CN112834738A - 一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法、试剂盒及其应用，其中所述过敏原检测方法包括以下步骤：制备生物化抗体：根据抗原制备对应的抗体，并对抗体进行生物化处理，得到生物化抗体；制备酶标板：在酶标板上进行二抗IgG的包被，再利用抗体对酶标板进行包被，使抗体结合到二抗IgG上，再对酶标板进行封闭和烘干处理；先向上一步处理后的酶标板中的每孔分别加入样品待测液，再加入前述制备的生物化抗体；对酶标板进行充分洗涤后，再加入链接HRP的链霉亲和素进行结合；进行充分洗板后，加入显色液进行显色，加入终止液，终止酶反应后，进行吸光度检测。所述过敏原检测方法不仅提高该检测结果的灵敏度，且操作简单，能够节省原料降低成本。

Description

一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及过敏原检测方法技术领域，尤其涉及一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
食物过敏大多是食物中过敏原蛋白对机体细胞的选择性刺激，从而引起机体免疫系统异常和生理机能障碍，近年来已经成为国际关注的重大食品安全问题。
葵花籽是一类重要的食品过敏源，对于葵花籽过敏的人来说，食物中隐藏的葵花籽蛋白是一个严重的问题，即使极少量的过敏原也能引起过敏反应，可能导致严重的过敏性休克。因此，能够灵敏的检测食品中残留的检测系统非常必要。
目前用于过敏原检测的手段主要有PCR法、质谱检测和酶联免疫ELISA法。其中，PCR法是基于DNA水平的检测手段，而非直接对致敏蛋白进行定量，观察结果时需要借助多种仪器，容易造成污染和出现假阳性结果；而质谱分析样品前处理过于复杂，所需仪器价格昂贵，检测成本高、周期长，不适于快速高通量分析检测。而酶联免疫ELISA法，是基于蛋白质的检测技术，是现在最为成熟的方法之一，该方法是采用酶标抗体的方式，传统的酶联免疫标记技术是根据抗原或抗体结合到固相载体表面后，能保持其免疫活性，而抗原或抗体与酶结合后也能保持免疫学和酶的活性。酶结合物与相应抗原或抗体形成复合物，在底物的催化下发生显色反应，可根据加入酶底物溶液的显色深浅反应，判定有无相应的免疫反应及抗原或抗体的量。但是传统的酶联免疫ELISA法具有灵敏度相对较低，稳定周期短，成本高的缺点。
因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对现有过敏原检测方法的灵敏度较低、稳定周期短，成本高的问题，本发明提供了改进后的基于酶联免疫技术的过敏原检测方法。
为解决上述问题，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法，其包括以下步骤：
(1)制备生物化抗体：根据抗原制备对应的抗体，并对抗体进行生物化处理，得到生物化抗体；
(2)制备酶标板：在酶标板上进行二抗IgG的包被，再利用抗体对酶标板进行包被，使抗体结合到二抗IgG上，再对酶标板进行封闭和烘干处理；
(3)先向上一步处理后的酶标板中的每孔分别加入样品待测液，再加入前述制备的生物化抗体；
(4)对酶标板进行充分洗涤后，再加入链接HRP的链霉亲和素进行结合；
(5)进行充分洗板后，加入显色液进行显色，加入终止液，终止酶反应后，进行吸光度检测。
优选地，步骤(1)中，酶标板的二抗包被浓度为1～4ug/mL。
优选地，步骤(2)中，葵花籽抗体包被浓度为0.5～2ug/mL。
优选地，样品处理方法为：将称取的样品置于研钵或均质器中充分破碎后，将0.5-2g充分均质的样品，向其中加入10-40mL PH值8.0的0.01M的PB溶液(磷酸缓冲液)，并向PB溶液中加氯化钠溶液至其浓度为1.5moL/L，50℃震荡混匀10～15min。于4000r离心10min，取上清作为样品待测液。
如果上清液没有完全和沉淀分离，必要时将上清液进行进一步过滤，直至得到澄清的上清液，作为样品待测液，进行后续过敏原的检测试验。
优选地，所述生物化抗体的制备方法为：
(1)采用1M碳酸盐缓冲液(PH8.0)对上述目标抗体进行透析。所述抗体为葵花籽抗体或其他抗原的特异性抗体。
(2)用1mL的DMSO(二甲基亚砜)对1mg的生物素进行溶解后，向其中加入上述目标抗体，使目标抗体与生物素以10:1的质量比进行偶联，并在4℃的条件下搅拌过夜。
(3)接着向混合物中加入0.12mL的1moL/L的NH4CL，室温搅拌10min，用于终止偶联反应。
(4)在4℃环境下用1×PBS缓冲液对偶联后的抗体进行透析，期间对缓冲液进行3～4次的更换，最后将收集到的生物化目标抗体取出，置于-20℃条件下，进行冷冻保存备用。
