JP6510307B2 - イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法 - Google Patents
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1〜0.5%であり、これらの濃度範囲の陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含む抽出液を用いると、抽出効率が高く且つ非特異反応を抑制しうる点で好ましい。
(1)大豆7Sグロブリンの調製
大豆をミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温により風乾し、アセトンを除去したものを脱脂大豆粉末とした。この脱脂大豆粉末をプレップセル960(BioRad社製)を用いて精製を行った。7Sグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で0.1%の7Sグロブリン溶液を作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−40℃にて凍結保管した。
供試動物として、6週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco社製)を0.1%の7Sグロブリン溶液が500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco社製)を0.1%の7Sグロブリン溶液が500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回又は追加免疫で7Sグロブリンを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗7Sグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%7Sグロブリン溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer、70mm、Becton Dickinson社製)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106細胞/ウェルとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson社製)に分注し、5%CO2下37℃にて培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗7Sグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAにより7Sグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9細胞/ウェルとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson社製)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106細胞/ウェルとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、大豆7Sグロブリンを含む未変性大豆粗タンパク質(以下「N−SOY」という)と、大豆7Sグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質(以下「D−SOY」という)の2種類のタンパク質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。D−SOYは、脱脂大豆粉末を1mg量り、5%EDTA100μl、尿素6.0g、2−メルカプトエタノール0.2ml、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。精製抗体のN−SOYとD−SOYとに対する反応性をそれぞれダイレクトELISAにて調べ、N−SOY及びD−SOYに対して陽性を示す抗体を5種類選抜した。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する各ハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProteinGカラム(GEヘルスケア社製)により精製し、変性及び未変性の大豆7Sグロブリンに対して特異性を有する5種類の精製モノクローナル抗体(MAb)を取得し、A、B、C、PDSY1、及びPDSY2と呼ぶこととした。
大豆7Sグロブリンに対して陽性を示す5種類の精製した抗体の特異性を確認した。固相の大豆7Sグロブリンを含む未変性大豆粗タンパク質(N−SOY)又は、大豆7Sグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質(D−SOY)に対する反応性をそれぞれ図1に示す。
図1から明らかなとおり、5種類の抗体、A、B、C、PDSY1、及びPDSY2のいずれも、未変性大豆7Sグロブリン及び変性大豆7Sグロブリンを認識することが確認されたが、未変性大豆7Sグロブリンと変性大豆7Sグロブリンとに対する特異性の強度はそれぞれの抗体において異なっていた。
上記精製された5種の抗体について、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれHRP標識を行った。Peroxidase Labeling Kit−SH(株式会社同仁化学研究所製)の取扱説明書に従い、HRP標識されたモノクローナル抗体を得た。固相の抗原に対し陽性反応を示した5種のMAbをそれぞれ固相又はHRP標識抗体として、MAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。測定対象として脱脂大豆粉末に0.5%SDS、0.1%チオ硫酸ナトリウム、0.2%Tween20が含まれるPBSを加えて沸騰水中で10分間加熱したもの(以下「S−SOY」という)を作製し適宜希釈したものを用いた。反応性が異なるMAbの組合せ5種の抗体の、サンドイッチELISAによる反応性(S−SOY 1ppmでの吸光値)の結果を以下の表1に示す。
表1から明らかなとおり、S−SOYを検出できる組合せの中で最も感度の高い組合せとして、プレート固定化抗体PDSY1(NITE BP−02039)とHRP標識抗体PDSY2(NITE BP−02040)を選択した。
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPDSY2(NITE BP−02040)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μl加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPDSY1(NITE BP−02039)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含むTBSで37℃にて1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
試験のためのモデル食肉製品としてハムとハンバーグとを選択し、それぞれ表2と表3とに示す配合にて各濃度の大豆タンパク質を含むモデルハムとモデルハンバーグを作製した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
モデルハムは、75℃にて30分加熱し、モデルハンバーグは沸騰水で10分加熱した。加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。
