JP2009271091A5

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Filing date: 2009-08-20
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落花生アレルゲンの検出方法

本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の落花生アレルゲンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。

また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の落花生アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１を指標とした落花生アレルゲンの検出方法や、それに用いられる落花生アレルゲンの検出用キットに関する。

自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１が知られている。

従来、アレルゲンを検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。

また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。

さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で
、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。

本発明の課題は、落花生アレルゲンを含む食品において、落花生アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。

本発明者らは、特定原材料である落花生アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これらアレルゲンを検出することができることを見い出した。

特定原材料の一つである落花生の検出方法の検討を行うに当たっては、精製した未変性のＡｒａｈ１（以下「ＮＡｈ１」という場合がある）、又は精製したＡｒａｈ１を尿素と２−メルカプトエタノールを用いて変性したＡｒａｈ１（以下「ＤＡｈ１」という場合がある）に対するモノクローナル抗体を作出し、その中からＮＡｈ１、ＤＡｈ１、未変性の落花生粗タンパク質（以下「ＮＰ−ｅ」という場合がある）、及び／又は尿素処理した落花生粗タンパク質（以下「ＤＰ−ｅ」という場合がある）を認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態の落花生タンパク質でも、高感度で分析できるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の落花生アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの落花生アレルゲンを検出しうることを確認した。

本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１およびＰＡｈ１−２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−２およびＰＡｈ１−３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２及びＰＡｈ１−３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる未変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２及びＰＡｈ１−３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。

本発明の落花生アレルゲンの検出方法としては、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を用いる落花生アレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種以上の抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を併用する落花生アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の落花生アレルゲン検出用キットとしては、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識する抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種以上の抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体としては、未変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質、及び／又は、尿素処理Ａｒａｈ１タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３等を好適に例示することができる。また、ＰＡｈ１−１等の未変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体と、ＰＡｈ１−２等の未変性／変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性／変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体との組合せや、ＰＡｈ１−２とＰＡｈ１−３等の未変性／変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性／変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体同士の組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。

さらに、本発明の落花生アレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と２−メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生粗タンパク質を抽出することが好ましく、また、本発明の落花生アレルゲン検出用キットとしては、検体からの加熱変性落花生粗タンパク質抽出剤としての、尿素と２−メルカプトエタノールが備えられているものが好ましい。

以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の落花生アレルゲン（以下「食物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識化した抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に食物アレルゲンＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。

不溶性担体に結合した本発明の抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂに試料中の落花生アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、落花生アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂを作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、落花生アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂと落花生アレルゲンであるタンパク質が結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、落花生アレルゲンと結合する抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。

上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

本発明の落花生アレルゲンの検出方法や落花生アレルゲン検出用キットに用いられる抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂは、未変性又は変性の落花生Ａｒａｈ１タンパク質で免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。

抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性の落花生アレルゲンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性の落花生アレルゲン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性の落花生アレルゲンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、落花生の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性落花生アレルゲンＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂ等の抗変性食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性の落花生アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性の落花生Ａｒａｈ１タンパク質に対してのみ特異的に反応する抗食物アレルゲンＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。

また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ若しくは^１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。

本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂ、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質ＭＡｂを溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成１７（２００５）年２月２４日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．抗Ａｒａｈ１ＭＡｂの確立
１−１材料及び方法
１）Ａｒａｈ１タンパク質の調製
市販生落花生に５倍量の２０ｍＭ bis-tris-propanebuffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後３０００×ｇで遠心分離を行い沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度１００００×ｇで遠心分離を行い上清を得た。上清をさらにＳｏｕｒｃｅＱ（アマシャムファルマシア）を用いて、２０ｍＭのbis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０〜１Ｍ）により精製を行った。精製したＡｒａｈ１画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ａｒａｈ１（以下ＮＡｈ１と記す）とした。また、変性Ａｒａｈ１（以下ＤＡｈ１と記す）はＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥと記す）０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。その後透析し、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で０．１％のＤＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液それぞれを作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。

２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、２週間の間隔で３回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。

３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮＡｈ１溶液又はＤＡｈ１溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＮＡｈ１抗体価及び抗ＤＡｈ１抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。

４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％のＮＡｈ１溶液又は０．１％のＤＡｈ１溶液それぞれ１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０^６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ_２下３７℃で培養した。

５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＮＡｈ１抗体又はＤＡｈ１抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮＡｈ１又はＤＡｈ１に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０^６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。

６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、あるいは落花生粗タンパク質の未変性物（以下ＮＰ−ｅと記す）、尿素処理（以下ＤＰ−ｅと記す）の４種類に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、ＮＰ−ｅは落花生に５倍量の２０ｍＭbis-tris-propanebuffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後遠心分離を２回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。また、ＤＰ−ｅはＮＰ−ｅを１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−ＭＥ０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったものとした。培養上清のＮＡｈ１、ＮＰ−ｅ、ＤＡｈ１あるいはＤＰ−ｅに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。