本发明还提供一种上述过敏原检测方法在检测食物中的各种过敏原的应用，过敏原包括葵花籽、花生、甲壳。
本发明还提供一种葵花籽过敏原检测试剂盒，其包括：上述二抗IgG、葵花籽抗体、生物化葵花籽抗体、链接HRP的链霉亲和素。
本发明具有以下有益效果：
1、一方面，本发明采用生物素偶联代替酶标物偶联的酶联免疫ELISA双抗体夹心法，将酶反应的放大作用与生物素和亲和素的方法作用结合起来，达到双重信号放大的效果，不仅提高该检测结果的灵敏度，且操作简单，能够节省原料降低成本；与现有方法相比，本发明的方法可将过敏原检测的灵敏度提高4～10倍；如原料之前灵敏度为10ug/mL，生物化后可以提高到2ug/mL左右；另一方面，本发明采用先将酶标板进行IgG包被的方式来捕捉抗体，有效提高抗体的结合效率，抗体节约使用量为原使用量的30％～50％，进一步降低成本。
2、现有的ELISA检测过敏源常使用酶标抗体的方式进行检测，而酶标抗体最主要的缺陷是工作液的储存问题，稳定性差，偶联费时，费力，成本较高；而本发明采用的生物化抗体不仅很好地解决了抗体稳定性问题，而且操作简单，节约成本，同时放大信号，提高产品的灵敏度，便于推广。
3、本发明的检测方法，具有检测速度快、费用低廉、所需仪器简单、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场检验。本发明的检测方法应用范围广，可适用于各种过敏原的检测，如葵花籽制品、汤、调料、烘焙食品等产品的定量检测，以及食品生产加工产业链中环境拭子的检测。
附图说明
图1为本发明的检测方法的灵敏度测试结果；
图2为本发明的检测方法用于检测葵花籽过敏原的实验结果；
图3为本发明的检测方法用于检测甲壳过敏原的实验结果；
图4为本发明的检测方法用于检测花生过敏原的实验结果；
其中，图2-4中，对实验结果的分析采用的是四参数计算法，检测结果的单位为ppm/ppb，样本加标回收率的计算方法为：(检测值-本底值)/添加值*100％，本底值低于试剂盒最小检测值按照0计算。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。本发明以葵花籽过敏原为例对过敏原检测方法进行解释说明。
实施例一 基于酶联免疫技术的过敏原检测方法对葵花籽过敏原的检测
1、样本处理
(1)产品成分参数：葵花籽蛋白标准曲线浓度为0ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL。
生物化葵花籽抗体的使用工作浓度0.05ug/mL，将购买的链接HRP的链霉亲和素(厂家为索莱宝)的原液稀释3000倍后使用。
(2)样本处理方法
为了保证样品最大限度的均质和具有代表性，最少称取5g样品，并在研钵或均质器中充分破碎。
取1g充分均质的样品，向其中加入20mL PH值8.0的0.01M的PB溶液，PB溶液中添加氯化钠，且氯化钠的最终浓度为1.5moL/L，50度震荡混匀10min。于4000r离心10min。如果上清液没有完全和沉淀分离，必要时将上清液进行进一步过滤，直至得到澄清的上清液，作为样品待测液，进行后续过敏原的检测试验。
如果样品的检测结果超出了试剂盒测定范围，需要用样品稀释缓冲液对样品进行进一步稀释。
2、葵花籽抗体
本实验采用的葵花籽抗体是自行制备，是通过将抗原注入到小鼠体内启动机体免疫应答而产生的，再从葵花籽抗原免疫小鼠上取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选得到阳性克隆产生的抗体。
3、生物化葵花籽抗体的制备
(1)采用1M碳酸盐缓冲液(PH8.0)对上述葵花籽抗体进行透析。
(2)用1mL的DMSO(二甲基亚砜)对1mg的生物素进行溶解后，向其中加入葵花籽抗体，使葵花籽抗体与生物素以10:1的质量比进行偶联，并在4℃的条件下搅拌过夜。
(3)接着向混合物中加入0.12mL的1moL/L的NH4CL，室温搅拌10min，用于终止偶联反应。
(4)在4℃环境下用1×PBS缓冲液对偶联后的抗体进行透析，期间对缓冲液进行3～4次的更换，最后将收集到的生物化葵花籽抗体取出，置于-20℃条件下，进行冷冻保存备用。
4、酶标板的制备
(1)先对酶标板的每孔中加入100uL的羊抗鼠IgG(厂家索莱宝)进行包被，羊抗鼠IgG的包被浓度为1ug/mL，在37℃条件下处理2h。
(2)再向酶标板的每孔中加入100uL的葵花籽抗体进行进一步包被，葵花籽抗体包被浓度0.05ug/mL，使葵花籽抗体结合到羊抗鼠IgG的相应位点，在4℃条件下处理16-18h。
