CN114324857A - 一种用于elisa试剂盒信号放大的微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学检测技术领域。本发明提供了一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球及其制备方法，将微球经过活化、偶联、封闭和生物素亲和素反应后制得用于ELISA试剂盒信号放大的微球。本申请制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球能够代替传统方法中的酶标记物，提高ELISA试剂盒灵敏度，可使ELISA的灵敏度在原来基础上提高20～50倍。同时简化试剂盒样品前处理操作，省去样品前处理需要吹干复溶的操作和净化操作，缩短了操作时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学检测技术领域，尤其涉及一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球及其制备方法。
背景技术
ELISA技术是目前已经技术成熟且广泛应用于食品安全快检及医疗体外诊断等领域的一种快检技术。
ELISA方法有检测时间短，操作简单，仪器设备成本低等优点，缺点是ELISA方法的灵敏度与抗原抗体的质量密切相关，而抗原抗体制备工艺复杂，且通过改变抗原抗体结构或制备工艺对灵敏度的提高有限，仅在10倍左右；ELISA在项目上应用失败的原因多数是因为灵敏度不能达到要求。如何针对ELISA试剂盒的灵敏度进行优化成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球及其制备方法，对ELISA试剂盒的灵敏度进行优化，提高ELISA的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活化缓冲液和微球混合后超声处理，得物料1；
(2)将物料1和活化剂溶液混合，超声后离心，弃上清得物料2；
(3)将物料2和偶联缓冲液混合，超声得物料3；
(4)将物料3和链霉亲和素溶液混合，超声后得物料4；
(5)将物料4和封闭剂混合，超声后离心，弃上清得物料5；
(6)将物料5和缓冲液混匀后超声处理后得物料6；
(7)将物料6、生物素标记免疫活性蛋白和生物素标记HRP混合，超声后得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
作为优选，所述步骤(1)中的微球使用前经过清洗，所述清洗的方法为：将活化缓冲液和微球混匀并离心，弃上清，得到清洗后的微球；所述活化缓冲液和微球混匀后微球的体积比为80～120：1，所述清洗过程中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为25～35min。
作为优选，所述微球为聚苯乙烯羧基荧光微球、聚苯乙烯羧基微球或二氧化硅羧基微球；所述微球的粒径为50～500nm；所述活化缓冲液为pH值为5～7的有缓冲能力的缓冲液；所述步骤(1)中活化缓冲液和微球的体积比为80～120：1，所述步骤(1)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
作为优选，所述步骤(2)中的活化剂为DCC、NHS、DMAP、EDC或S-NHS；所述活化剂溶液中活化剂的浓度为0.9～1.1mg/ml；所述步骤(2)中超声的时间为25～35min，超声的功率为100～140W，所述步骤(2)中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为25～35min；
所述活化剂溶液为含有DCC的活化缓冲液+含有NHS的活化缓冲液时两者的体积相等，活化剂溶液的用量为微球体积的15～25倍；
所述活化剂溶液为含有DMAP的活化缓冲液时，活化剂溶液的用量为微球体积的3～7倍；
所述活化剂溶液为含有DCC的活化缓冲液+含有DMAP的活化缓冲液时两者的体积相等，活化剂溶液的用量为微球体积的15～25倍。
作为优选，所述步骤(3)中的偶联缓冲液为pH值为6～8的有缓冲能力的缓冲液；所述偶联缓冲液的用量为微球体积的45～55倍；所述步骤(3)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
作为优选，所述步骤(4)中的链霉亲和素溶液为含有链霉亲和素的偶联缓冲液，所述链霉亲和素溶液中链霉亲和素的浓度为20～40μg/ml；所述链霉亲和素溶液的用量为微球体积的45～55倍；所述步骤(4)中超声的时间为25～35min，超声的功率为100～140W。
作为优选，所述步骤(5)中的封闭剂为甘氨酸、酪蛋白、BSA或DB1130，所述封闭剂的的质量浓度为1～10％；所述封闭剂的用量为微球体积的2～6倍；所述步骤(5)中超声的时间为25～30min，超声的功率为100～140W，所述步骤(5)中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为15～25min。
