JP2020020759A - イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法及びそのキット - Google Patents

Abstract

【課題】焼成した小麦粉を含む食品であっても、迅速かつ精度よく食物アレルゲンを検出でき、かつ偽陽性反応を抑制することができる方法を提供すること。【解決手段】変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む凍結乾燥試薬を前記展開液の調製に用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、イムノクロマト法によるアレルゲン検出方法及びそのためのキットに関し、より詳しくは、イムノクロマト法において、偽陽性反応を抑制する検出方法及びそのためのキットに関する。

現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題が生じている。アナフィラキシーショック等の生体反応は死に至ることもあり、未然に処置を施す必要がある。また、表示等を通じて消費者へ情報提供することの必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示をすることについて合意し、各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起こした実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められ（２００２年４月より施行）、現在はその対象となる食品が２７品目となっている。

アレルゲンを迅速で簡易に検出するため、抗原−抗体による特異的反応を利用して特定の抗原又は抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法としては、試料中の被検出物質を、微粒子に感作させた抗体又は抗原と免疫反応により結合させ、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便な免疫測定法であり、特に目視判定が可能である点で一般的に用いられている方法である。

また、試料中の被検出物質に、放射性同位元素、酵素又は蛍光物質からなる標識物質により標識した抗体又は抗原を免疫反応により結合させ、この結合した標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測定法あるいは蛍光免疫測定法も採用されている。これらの免疫測定法では、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く使われている。これらのうち、いわゆるサンドイッチ型反応の測定法として、イムノクロマトグラフィー法が知られており抗原抗体反応に起因する高い特異性を有する種々のアレルゲン検出キットが販売されている。

しかしながら、加工食品の場合、加熱や加圧といった過酷な条件下で製造されるものが多く、そのような食品では検査対象のアレルゲンタンパク質が不溶化し、従来の抽出法では抽出されにくいという問題があった。これらの抽出効率の悪さに起因して正確な検査結果が得られない等の問題点があった。

水難溶性のタンパク質又は難抽出状態にあるタンパク質を、加工食品から効率的に抽出する方法として高濃度（０．５〜１０％）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、還元剤の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）とを含有する水性溶媒を添加後、５分間加熱するという煮沸工程で可溶化して抽出する方法が知られている（特許文献１参照）。

しかしこの方法では、還元剤である２−ＭＥが有する遊離のチオール基が、抗体を標識した金属コロイドやラテックスなどの粒子を凝集させるため、イムノクロマト法に適用した場合に、偽陽性反応が多発することが知られている（特許文献２参照）。

上述した偽陽性反応を抑える方法として、還元剤として２−ＭＥに代えて、亜硫酸塩又はトリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）を用い抽出する方法が知られている（特許文献３、４参照）。

また、アルキル硫酸塩と尿素とシステイン、又はアルキル硫酸塩と尿素とシステインとジチオスレイトールを含有することを特徴とする食品からのアレルギー物質の抽出水溶液が知られている（特許文献５参照）。

そしてまた、液状サンプルにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下にイムノクロマト処理を施すことにより、製造現場での拭き取り溶液や洗浄液等の液状サンプル中のアレルゲンを迅速にかつ精度よく検出することができることが知られている（特許文献６参照）。その際、液状サンプル中に、亜硫酸ナトリウムを添加することにより、検出感度を向上させることができる。

特開２００５−１０６６２９号公報 特開２００８−２９８６６４号公報 特開２００９−１３３７１２号公報 特開２０１０−００２３６９号公報 特開２０１０−０７８４４８号公報 特開２０１７−１２９４２２号公報

しかしながら、焼成した小麦粉を含む食品のアレルゲンを、従来の方法を用いて検出したとしても、その原因は不明ではあるが、偽陽性反応を抑制することができないという問題に直面した。
本発明は、焼成した小麦粉を含む食品であっても、簡便で精度のよく食品中のアレルゲンを検出でき、しかも偽陽性反応を抑制できる方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、食物等の被検試料中に含まれるアレルゲンの抽出液ではなく、アレルゲンと金コロイド標識抗体との抗原抗体複合体を展開支持体上に展開させるための展開液の調製に用いる凍結乾燥試薬に、亜硫酸塩及び／又はシステイン等の還元剤を含ませることにより課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む凍結乾燥試薬を前記展開液の調製に用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法、
（２）前記凍結乾燥試薬に、さらにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む（１）に記載のアレルゲン検出方法、
（３）変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む展開液調製用の凍結乾燥試薬と、
前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、
アレルゲンを含む食品等の被検試料から変性及び未変性のアレルゲンを抽出するための抽出液と、
抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、
を備えたことを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット、
（４）前記凍結乾燥試薬に、さらにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む（３）に記載の検出キット、
に関する。