(3)再使用1％的BSA(150uL/孔)对酶标板进行封闭处理，在37℃条件下处理2h，接着，对酶标板烘干后进行存储。
上述过程中，先在酶标板上包被二抗IgG的处理，可大幅度地提高葵花籽抗体的包被效率，是直接包被葵花籽抗体的浓度的5倍，这样的处理极大的节约了原料成本。
5、样本中过敏原的检测
1)向酶标板的每孔分别加入50μL稀释后的标准品或样品待测液，每个样品设置两组重复；再加入50μL生物化葵花籽抗体的工作液，室温下孵育20min。
上述过程中，混入的样品或标准品中的抗原结合到酶标板上的葵花籽抗体上；接着加入的生物化葵花籽抗体再结合到酶标板上的抗原其他结合位点，从而形成了双抗夹心结构。
2)洗涤：去盖板膜，甩干孔液，加洗液工作液(0.01M PBST)300μL/孔，充分洗涤10s；弃去孔液，加洗液工作液300μL/孔，充分洗涤10s；重复洗涤四次，最后一次用吸水纸拍干。安装上述步骤至少清洗3-4次。
洗涤过程是为了充分冲洗掉未结合到酶标板的抗体，降低其对结果的干扰，洗涤不充分将导致最后的检测结果的精确度差，吸光值升高。
3)向每孔加入100μL的酶标物，酶标物采用链接HRP的链霉亲和素。室温下孵育20min。
基于生物素和链霉亲和素的特异结合，加入的链接HRP的链霉亲和素结合到双抗夹心结构外层的生物化葵花籽抗体上。
4)按照步骤2)再次洗板。
5)显色：向每孔加入100μL的TMB显色液。室温下暗处(例如柜子或抽屉，色原体对光敏感)反应20min。
6)终止：向每孔添加50μL的终止液(0.5MH2SO4)，终止酶反应，孔液由蓝色变为黄色。
轻轻震荡酶标板，充分混匀后，用酶标仪450nm处测吸光度(参考波长630nm)。孔液颜色会稳定20min。
6、葵花籽过敏原检测的灵敏度测试
A对照试验1
(1)方法步骤：
为了比较包被IgG捕捉抗体与直接包被抗体对抗体使用量的影响，设置以下实验组和对照组：
实验组1：按照本发明前述方法制备酶标板(即先在酶标板上包被二抗IgG，浓度为1ug/mL，再接着包被0.05ug/mL的葵花籽抗体)；
对照组1：将酶标板直接包被0.05ug/mL的葵花籽抗体；其他操作与实验组1相同；
对两个实验组按照前述步骤4和5的方法进行过敏原检测，通过对酶标板的显色OD做最终结果判定。其中，配制葵花籽蛋白的浓度为0、0.5ug/mL、1ug/mL，3ug/mL、10ug/mL的标准溶液用于制备标准曲线，后续采用的生物化葵花籽抗体的浓度为0.05ug/mL，链霉亲和素-HRP的使用浓度按原液1:3000倍稀释使用，按照前述步骤5的检测方法进行检测，实验结果见图1。
(2)实验结果及分析：
从图1的结果可知，与对照组1相比，酶标板预先包被IgG的实验组，其板孔OD值是直接包被抗体对照组1的板孔OD值的2倍左右。
按照前述方法进行实验时发现，要达到相同的检测效果时，实验组的抗体使用量要明显低于对照组。如达到2.0的OD值，在其它实验试剂使用浓度相同的情况下，采用直接包被抗体方式，抗体的包被浓度为0.1ug/mL，而预先包被IgG的酶标板孔，抗体的包被浓度只需0.05ug/mL；通过多组实验数据比较发现，本实施例中，实验组节约葵花籽抗体的使用量是对照组1(直接包被抗体)的50％左右。
B对照试验2
(1)实验方法：为了对比生物化抗体和酶标抗体对抗体灵敏度的影响，设置如下实验。
实验组：按照本发明前述方法进行设置；样本检测时使用的是生物化抗体；
对照组2：样本检测时使用的是酶标抗体，其他操作与实验组相同；
其中，葵花籽抗原配置浓度梯度，0、0.5ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL，生物化抗体配置三个浓度梯度0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.2ug/mL，酶标抗体配置相同的浓度梯度0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.2ug/mL，按照步骤5的检测步骤进行检测，结果见下表：
表1生物化抗体与酶标抗体检测结果OD值对比
Figure BDA0002873789740000081
(2)实验结果及分析：
由上表1的结果可知，使用生物化抗体的实验组，其检测的灵敏度在2ug/mL，而使用酶标抗体的对照组2的检测灵敏度在10ug/mL，其灵敏度提高了5倍；相同的抗体浓度，生物化抗体比酶标抗体的OD值提高了1.5倍左右，这说明：生物化后的抗体可以有效的提高灵敏度，并降低抗体的使用量。
实施例二 检测葵花籽过敏原的应用实例
(1)实验方法：