作为优选，所述步骤(6)中缓冲液的用量为微球体积的5～15倍；所述步骤(6)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
作为优选，所述步骤(7)中生物素标记免疫活性蛋白的用量为微球体积的0.5～1.5倍；所述生物素标记HRP的用量为微球体积的0.5～1.5倍；所述生物素标记免疫活性蛋白和生物素标记HRP的浓度为8～12μg/ml，所述步骤(7)中超声的时间为4～6min，超声的功率为100～140W。
本发明还提供了所述制备方法制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
本发明提供了一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球及其制备方法，将微球经过活化、偶联、封闭和生物素亲和素反应后制得用于ELISA试剂盒信号放大的微球。本申请制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球能够代替传统方法中的酶标记物，提高ELISA试剂盒灵敏度，可使ELISA的灵敏度在原来基础上提高20～50倍。同时简化试剂盒样品前处理操作，省去样品前处理需要吹干复溶的操作和净化操作，缩短了操作时间。可以省去一些净化操作，通过提高稀释倍数减少样品干扰，从而不需要进行净化操作，简化操作方法，缩短前处理时间；可以省去吹干复溶操作，降低操作复杂度，缩短操作时间，提高ELISA试剂盒灵敏度后，不需要通过吹干复溶严格控制样品前处理稀释倍数，且前处理试剂可以选择环保低成本的试剂，不需要选择沸点低易挥发的有机试剂。本发明制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球可使一个二抗上连接1000个以上HRP，与传统一个二抗上最多连接4个HRP相比，信号放大至少250倍。
附图说明
图1为本发明制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球的结构示意图，其中1表示微球，2表示链霉亲和素，3表示生物素；4表示HRP，5表示免疫活性蛋白。
具体实施方式
本发明提供了一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活化缓冲液和微球混合后超声处理，得物料1；
(2)将物料1和活化剂溶液混合，超声后离心，弃上清得物料2；
(3)将物料2和偶联缓冲液混合，超声得物料3；
(4)将物料3和链霉亲和素溶液混合，超声后得物料4；
(5)将物料4和封闭剂混合，超声后离心，弃上清得物料5；
(6)将物料5和缓冲液混匀后超声处理后得物料6；
(7)将物料6、生物素标记免疫活性蛋白和生物素标记HRP混合，超声后得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
在本发明中，所述微球优选为聚苯乙烯羧基荧光微球、聚苯乙烯羧基微球或二氧化硅羧基微球。
在本发明中，所述步骤(1)中的微球使用前优选经过清洗。
在本发明中，所述清洗的方法优选为：将活化缓冲液和微球混匀并离心，弃上清，得到清洗后的微球。
在本发明中，所述清洗时活化缓冲液和微球的体积比优选为80～120：1，进一步优选为90～110：1，再进一步优选为100：1。
在本发明中，所述清洗时离心的转速优选为11000～13000rpm，进一步优选为11500～12500rpm，再进一步优选为12000rpm。
在本发明中，所述清洗时离心的时间为25～35min，进一步优选为28～32min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述活化缓冲液优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液或柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
在本发明中，所述活化缓冲液的pH值优选为5～7，进一步优选为5.5～6.5，再进一步优选为6。
在本发明中，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液优选还含有0.04～0.06％SDS，进一步优选为含有0.05％SDS。
在本发明中，所述微球的粒径优选为50～500nm，进一步优选为80～200nm，再进一步优选为100nm。
在本发明中，所述步骤(1)中活化缓冲液和微球的体积比优选为80～120：1，进一步优选为90～110：1，再进一步优选为100：1。
在本发明中，所述步骤(1)中超声的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述步骤(1)中超声的功率优选为250～300W，进一步优选为260～290W，再进一步优选为270～280W。