アレルゲンの抽出液ではなく、展開液を調製するための凍結乾燥試薬に亜硫酸塩及び／システインを含ませることにより、より安定的にそれらの還元力を引き出すことができ、よって従来の方法では偽陽性反応を起こすおそれのある焼成した小麦粉を含む食品においても、その偽陽性反応を抑制し、精度よくしかも簡便に食物中のアレルゲンを検出することができる。

本発明のアレルゲンの検出方法は、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いるイムノクロマト法による検出方法であり、該イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法とは、標識物である金コロイドを結合した標識抗体を移動相とし、前記標識抗体と異なるアレルゲンのエピトープを認識するモノクローナル抗体を固定相とし、アレルゲンと前記金コロイド標識抗体の複合体が移動して固定相の抗体に抗原抗体反応により結合することにより、着色ラインの有無等によりアレルゲンを検出することができる方法をいう。

本発明の検出方法に用いられる被検試料は、アレルゲンを含有する可能性がある試料であれば、特に限定されないが、具体的には、アレルゲンが含まれる可能性がある食品等を例示することができ、該食品等には、種々の食品のほか、該食品を製造するために用いられる原料、該食品を製造するために使用された装置に残るカス、沈殿物等の残留物、該装置を洗浄した洗浄液、該洗浄液を取り除くために使用されたすすぎ液、該食品を包装した包装紙や包装容器等の食品中に存在するアレルゲンが二次的に存在する可能性がある試料を含めることができる。中でも、パン類、パン粉、パン粉を使用したフライ類、クッキー等の焼き菓子等の小麦粉を焼成して作られる食品等を好適に例示することができる。被検試料が固体の場合は、ミルサー、フードプロセッサーのような粉砕機で粉砕して使用するのが好ましい。

被検試料からアレルゲンを取り出す抽出液は、被検試料から効率よくアレルゲンを抽出できる媒体であれば、特に制限されないが、具体的には、非イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、陰イオン性界面活性剤から選ばれる一種又は二種以上を含む水溶液を例示することができる。

前記非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができ、具体的にはモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を好適に例示することができる。前記非イオン性界面活性剤の抽出液中の濃度としては、０．０１〜５．０w/v％が好ましく、０．０５〜３．０w/v％がより好ましく、０．１〜２．５w/v％がさらに好ましい。

前記チオ硫酸塩としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸アンモニウム等を挙げることができる。抽出液中の前記チオ硫酸塩の濃度としては、０．０１〜５．０w/v％が好ましく、０．０５〜１．０w/v％がより好ましく、０．０７５％〜０．５w/v％がさらに好ましく、０．０８〜０．２w/v％が特に好ましい。

前記陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステル塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩などを挙げることができ、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate；ＳＤＳ）を例示することができる。抽出液中の前記陰イオン性界面活性剤の濃度としては、０．０１〜１．０w/v％が好ましく、０．０５％〜０．５w/v％がより好ましい。

細かく粉砕された被検試料は、抽出液と混合されて加熱されることで、変性及び未変性のアレルゲンが抽出され、測定サンプルとすることができる。加熱する時間としては、被検試料から変性及び未変性のアレルゲンを抽出することができる限りにおいて特に制限されないが、例えば、１００℃にて２〜２０分間が好ましく、５〜１５分間がより好ましく、８〜１２分間がさらに好ましい。また、９０℃にて１５〜４５分間や、８０℃にて３０〜６０分間等の加熱時間によっても同等の効果を得ることができる。
加熱方法も、所定の温度を抽出液に供給できれば特に制限されず、具体的には、湯浴中で加熱する方法、マイクロ波を照射する方法等を例示することができる。
加熱処理後、ろ過、放置後のデカンテーション、又は遠心分離により得られた上清を測定サンプルとすることができる。

本発明におけるアレルゲンとしては、食品中に含まれる食物アレルゲンを好適に例示することができ、具体的には、卵、カゼイン、ホエー、小麦、そば、落花生、大豆、ごま、甲殻類等に含まれるアレルゲンを挙げることができる。