从超市购买配料表上含有葵花籽过敏原信息的阳性样本，葵花籽样本以及阴性样本(如不含葵花籽的饼干、饮料)进行检测，并同时设置空白对照；并且设置3组饼干样品加标组，各组的定量饼干中分别加入50ppm、100ppm、300ppm的葵花籽蛋白，用于检测该方法结果的可靠性和准确性。
每组取1g充分均质的样品，向其中加入20mL PH值8.0的0.01M的PB溶液，且PB溶液中含氯化钠的浓度1.5moL/L，50度震荡提取20min。于4000r离心5min。如果上清液没有完全和沉淀分离，必要时将上清液进行进一步过滤，直至得到澄清的上清液，作为样品待测液，按照步骤5的检测方法进行测试，实验结果见图2。
(2)实验结果及分析
由图2的结果可知，饼干样本加标回收率在80-120％之间，阴阳性样本检测值与实际标识相符，这说明本发明的过敏原检测方法用于检测葵花籽过敏原的结果准确可靠。
注明：加标回收率，是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。
实施例三 检测甲壳过敏原的应用实例
(1)实验方法：
产品检出限20ug/L，标准曲线浓度范围0ug/L、20ug/L、80ug/L、240ug/L、800ug/L。从超市购买配料表上含有甲壳过敏原信息的阳性样本(海鲜方便面或调料包)，甲壳样本，阴性样本(如甜不辣)和其它带壳的海产品进行检测。并且设置4组饼干样品加标组(图3中的第2-5组)，各组的定量饼干中分别加入20ppb、50ppb、100ppb、500ppb的甲壳蛋白，用于检测该方法结果的可靠性和准确性。
取1g充分均质的样品，向其中加入20mL PH值8.0的0.01M的PB溶液，且PB溶液中含氯化钠的浓度1.5moL/L，37度震荡提取20min。于4000r离心5min。如果上清液没有完全和沉淀分离，必要时将上清液进行进一步过滤，直至得到澄清的上清液，作为样品待测液，按照步骤5的检测步骤进行检测，选用的抗体是甲壳抗体、生物化甲壳抗体，实验结果见图3。
(2)实验结果及分析
由图3的结果可知，饼干样本加标回收率在70-130％之间，阴阳性样本检测值与实际标识相符，与蛤和扇贝无交叉反应。这说明本发明的过敏原检测方法用于检测甲壳过敏原的结果准确可靠。
(3)抗体节约量
按照实施例1的方法，比较包被IgG捕捉抗体与直接包被抗体对抗体使用量的影响，实验组和对照组的设置方法也参见实施例1。
结果发现：检测结果达到2.0的OD值时，直接包被抗体方式的对照组中，甲壳抗体的包被浓度为0.2ug/mL，而实验组中，预先包被IgG的酶标板孔，甲壳抗体的包被浓度只需0.14ug/mL。因此，本实施例中，实验组节约葵花籽抗体的使用量是对照组1(直接包被抗体)的30％左右。
实施例四 检测花生过敏原的应用实例
(1)实验方法：
产品检出限1mg/L，标准曲线浓度范围0mg/L、1mg/L、3mg/L、10mg/L、30mg/L。从超市购买配料表上含有花生过敏原信息的阳性样本(花生糖和花生饮料)，花生样本，阴性样本(阴性饼干和普通饮料)进行检测，取1g充分均质的样品，向其中加入20mL 0.01M PBST溶液。于振荡器震荡10min，于4000r离心5min。如果上清液没有完全和沉淀分离，必要时将上清液进行进一步过滤，直至得到澄清的上清液，作为样品待测液，按照5的检测步骤进行检测，采用的抗体是花生抗体和生物化花生抗体，实验结果见图4。
(2)实验结果及分析：
由图4的结果可知，饼干样本加标回收率在70-130％之间，阴阳性样本与实际相符，质控样本检测值在标识值范围内。这说明本发明的过敏原检测方法用于检测花生过敏原的结果准确可靠。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于酶联免疫技术的过敏原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备生物化抗体：根据抗原制备对应的抗体，并对抗体进行生物化处理，得到生物化抗体；
(2)制备酶标板：在酶标板上进行二抗IgG的包被，再利用抗体对酶标板进行包被，使抗体结合到二抗IgG上，再对酶标板进行封闭和烘干处理；
(3)先向上一步处理后的酶标板中的每孔分别加入样品待测液，再加入前述制备的生物化抗体；
(4)对酶标板进行充分洗涤后，再加入链接HRP的链霉亲和素进行结合；
(5)进行充分洗板后，加入显色液进行显色，加入终止液，终止酶反应后，进行吸光度检测。
2.如权利要求1所述的过敏原检测方法，其特征在于，步骤(1)中，酶标板的二抗包被浓度为1～4ug/mL。
3.如权利要求1所述的过敏原检测方法，其特征在于，步骤(2)中，葵花籽抗体包被浓度为0.5～2ug/mL。