７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０^６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャムファルマシア）により精製した。

８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＮＡｈ１ＭＡｂ又は抗ＤＡｈ１ＭＡｂの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＮＰ−ｅ又はＤＰ−ｅをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗ＮＡｈ１ＭＡｂ又はＤＡｈ１ＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotypingkit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。

９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。

１−２結果
１）抗ＮＡｈ１ＭＡｂとＤＡｈ１ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＡｈ１に対する特異性を持つＭＡｂ７種類、及び、ＤＡｈ１に対する特異性を持つＭＡｂ３種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表１及び表２に示した。

２）組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、ＮＰ−ｅおよびＤＰ−ｅを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＰ−ｅを検出できる組合せとして、プレート抗体にＰＡｈ１−２（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）とビオチン抗体にＰＡｈ１−１（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）、また、ＤＰ−ｅを検出できる組合せとしてプレート抗体にＰＡｈ１−２とビオチン抗体にＰＡｈ１−３（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）の組合せを選択した（図１と図２）。

３）ＭＡｂ混合系でのＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅの検出
固相にＰＡｈ１−２、ビオチン化にＰＡｈ１−１およびＰＡｈ１−３を混合し、ＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅの検出感度を確認した。それぞれのＭＡｂ濃度は５０μｇ／ｍｌに設定した。その結果、ＭＡｂ混合系でＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅともに検出することが可能であった（図３と図４）。

２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中の落花生粗タンパク質の検出
上記１．で選択されたＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２およびＰＡｈ１−３の組合せにより、実際の食品中の落花生粗タンパク質を検出できるかを試みた。

２−１材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表３に示す配合にて各濃度の落花生粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。

２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
（モデル塩漬肉）
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、ＰＢＳＴ１９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。３０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取り、ＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様にＰＢＳＴに溶解した落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。
（モデル加熱製品）
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、１Ｍ尿素および０．１％２−ＭＥを含むＰＢＳ１９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。その後、１００℃で１時間加熱処理を行った。冷却後３０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取りＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様に１Ｍ尿素および０．１％２−ＭＥ処理を行った落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからＰＢＳＴを用いて抽出し、ＰＢＳＴに溶解した落花生粗タンパク質を検量線とした尿素および２−ＭＥを用いない場合との比較を行った。

２−２結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中の落花生粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表４に、モデル加熱製品の結果を表５に、また、ＰＢＳＴのみで抽出した結果を表６に示す。

以上の結果から、モデル塩漬肉のように未加熱の落花生粗タンパク質でも、モデル加熱製品のような加熱変性した落花生粗タンパク質でも、高い回収率で落花生粗タンパク質を検出可能であった。これらのことから、未変性タンパク質に結合可能なＭＡｂと変性タンパク質に結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態の落花生タンパク質でも、高感度で分析できることがわかった。また、食品中からの落花生粗タンパク質の抽出には尿素および２−ＭＥを用いることが有効であり、尿素で変性させたＡｈ１に結合可能であることが必要であることが明らかとなった。

３．イムノクロマトによる未変性および変性落花生粗タンパク質の検出
３−１材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＡｈ１−１とＰＡｈ１−３のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００ｍｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝２．０になるよう調製し、１：１の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μｌ／ｃｍ^２となるよう塗布し、乾燥させた。

２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＡｈ１−２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃、１時間ブロッキング後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し乾燥させた。

３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記２．で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。

３−２結果
メンブレン塗布ＭＡｂＰＡｈ１−２、および金コロイド標識ＭＡｂＰＡｈ１−１とＰＡｈ１−３の組合せにより、落花生粗タンパク質は加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した落花生タンパク質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。

市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍ尿素、０．２％２−ＭＥを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品タンパク中から効率よくアレルゲンを抽出するためのタンパク質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。

本発明によると、食品等に含まれる落花生アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。

Claims

未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を用いることを特徴とする落花生アレルゲンの検出方法。
未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種以上の抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を併用することを特徴とする落花生アレルゲンの検出方法。
抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質、及び／又は、尿素処理Ａｒａｈ１タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１又は２記載の落花生アレルゲンの検出方法。
抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
検体から、尿素と２−メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を抽出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の落花生アレルゲンの検出方法。
未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識する抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えたことを特徴とする落花生アレルゲン検出用キット。
未変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種以上の抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えたことを特徴とする落花生アレルゲン検出用キット。
抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体が、未変性Ａｒａｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質、及び／又は、尿素処理Ａｒａｈ１タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７又は８記載の落花生アレルゲン検出用キット。
抗落花生Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
異なるエピトープを認識する２種以上のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
検体からのタンパク質抽出剤としての、尿素と２−メルカプトエタノールが備えられていることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載の落花生アレルゲン検出用キット。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２。
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３。