前記卵に含まれるアレルゲンとしては、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド等を挙げることができるが、卵全体に存在し、含有量が一番多い点でオボアルブミンが好ましい。前記カゼインにおけるアレルゲンとしては、カゼインの主要タンパク質である、αｓ１カゼインを挙げることができ、前記ホエーにおけるアレルゲンとしては、ホエーの主要タンパク質である、βラクトグロブリンを挙げることができる。前記小麦に含まれるアレルゲンとしては、小麦の主要タンパク質である小麦グリアジンを挙げることができる。前記そばに含まれるアレルゲンとしては、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質等のそばアレルゲンを挙げることができる。前記落花生に含まれるアレルゲンとしては、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１を挙げることができる。前記大豆に含まれるアレルゲンとしては、大豆の主要アレルゲンである大豆７Ｓグロブリンを挙げることができる。前記ごまに含まれるアレルゲンとしては、ごまの主要アレルゲンであるごま１１Ｓグロブリンを挙げることができる。前記甲殻類に含まれるアレルゲンとしては、トロポミオシンを挙げることができる。

本発明に用いる標識抗体としては、モノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を好適に挙げることができる。係る金コロイド標識抗体の作製方法は従来公知の方法を含め特に制限されないが、例えば、ｐＨ９．０に調整した金コロイド溶液に、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）でモノクローナル抗体を溶解した溶液を加え、室温にて反応させた後、１０％ＢＳＡ溶液を加えてさらに反応させ、遠心分離する方法を挙げることができる。

前記アレルゲンをイムノクロマト法により検出するために用いられる抗体としては、前記オボアルブミン、αｓ１カゼイン、βラクトグロブリン、小麦グリアジン、そばアレルゲン、Ａｒａ ｈ１、大豆７Ｓグロブリン、ごま１１Ｓグロブリン、甲殻類に含まれるトロポミオシンアレルゲン等の各アレルゲンを特異的に認識する抗体を挙げることができ、前記各アレルゲンにおける異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の組合せが好ましい。

前記卵に含まれるアレルゲンを検出するための抗体としては、ハイブリドーマ(FERM-BP-11235)が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ３や、ハイブリドーマ(FERM-BP-11236)が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ４を挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-11235)、及びハイブリドーマ(FERM-BP-11236)は、２０１０年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

前記カゼインに含まれるアレルゲンを検出する抗体としては、ハイブリドーマ(FERM-BP-10263)が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１や、ハイブリドーマ(FERM-BP-10264)が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２を挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-10263)及びハイブリドーマ(FERM-BP-10264)は、２００５年２月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

前記ホエーに含まれるアレルゲンを検出する抗体としては、ハイブリドーマ(FERM-BP-11237)が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ３や、ハイブリドーマ(FERM-BP-11238)が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰβＬＧ４を挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-11237)及びハイブリドーマ(FERM-BP-11238)は、２０１０年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

前記小麦に含まれるアレルゲンを検出する抗体としては、ハイブリドーマ(FERM BP-10267)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体ＰＧＬ１と、ハイブリドーマ(FERM-BP-10268)が産生する抗小麦グリアジンモノクロナール抗体ＰＧＬ２との組合せを挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-10267)、及びハイブリドーマ(FERM-BP-10268)は、２００５年２月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

前記そばに含まれるアレルゲンを検出する抗体としては、ハイブリドーマ(FERM-BP-11241)が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ５や、ハイブリドーマ(FERM-BP-10273)が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２を挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-11241)は、２０１０年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託され、ハイブリドーマ(FERM-BP-10273)は、２００５年２月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

抗落花生Ａｒａ ｈ１モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ(FERM-BP-11240)が産生する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−５や、ハイブリドーマ(FERM-BP-11239)が産生する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−４を挙げることができる。ハイブリドーマ(FERM-BP-11240)及びハイブリドーマ(FERM-BP-11239)は、２０１０年２月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

抗大豆７Ｓグロブリンモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ(NITE P-02039)が産生するＰＤＳＹ１と、ハイブリドーマ(NITE P-02040)が産生するＰＤＳＹ２を挙げることができる。ハイブリドーマ(NITE P-02039)及びハイブリドーマ(NITE P-02040)は、２０１５年５月７日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託されている。

抗ごま１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ(NITE P-02041)が産生するＰＤＳＥ１と、ハイブリドーマ(NITE P-02042)が産生するＰＤＳＥ２を好適に挙げることができる。ハイブリドーマ(NITE P-02041)、及びハイブリドーマ(NITE P-02042)は、２０１５年５月７日付でＮＩＴＥ ＮＰＭＤに受託されている。

抗甲殻類トロポミオシンモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ(NITE AP-02173)が産生するＰＤＴＭ１と、ハイブリドーマ(NITE AP-02174)が産生するＰＤＴＭ２を好適に挙げることができる。ハイブリドーマ(NITE AP-02173)、及びハイブリドーマ(NITE AP-02174)は、２０１５年１２月９日付でＮＩＴＥ ＮＰＭＤに受領されている。

本発明に用いられる展開支持体は、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を含む緩衝液を、ニトロセルロースメンブレン等の支持体に直線状に塗布し乾燥させた後、ブロッキング処理することにより作製することができる。