4.一种如权利要求1所述的过敏原检测方法在检测食物中的各种过敏原的应用，其特征在于，过敏原包括葵花籽、花生、甲壳。
5.一种葵花籽过敏原检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的二抗IgG、葵花籽抗体、生物化葵花籽抗体、链接HRP的链霉亲和素。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114324857A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 北京普赞生物技术有限公司 一种用于elisa试剂盒信号放大的微球及其制备方法
CN115792248A (zh) * 2023-02-13 2023-03-14 江西赛基生物技术有限公司 食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275427A1 (en) * 2004-03-05 2007-11-29 Prima Meat Packer, Ltd Method of Detecting Allergen
JP2010078448A (ja) * 2008-09-25 2010-04-08 Prima Meat Packers Ltd 食物中のアレルギー物質の分析方法
CN103837674A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 天津医科大学 特异性IgE抗体的检测方法、该方法所使用的试剂盒以及该试剂盒的制备和使用方法
CN104198728A (zh) * 2014-08-22 2014-12-10 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 人血清cxcl16酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
CN105352987A (zh) * 2015-11-16 2016-02-24 南昌大学 一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275427A1 (en) * 2004-03-05 2007-11-29 Prima Meat Packer, Ltd Method of Detecting Allergen
JP2010078448A (ja) * 2008-09-25 2010-04-08 Prima Meat Packers Ltd 食物中のアレルギー物質の分析方法
CN103837674A (zh) * 2014-03-07 2014-06-04 天津医科大学 特异性IgE抗体的检测方法、该方法所使用的试剂盒以及该试剂盒的制备和使用方法
CN104198728A (zh) * 2014-08-22 2014-12-10 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 人血清cxcl16酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
CN105352987A (zh) * 2015-11-16 2016-02-24 南昌大学 一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吉坤美 等: "双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分", 《食品研究与开发》, vol. 30, no. 6 *
赵金富 等: "酶联免疫分析结合生物素-亲合素放大体系测定血清中的雌三醇", 《高等学校化学学报》, vol. 25, no. 6, pages 1020 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114324857A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 北京普赞生物技术有限公司 一种用于elisa试剂盒信号放大的微球及其制备方法
CN115792248A (zh) * 2023-02-13 2023-03-14 江西赛基生物技术有限公司 食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法

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