在本发明中，所述步骤(2)中的活化剂优选为DCC、NHS、DMAP、EDC或S-NHS。
在本发明中，所述活化剂溶液中活化剂的浓度优选为0.9～1.1mg/ml，进一步优选为1mg/ml。
在本发明中，所述步骤(2)中超声的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述步骤(2)中超声的功率优选为100～140W，进一步优选为110～130W，再进一步优选为120W。
在本发明中，所述步骤(2)中离心的转速优选为11000～13000rpm，进一步优选为11500～12500rpm，再进一步优选为12000rpm。
在本发明中，所述步骤(2)中离心的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述活化剂为含有DCC的活化缓冲液+含有NHS的活化缓冲液时，两者的体积相等，活化剂溶液的用量优选为微球体积的15～25倍，进一步优选为微球体积的19～21倍，再进一步优选为微球体积的20倍。
在本发明中，所述活化剂溶液为含有DMAP的活化缓冲液时，活化剂溶液的用量优选为微球体积的3～7倍，进一步优选为微球体积的4～6倍，再进一步优选为微球体积的5倍。
在本发明中，所述活化剂为含有DCC的活化缓冲液+含有DMAP的活化缓冲液时，两者的体积相等，活化剂溶液的用量优选为微球体积的15～25倍，进一步优选为微球体积的19～21倍，再进一步优选为微球体积的20倍。
在本发明中，所述步骤(3)中的偶联缓冲液优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液或柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
在本发明中，所述偶联缓冲液的pH值优选为6～8，进一步优选为6.5～7.5，再进一步优选为7。
在本发明中，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液优选还含有0.04～0.06％SDS，进一步优选为含有0.05％SDS。
在本发明中，所述偶联缓冲液的用量优选为微球体积的45～55倍，进一步优选为微球体积的48～52倍，再进一步优选为微球体积的50倍。
在本发明中，所述步骤(3)中超声的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述步骤(3)中超声的功率优选为250～300W，进一步优选为260～290W，再进一步优选为270～280W。
在本发明中，所述步骤(4)中的链霉亲和素溶液优选为含有链霉亲和素的偶联缓冲液。
在本发明中，所述链霉亲和素溶液中链霉亲和素的浓度优选为20～40μg/ml，进一步优选为30μg/ml。
在本发明中，所述链霉亲和素溶液的用量优选为微球体积的45～55倍，进一步优选为微球体积的48～52倍，再进一步优选为微球体积的50倍。
在本发明中，所述步骤(4)中超声的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述步骤(4)中超声的功率优选为100～140W，进一步优选为110～130W，再进一步优选为120W。
在本发明中，所述步骤(5)中的封闭剂优选为甘氨酸、酪蛋白、BSA或DB1130。
在本发明中，所述封闭剂的的质量浓度优选为1～10％，进一步优选为3～7％，再进一步优选为5％。
在本发明中，所述封闭剂的用量优选为微球体积的2～6倍，进一步优选为微球体积的2.8～5.5倍，再进一步优选为微球体积的4倍。
在本发明中，所述步骤(5)中超声的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，再进一步优选为30min。
在本发明中，所述步骤(5)中超声的功率优选为100～140W，进一步优选为110～130W，再进一步优选为120W。
在本发明中，所述步骤(5)中离心的转速优选为11000～13000rpm，进一步优选为11500～12500rpm，再进一步优选为12000rpm。
在本发明中，所述步骤(5)中离心的时间优选为15～25min，进一步优选为18～22min，再进一步优选为20min。
在本发明中，所述步骤(6)中的缓冲液优选为PBS缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液或pH＝7.4的10mM PBS+1％BSA+8％蔗糖+0.03％Proclin-300。
在本发明中，所述步骤(6)中混匀的方法优选为：将物料5和缓冲液混合后震荡2min，用紫外灯观察，若仍有微球没有充分分散，可用移液器吹打直到微球均匀分散。
在本发明中，所述缓冲液的用量优选为微球体积的5～15倍，进一步优选为微球体积的8～12倍，再进一步优选为微球体积的10倍。