前記展開支持体は、供試サンプルを担持させることができるガラスウール製のサンプルパッド等のサンプル用担体部及び展開支持体の他端に展開液を吸収するガラスウール製吸収パッド等の吸収体とともにイムノクロマトストリップを形成し、該ストリップ上に前記サンプル用担体部、前記展開支持体、前記吸収体の順で連結される。

本発明に用いられる展開液は、前記測定サンプルと、前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインとを含む凍結乾燥試薬から調製される。
また、展開液中には、抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑える試薬を共存させておくのが好ましく、そのような試薬として、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を好ましく挙げることができる。ＦＢＳ等の非特異反応を抑える試薬は、最終的に展開液中に含まれれば、その添加方法は特に制限されず、例えば、測定サンプルと上記凍結乾燥試薬から調製した展開液に添加する方法等を挙げることができるが、凍結乾燥試薬中に含ませるのが保存安定性、操作性を考えると好ましい。
ＦＢＳは、展開液中に少なくとも１０v/v％含まれているのが好ましく、少なくとも２０v/v％、少なくとも３０v/v％含まれているのがさらに好ましく、少なくとも４０v/v％含まれているのが特に好ましく、少なくとも５０v/v％含まれているのがより一層好ましい。ＦＢＳを凍結乾燥試薬中に含ませた場合には、測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して凍結乾燥前のＦＢＳの容量を基に、ＦＢＳが少なくとも１０v/v％含まれているのが好ましく、少なくとも２０v/v％、少なくとも３０v/v％含まれているのがさらに好ましく、少なくとも４０v/v％含まれているのが特に好ましく、少なくとも５０v/v％含まれているのがより一層好ましい。前記展開液におけるＦＢＳ濃度が１０v/v％未満の場合、非特異反応を生じやすくなるおそれがある。

用いる亜硫酸塩として、具体的には、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄等を例示することができるが、中でも食品添加物として慣用されている亜硫酸ナトリウムを好ましく例示することができる。これらの亜硫酸塩は２種以上を併用することができる。システインは、ラセミ体、光学活性体のいずれも使用することができ、また、中性分子、カルボン酸の塩、又はアミノ基の塩としても使用することができる。これら亜硫酸塩やシステインは、凍結乾燥された固体状態で保存されることになるので、溶液等の液体状態で保存される場合に比べてきわめて安定である。
また、測定サンプルを作製する際に用いる抽出液中に亜硫酸塩及び／又はシステインを混合した場合、該抽出液を長期保存することなく調製した直後に使用して測定サンプルを作製し、該測定サンプルと、亜硫酸塩及び／又はシステインを含まない凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときに偽陽性反応を抑制できるとの当初の予想に反して、亜硫酸塩及び／又はシステインを凍結乾燥試薬に含ませた場合に比して、十分に偽陽性反応を抑制することができなかった。

用いられる亜硫酸塩、システインの量は、それぞれを単独で使用した場合に、使用する展開液に対して、２．５w/v％以上用いるのが好ましく、１０w/v％以上用いるのがさらに好ましい。亜硫酸塩及びシステインを共に用いた場合には、使用する展開液全体に対して、亜硫酸塩を０．５w/v％以上、システインを０．５w/v％以上用いるのが好ましく、亜硫酸塩を１．５w/v％以上、システインを０．６２５w/v％以上用いるのがさらに好ましい。なお、システインを塩として使用した場合の使用量は、中性分子に換算した使用量を表すこととする。

展開液中には、必要に応じて、ゼラチン、カゼイン、ウシ血清アルブミン、アラビアゴム、デキストラン、でんぷん、メチルセルロース、ポリリジン、ポリプロリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド／ビニルピロリドン共重合体（ジメチルアクリルアミドの共重合割合が５０モル％以下のもの）、ビニルアルコール／ビニルピロリドン共重合体（ビニルアルコールの共重合割合が５０モル％以下のもの）、酢酸ビニル／ビニルピロリドン共重合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ」シリーズ）、グリコーゲン、キチン誘導体、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、ポリデキストロース、アルギン酸、イヌリン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カードラン、コンドロイチン、フコダイン、プルラン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース（ＣＥＣ）、カルボキシプロピルセルロース等のカルボキシル基を有する水溶性セルロース誘導体、硫酸セルロース、リン酸セルロース等の酸性基を有する水溶性セルロース誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース等のヒドロキシアルキル基を有する水溶性セルロース誘導体、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース、プロピルセルロース、メチルエチルセルロース等のアルキル化されたセルロース誘導体、更にこれらのナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属塩や、カルシウム塩やマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を混合することができる。これらの成分は、凍結乾燥試薬中に含めてもよく、展開液に添加してもよい。