検出用サンプル1gを量り取り、それに抽出液として、0.5%SDS、0.1%チオ硫酸ナトリウム、及び0.2%Tween20が含まれるPBSを19ml加え撹拌し、沸騰水中で10分間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として牛胎児血清(FBS)を30μl、測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、検出を確認した。
次に検出結果を表4に示す。判定はラインの強い方から順に++、+と表記し、陰性を−表記とした。
(1)ごま11Sグロブリンの調製
ごまをミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温により風乾し、アセトンを除去したものを脱脂ごま粉末とした。この脱脂ごま粉末をプレップセル960(BioRad社製)を用いて精製を行った。11Sグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で0.1%の11Sグロブリン溶液を作製し、1ml容エッペンドルフチューブに500μlずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−40℃にて凍結保管した。
供試動物として、6週齢のBALB/cマウス(日本クレア株式会社製)5尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント(Difco)を0.1%の11Sグロブリン溶液が500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。また、追加免疫は、3週間の間隔で2回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント(Difco社製)を0.1%の11Sグロブリン溶液が500μl入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを1尾当たり150μl腹腔内に注射した。
初回又は追加免疫で11Sグロブリンを注射した1週間後に、各BALB/cマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて2時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の10倍希釈段を作製し、非競合法ELISAによりマウス血中の抗11Sグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製)を用いた。
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法(1975)に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、0.1%11Sグロブリン溶液100μlを尾部静脈より注射した。静脈注射から4日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、RPMI1640で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ(Cell Strainer、70mm、Becton Dickinson社製)を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。1000rpm×10分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度RPMI1640で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)懸濁液を細胞数が10:1になるように混合し、再度1000rpm×10分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量3350の45%ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にRPMI1640を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地(10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミノプテリン、16μMのチミジンを含むHAT選択培地を加え、5×106細胞/ウェルとなるように24ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson社製)に分注し、5%CO2下37℃にて培養した。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ELISAの一次抗体として供試し、抗ごま11Sグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ELISAによりごま11Sグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、0.9細胞/ウェルとなるように96ウェルの細胞培養用プレート(Becton Dickinson社製)に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、4週齢BALB/cマウス胸腺細胞を5×106細胞/ウェルとなるように96ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、10%牛胎児血清、40mMの2−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を用いた。
モノクローナル抗体のスクリーニングは、ごま11Sグロブリンを含む未変性ごま粗タンパク質(以下「N−SSM」という)、ごま11Sグロブリンを含む尿素処理ごま粗タンパク質(以下「D−SSM」という)の2種類のタンパク質に対する反応性の違いを調べることにより特異性の異なるクローンを得ることとした。D−SSMは、脱脂ごま粉末を1mg量り、5%EDTA100μl、尿素6.0g、2−メルカプトエタノール0.2ml、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)1ml、蒸留水1.5mlを加え、アルミフォイルで蓋をした後、100℃で1時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。精製抗体のN−SSMとD−SSMとに対する反応性をそれぞれダイレクトELISAにて調べ、N−SSM及びD−SSMに対して陽性を示す抗体を6種類選抜した。
Jonesら(1990)に従い、まず、BALB/cマウスに不完全フロイントアジュバントを0.2ml腹腔内に注射した。1週間後、一尾当たり5×106細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する各ハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProteinGカラム(GEヘルスケア社製)により精製し、変性及び未変性の11Sグロブリンに対して特異性を有する6種類の精製モノクローナル抗体(MAb)を取得し、D、E、F、PDSE1、及びPDSE2と呼ぶこととした。
ごま11Sグロブリンに対して陽性を示す6種類の精製した抗体の特異性を確認した。固相のごま11Sグロブリンを含む未変性ごま粗タンパク質(N−SSM)又は、ごま11Sグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質(D−SSM)に対する反応性をそれぞれ図2に示す。
図2から明らかなとおり、6種の抗体、D、E、F、PDSE1、及びPDSE2のいずれも、未変性ごま11Sグロブリン及び変性ごま11Sグロブリンを認識することが確認されたが、未変性ごま11Sグロブリンと変性ごま11Sグロブリンとに対する特異性の強度はそれぞれの抗体において異なっていた。
