濃度10ppm)を添加し、180℃12分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液PBS(pH7.0)(SDS:1%、2-ME:7%を含有)19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩(12時間以上)振とう(90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復)しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性(pH 6.0〜8.0)となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった(なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた)。操作温度は室温程度とした。
なお、牛乳を測定対象にした添加回収試験も同様に行い各レーンにおける対象蛋白質(カゼイン及びベーターラクトグロブリン)のバンドの有無を調べ同様の結果を得た。
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例29
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例30
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、2-ME:0.5%を含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例32
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例33
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、DTT:20mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例35
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例36
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、TCEP:10mMを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.5%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例38
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.3%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
実施例39
実施例27において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(SDS:0.1%、TCEP:10mM、尿素4Mを含有)を使用した以外は、同様に測定した。
比較例3
実施例24において、食品成分抽出液としてPBS(pH7.0)(可溶化剤及び還元剤を非含有)を使用した以外は、同様に測定した。
Claims (2)
- 還元剤及び可溶化剤を含有することを特徴とする食品成分抽出液。
- 還元剤がトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、可溶化剤がドデシル硫酸塩及び/又は尿素である請求項1記載の食品成分抽出液。
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