前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む凍結乾燥試薬は、それぞれ必要量の前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを混合して溶液とし、予備凍結し、低温で減圧吸引する通常の方法で凍結乾燥することができる。ＦＢＳを凍結乾燥試薬中に含ませる場合には、上記溶液にＦＢＳを混合させればよい。

なお、本発明に用いられる抽出水溶液のベースとなる溶媒や抽出水溶液の希釈液としては、分析対象であるアレルギー物質の免疫学的活性を損なわない限り、水に加えて他の成分を含んでもよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ヘペス緩衝液、メス緩衝液等の緩衝液や、生理食塩水を挙げることができる。また、前記溶媒や希釈液には、必要に応じて、タンパク質の安定化やタンパク質の抽出効率を向上させるために一般的に使用することのできる成分、例えば、金属イオン、酸化防止剤、キレート剤、吸着剤、グリセリン、ソルビトール、プロテアーゼインヒビター等を、抽出されるタンパク質の免疫学的活性を損なわない範囲で配合することができる。

本発明のイムノクロマト法用アレルゲンの検出キットとしては、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識することができるモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む展開液用調製用の凍結乾燥試薬と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から変性及び未変性のアレルゲンを抽出するための抽出液と、抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体とを備えるイムノクロマト法用アレルゲン検出キットであって、製造年月日から１年以上常温保存した場合においても、実用性に耐えうる精度・安定性を有するものが望ましい。
また、凍結乾燥試薬中には、抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑える試薬を共存させておくのが好ましく、そのような試薬として、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を好ましく挙げることができる。

凍結乾燥試薬は、凍結乾燥後、不活性ガス下に密封して保存されるのが好ましく、そのように保存することにより室温でも安定に長期間保存が可能となる。したがって、凍結乾燥試薬は、密封可能な容器に収納されるのが好ましい。
凍結乾燥試薬は、抽出液によって抽出されたアレルゲンを含む測定サンプルと混合して展開液とし使用されるので、凍結乾燥試薬を収納する容器は、操作上、凍結乾燥試薬と測定サンプルを混合できて、その後、展開液にキットに含まれる展開支持体が固定されているイムノクロマトストリップを浸漬できる形状の容器が好ましく、具体的には、遠沈管等を例示することができる。

本発明のアレルゲン検出キットを用いたアレルゲンの検出方法は、備え付けの抽出液により、食品等の被検試料からアレルゲンを抽出して測定サンプルを調製し、その後、凍結乾燥試薬と測定サンプルを混合して展開液を形成し、該展開液に、展開支持体とサンプル用担体を備えたイムノクロマトストリップを展開液に浸漬して、金コロイドの集積による発色を目視により確認するか、又は測定機器により発色強度を読み取ることにより、被検試料中にアレルゲンが含まれているかどうかを判定するという方法になり、非常に簡便であり、被検試料からのアレルゲンの抽出時に、加熱する熱源だけがあれば、製造現場で簡単にアレルゲンの有無を判定することができる。

以上のような方法及び検出キットを用いて食品等の被検試料中のアレルゲンを検出した場合に、従来、アレルゲンが含まれていないにもかかわらず、陽性反応が検出されたような食品であっても、偽陽性反応を起こさず、正確に判定できるために、食品等を生産する工場等において生産効率を向上させることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［ごまアレルゲンを検出するための展開液調製用凍結乾燥試薬及びイムノクロマトストリップの作製方法とそれらを用いた測定］
１．展開液調製用凍結乾燥試薬の作製
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＤＳＥ２(NITE AP-02042)のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調整した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍＬにＭＡｂ溶液を５００μＬ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μＬ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ_５２５＝１．０になるよう調整した。

（２）凍結乾燥試薬の作製
２．０ｍＬ容のマイクロチューブに上記（１）のＯＤを調整した金コロイド標識抗体を２０μＬ、展開液としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬ加えたものを基本展開液としてさらに亜硫酸ナトリウムを基本展開液に添加し、さらに予備凍結したのち凍結乾燥機により一晩凍結乾燥し、凍結乾燥試薬を作製した。亜硫酸ナトリウムを、測定サンプルと該凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して０．５w/v％となるように基本展開液に添加した。

２．イムノクロマトストリップの作製
（１）展開支持体の作製
リン酸バッファー（ＰＢＳ）で４ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＤＳＥ１(NITE AP-02041)のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むトリス緩衝液（ＴＢＳ）で３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。

（２）イムノクロマトストリップの組立
上記（１）で調製した展開支持体に加えて、展開液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、展開液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、展開支持体、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップを作製した。