上記精製された6種の抗体について、サンドイッチELISAに供試するため、それぞれHRP標識を行った。Peroxidase Labeling Kit−SH(株式会社同仁化学研究所製)の取扱説明書に従い、HRP標識されたモノクローナル抗体を得た。固相の抗原に対し陽性反応を示した各MAbをそれぞれ固相又はHRP標識抗体として、MAbの組合せを、サンドイッチELISAにおける検出感度の点から選出した。測定対象として脱脂ごま粉末に0.5%SDS、0.1%チオ硫酸ナトリウム、0.2%Tween20が含まれるPBSを加えて沸騰水中で10分間加熱したもの(以下「S−SSM」という)を作製し適宜希釈したものを用いた。反応性が異なるMAbの組合せ6種の抗体の、サンドイッチELISAによる反応性(S−SSM1ppmでの吸光値)の結果を以下の表5に示す。
表5から明らかなとおり、いずれの抗体の組合せにおいても、S−SSMは検出されており、サンドイッチELISAによる抗原捕捉能は確認されたが、S−SSMを検出できる組合せの中で最も感度の高い組合せとして、プレート固定化抗体PDSE1(NITE BP−02041)とHRP標識抗体PDSE2(NITE BP−02042)を選択した。
(1)金コロイド標識抗体の作製
2mMホウ酸緩衝液(pH9.0)で1mg/mlとなるようにPDSE2(NITE BP−02042)のMAb溶液を調製した。あらかじめ0.2M炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製した金コロイド溶液(シグマ社製)5mlにMAb溶液を500μl加え、室温で30分間反応した後、10%BSA溶液を635μl加え、さらに15分間反応させた。遠心分離を行い、1%BSA溶液でOD525=1.0になるよう調製した。
PBSで4mg/mlとなるようにPDSE1(NITE BP−02041)のMAb溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、1%スキムミルクを含むTBSで37℃にて1時間ブロッキング後、TBSで洗浄し乾燥させた。
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
ごまをミルサーで粉砕し、アセトンで脱脂した粉末をごまタンパク質とした。
試験のためのモデル食肉製品としてハムとハンバーグを選択し、それぞれ表6と表7とに示す配合にて各濃度のごまタンパク質を含むモデルハムとモデルハンバーグを作製した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
モデルハムは、75℃にて30分加熱し、モデルハンバーグは沸騰水で10分加熱した。加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。
検出用サンプル1gを量り取り、それに抽出液として、0.5%SDS、0.1%チオ硫酸ナトリウム、及び0.2%Tween20が含まれるPBSを19ml加え撹拌し、沸騰水中で10分間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
調製した金コロイド標識抗体を20μl、展開液として牛胎児血清(FBS)を30μl、測定サンプルを50μl加え、イムノクロマトストリップに供試し、検出を確認した。
次に検出結果を表8に示す。判定はラインの強い方から順に++、+と表記し、陰性を−表記とした。
Claims (13)
- 変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルと、ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも10重量%含まれている展開液とを用い、金コロイド標識抗体と測定サンプルと展開液との混合液を展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが大豆7Sグロブリン又はごま11Sグロブリンであり、前記抽出液が陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ウシ胎児血清(FBS)が少なくとも30重量%含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項1記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを用いることを特徴とする請求項1又は2記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 非イオン性界面活性剤としてTween20を用いることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 大豆7Sグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ(NITE BP−02039)が産生するPDSY1及びハイブリドーマ(NITE BP−02040)が産生するPDSY2を用いることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- ごま11Sグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ(NITE BP−02041)が産生するPDSE1及びハイブリドーマ(NITE BP−02042)が産生するPDSE2を用いることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
- 変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料からアレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する抽出液と、ウシ胎児血清(FBS)又はウシ胎児血清(FBS)を含む展開液とを備え、前記アレルゲンが大豆7Sグロブリン又はごま11Sグロブリンであることを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- 陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする請求項7記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- 非イオン性界面活性剤としてTween20を含有することを特徴とする請求項7又は8記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- 大豆7Sグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(NITE BP−02039)が産生するPDSY1及びハイブリドーマ(NITE BP−02040)が産生するPDSY2であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- ごま11Sグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ(NITE BP−02041)が産生するPDSE1及びハイブリドーマ(NITE BP−02042)が産生するPDSE2であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
- ハイブリドーマ(NITE BP−02039)が産生するPDSY1及びハイブリドーマ(NITE BP−02040)が産生するPDSY2を含むことを特徴とする大豆7Sグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せ。
- ハイブリドーマ(NITE BP−02041)が産生するPDSE1及びハイブリドーマ(NITE BP−02042)が産生するPDSE2を含むことを特徴とするごま11Sグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せ。
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