３．測定サンプルの調製
（１）ごまタンパク質含有サンプルの調製
ごまをミルサーで粉砕し、アセトンで脱脂したごま粉末１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、０．５w/v％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１w/v％チオ硫酸ナトリウム、０．２w/v％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が含まれるＰＢＳ溶液（基本抽出液）を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過して上清を得た。この溶液のタンパク質濃度を2-D Quant Kit（ＧＥヘルスケア製）で測定し、タンパク質濃度が２５ｐｐｂとなるように基本抽出液で調整し測定サンプルとした。

（２）食品測定サンプル（パン粉抽出物）の調製
ごまが含まれないパン粉１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記（１）で調製した基本抽出液１９ｍＬを加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱し冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を測定サンプルとした。

４．イムノクロマト法による検出の確認
前記１．で調製した凍結乾燥試薬に上記３．で調製した測定サンプルを１００μＬ加え溶解して展開液を作製したのち、前記２．で作製したイムノクロマトストリップを挿し込み展開液を吸い上げ２０分後に検出ラインの状態を目視で判定し、ラインの発色強度を測定した。その結果を表１に示す。表１中、検出ラインの強い方から順に＋、＋Ｗ、＋−と表記し、陰性を−表記とした。また、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス製：C10066-10）を用いて検出ラインの発色強度（ｍＡＢＳ）を測定した。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して２．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を作製する以外、実施例１と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを、測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して０．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を作製する以外、実施例１と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムに代わりＬ−システインを、測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液とした全体に対して２．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を作製する以外、実施例１と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを０．５w/v％、さらにＬ−システインを０．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を作製する以外、実施例１と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％、さらにＬ−システインを２．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を作製する以外、実施例１と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。

［比較例１］
［実施例１］１．（２）で調製した凍結乾燥試薬の代わりに、［実施例１］１．（２）で調製した亜硫酸ナトリウムを含まない基本展開液を凍結乾燥した試薬を用いる以外、［実施例１］と同様にして測定を行った。その結果を表１に示す。
なお、上記亜硫酸ナトリウムを含まない基本展開液を凍結乾燥した試薬に［実施例１］３．（１）で調製した基本抽出液を１００μＬ加え溶解して展開液を作製したのち、前記イムノクロマトストリップを挿し込み展開液を吸い上げ２０分後に検出ラインの状態を目視で判定したが、検出ラインは陰性であった。

本試験の評価として、ごまタンパク質の検出が十分に可能（＋又は＋Ｗ）で、パン粉に対しての反応が陰性（検出結果が−（マイナス）かつｍＡＢＳが５．０以下程度）の場合、イムノクロマト法として有用であると判断できる。表１に示したように、実施例２及び実施例４〜６において、ごまの検出が可能であり、同時にパン粉に対して陰性、すなわち偽陽性の解消効果が認められた。また、実施例５では亜硫酸ナトリウムとＬ−システインを混合することで相乗効果が見られ、単独で使用するよりも偽陽性反応の抑制に対して高い効果が認められた。
表１の比較例１に示したように、ごまを含まないパン粉に対して非特異反応（偽陽性）が確認された。パン粉を含まない抽出液のみでは、陰性であった。比較例１のような従来のイムノクロマト法ではパン粉やパン粉を含む食品を対象としたごまのアレルゲン検査が正確にできなかった。

［比較例２］
１．還元剤添加抽出液の調製
０．５w/v％ＳＤＳ、０．１w/v％チオ硫酸ナトリウム、０．２w/v％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が含まれるＰＢＳ溶液を基本抽出液として、亜硫酸ナトリウムを０．５w/v％となるように添加して抽出液を調製した。

２．測定サンプルの調製
（１）ごまタンパク質含有サンプルの調製
ごまをミルサーで粉砕し、アセトンで脱脂したごま粉末１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記１．で調製した抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過して上清を得た。この溶液のタンパク質濃度を2-D Quant Kit（ＧＥヘルスケア製）で測定し、タンパク質濃度が２５ｐｐｂとなるように上記１．で調製した抽出液で調整し測定サンプルとした。

（２）食品測定サンプル（パン粉抽出物）の調製
パン粉１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記１．で調製した抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を測定サンプルとした。

３．イムノクロマト法による検出の確認
上記２．で調製したサンプルを用い、実施例１と同様に行った。その結果を表２に示す。
なお、表２中の記号及び数字は、表１中と同じ意味を表す。

［比較例３］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例２と同様に行った。その結果を表２に示す。

［比較例４］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを０．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例２と同様に行った。その結果を表２に示す。

［比較例５］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを２．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例２と同様に行った。その結果を表２に示す。

［比較例６］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを０．５w/v％、さらにＬ−システインを０．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例２と同様に行った。その結果を表２に示す。

［比較例７］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％、さらにＬ−システインを２．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例２と同様に行った。その結果を表２に示す。

本試験の評価として、ごまタンパク質の検出が十分に可能（＋又は＋Ｗ）で、パン粉に対しての反応が陰性（検出結果が−（マイナス）かつｍＡＢＳが５．０以下程度）の場合、イムノクロマト法として有用であると判断できる。表２に示したように、ごまタンパク質の検出では＋又は＋Ｗとなる条件はあったが、同時にパン粉に対しての反応が陰性になる条件はなかった。このことから、抽出液に還元剤を添加した場合は、パン粉に対する偽陽性反応の抑制効果は十分ではなかった。

［落花生アレルゲンを検出するための展開液調製用凍結乾燥試薬及びイムノクロマトストリップの作製方法とそれらを用いた測定］
１．展開液調製用凍結乾燥試薬の作製
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるようにPAh1-5(FERM-BP-11240)のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調整した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍＬにＭＡｂ溶液を５００μＬ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μＬ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ_５２５＝１．０になるよう調整した。
（２）凍結乾燥試薬の作製
２．０ｍＬ容のマイクロチューブに上記（１）のＯＤを調整した金コロイド標識抗体を２０μＬ、展開液としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬ加えたものを基本展開液として亜硫酸ナトリウムを添加し、さらに予備凍結したのち凍結乾燥機により一晩凍結乾燥し、凍結乾燥試薬を作製した。亜硫酸ナトリウムは、測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して０．６２５w/v％となるように添加した。

２．イムノクロマトストリップの作製
（１）展開支持体の作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍＬとなるようにPAh1-4(FERM-BP-11239)のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃、１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
（２）イムノクロマトストリップの組立
上記（１）で調製した展開支持体に加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、展開支持体、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップを作製した。

３．測定サンプルの調製
（１）抽出液の調製
０．５w/v％ＳＤＳ、０．１w/v％チオ硫酸ナトリウム、０．２w/v％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が含まれるＰＢＳ溶液を抽出液として調製した。

（２）落花生タンパク質含有サンプルの調製
落花生タンパク質は、バージニア種（千葉県産）を用い、「アレルギー物質を含む食品の検査方法について（参考）（平成２６年３月２６日、消費者庁）」に記載の標準品規格の方法に従い落花生粉末を調製し、落花生粉末１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記（１）で調製した抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を得た。この溶液のタンパク質濃度は2-D Quant Kit（ＧＥヘルスケア製）で測定し、タンパク質濃度が２００ｐｐｂとなるように上記（１）で調製した抽出液で調整し測定サンプルとした。

（３）食品測定サンプル（ハムカツ抽出物）の調製
落花生が含まれないハムカツ１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、前記（１）で調製した抽出液１９ｍＬを加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱し冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を測定サンプルとした。

４．イムノクロマト法による検出の確認
前記１．で調製した凍結乾燥試薬に上記３．で調製した測定サンプルを１００μＬ加え溶解して展開液を作製したのち、前記２．で作製したイムノクロマトストリップを挿し込み展開液を吸い上げ２０分後に検出ラインの状態を目視で判定した。また、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス製：C10066-10）を用いて検出ラインの発色強度（ｍＡＢＳ）を測定した。その結果を表３に示す。なお、表３中の記号及び数字の意味は、表１中と同じ意味を表す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して１．２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して２．５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して５．０w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して０．６２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して１０．０w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを１．２５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを１．５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを２．０w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

基本展開液に測定サンプルと凍結乾燥試薬を混合して展開液としたときの該展開液に対して亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように添加して凍結乾燥試薬を調製する以外は、実施例７と同様に行った。その結果を表３に示す。

［比較例８］
［実施例７］１．（２）で調製した凍結乾燥試薬の代わりに［実施例７］１．（２）で調製した亜硫酸ナトリウムを含まない基本展開液を凍結乾燥した試薬を用いる以外、実施例７と同様にして測定を行った。その結果を表３に示す。
なお、上記亜硫酸ナトリウムを含まない基本展開液を凍結乾燥した試薬に［実施例７］３．（１）で調製した抽出液を１００μＬ加え溶解して展開液を作製したのち、前記イムノクロマトストリップを挿し込み展開液を吸い上げ２０分後に検出ラインの状態を目視で判定したが、検出ラインは陰性であった。

本試験の評価として、落花生タンパク質の検出が十分に可能（＋又は＋ｗ）で、ハムカツに対しての反応が陰性（検出結果が−（マイナス）かつｍＡＢＳが５．０以下程度）の場合、イムノクロマト法として有用であると判断できる。表３に示したように、展開液調製用の凍結乾燥試薬中に実施例１２のＬ−システインが１０．０w/v％、実施例１４の亜硫酸ナトリウムが１．５w/v％とＬ−システイン０．６２５w/v％、実施例１５の亜硫酸ナトリウムが２．０w/v％とＬ−システイン０．６２５w/v％、実施例１６の亜硫酸ナトリウムが２．５w/v％とＬ−システイン０．６２５w/v％含まれる場合に落花生タンパク質の検出が可能であり、同時に落花生タンパク質を含まないハムカツ抽出物に対して陰性を示し、偽陽性の解消効果が認められた。また、実施例１４〜１６では亜硫酸ナトリウムとＬ−システイン単独では効果が認められなかった濃度であっても混合することで偽陽性解消に対して高い効果が認められた。後述する比較例９〜１８と比較すると、抽出液よりも展開液に還元剤を加えた方が偽陽性解消についても高い効果が認められた。
表３の比較例８に示したように、落花生を含まないハムカツ抽出物に対して非特異反応（偽陽性）が確認された。ハムカツを含まない抽出液のみでは、陰性であった。
比較例８のような従来のイムノクロマト法ではパン粉を含む食品を対象とした落花生のアレルゲン検査が正確にできなかった。

［比較例９］
１．還元剤添加抽出液の調製
０．５w/v％ＳＤＳ、０．１w/v％チオ硫酸ナトリウム、０．２w/v％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が含まれるＰＢＳ溶液を基本抽出液として、亜硫酸ナトリウムを０．６２５w/v％となるように添加して抽出液を調製した。

２．測定サンプルの調製
（１）落花生タンパク質含有測定サンプルの調製
落花生タンパク質は、バージニア種（千葉県産）を用い、「アレルギー物質を含む食品の検査方法について（参考）（平成２６年３月２６日、消費者庁）」に記載の標準品規格の方法に従い落花生粉末を調製し、落花生粉末１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記１．で調製した抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を得た。この溶液のタンパク質濃度は2-D Quant Kit（ＧＥヘルスケア製）で測定し、それぞれ２００ｐｐｂとなるように上記１．で調製した抽出液で調整し測定サンプルとした。

（２）食品測定サンプルの調製
落花生が含まれないハムカツ１ｇを５０ｍＬの遠沈管に量り取り、上記１．で調製した抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱、冷却遠心後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．５Ａ）でろ過した上清を測定サンプルとした。

３．イムノクロマト法による検出の確認
上記２.で調製した測定サンプルを用い、実施例７と同様に行った。その結果を表４に示す。なお、表４中の記号及び数字は、表１中と同じ意味を表す。

［比較例１０］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを１．２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１１］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１２］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを５．０w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１３］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１４］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムの代わりにＬ−システインを１０．０w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１５］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを１．２５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１６］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを１．５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１７］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを２．０w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

［比較例１８］
基本抽出液に亜硫酸ナトリウムを２．５w/v％さらにＬ−システインを０．６２５w/v％となるように加えた抽出液を調製し、該抽出液を用いてサンプルの調製を行う以外は、比較例９と同様に行った。その結果を表４に示す。

本試験の評価として、落花生タンパク質の検出が十分に可能（＋又は＋ｗ）で、ハムカツに対しての反応が陰性（検出結果が−（マイナス）かつｍＡＢＳが５．０以下程度）の場合、イムノクロマト法として有用であると判断できる。表４に示したように、落花生タンパク質の検出では＋となる条件はあったが、同時にハムカツ抽出物に対しての反応が陰性になる条件はなかった。このことから、抽出液に還元剤を添加した場合は、パン粉に対する偽陽性反応の抑制効果は十分ではなかった。

ごまアレルゲン、落花生アレルゲン等の食物アレルゲンを、迅速かつ精度よく検出することのできる本発明のアレルゲン検出方法や、アレルゲン検出キットは、食品産業において有用である。

Claims (4)

1. 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む凍結乾燥試薬を前記展開液の調製に用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
2. 前記凍結乾燥試薬に、さらにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む請求項１に記載のアレルゲン検出方法。
3. 変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体並びに亜硫酸塩及び／又はシステインを含む展開液調製用の凍結乾燥試薬と、
   前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、
   アレルゲンを含む食品等の被検試料から変性及び未変性のアレルゲンを抽出するための抽出液と、
   抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、
   を備えたことを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
4. 前記凍結乾燥試薬に、さらにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む請求項３に記載の検出キット。