在本发明中，所述步骤(6)中超声的时间为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述步骤(6)中超声的功率优选为250～300W，进一步优选为260～290W，再进一步优选为270～280W。
在本发明中，所述步骤(7)中生物素标记免疫活性蛋白的用量优选为微球体积的0.5～1.5倍，进一步优选为微球体积的0.9～1.1倍，再进一步优选为微球体积的1倍。
在本发明中，所述步骤(7)中生物素标记免疫活性蛋白的种类优选为生物素标记的抗原、生物素标记的抗体或生物素标记的二抗。
在本发明中，所述抗原优选为黄曲霉毒素B1抗原、呕吐毒素抗原、四环素抗原、克伦特罗抗原、白介素6抗原或β-人绒毛促性腺激素抗原。
在本发明中，所述二抗优选为羊抗鼠二抗。
在本发明中，所述步骤(7)中生物素标记HRP的用量优选为微球0.5～1.5倍，进一步优选为微球体积的0.9～1.1倍，再进一步优选为微球体积的1倍。
在本发明中，所述步骤(7)中超声的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述步骤(7)中超声的功率优选为，进一步优选为100～140W，进一步优选为110～130W，再进一步优选为120W。
本发明还提供了所述制备方法制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)洗球：选择粒径185nm的聚苯乙烯羧基荧光微球，取清洗干净的1.5mL离心管，加0.95ml pH＝7的含有0.05％SDS的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和10μl微球，11000rpm条件下离心35min；
(2)重悬：离心后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加0.95mL pH＝7的含有0.05％的SDS磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，250w超声6min重悬微球；
(3)活化：用pH＝7的含有0.05％的SDS磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液分别溶解DCC和NHS，得到1mg/ml的DCC溶液和1mg/ml的NHS溶液；
向步骤(2)得到的重悬微球溶液中添加DCC溶液100μl和NHS溶液100μl，100W超声35min活化微球表面羧基基团，11000rpm离心35min；
(4)偶联：离心结束后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加0.48mLpH＝7.5的含有+0.05％SDS的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，250W超声6min重悬微球；
用pH＝7.5的含有0.05％SDS的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解链霉亲和素得到40μg/ml的链霉亲和素溶液；每管加链霉亲和素0.48mL，100W超声35min使链霉亲和素与微球上的活性羧基基团共价偶联；
(5)封闭：偶联结束后向每管微球中加入5％甘氨酸28μl，100W超声35min封闭微球表面剩余活化羧基基团，11000rpm离心25min；
(6)缓冲液重悬：离心好的微球，用紫外手电照射观察，多数沉在管底，有少量贴壁，吸去上清，加0.08mL缓冲液，得到微球混合液；
(7)生物素亲和素反应：将微球混合液在250W超声6min，先后添加12μg/ml生物素标记二抗9μl和12μg/ml生物素标记HRP 9μl，100W超声6min后即得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
实施例2
(1)洗球：选择粒径100nm的聚苯乙烯羧基微球，取清洗干净的1.5mL离心管，加1.05ml pH＝5.5的PBS缓冲液和10μl微球，13000rpm条件下离心25min；
(2)重悬：离心后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加1.05mLpH＝5.5的PBS缓冲液，300w超声4min重悬微球；
(3)活化：用pH＝5.5的PBS缓冲液溶解DMAP得到1mg/ml的DMAP溶液；
向步骤(2)得到的重悬微球溶液中添加DMAP溶液50μl，140W超声25min活化微球表面羧基基团，13000rpm离心25min；
(4)偶联：离心结束后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加0.52mLpH＝6.8的PBS缓冲液，300W超声4min重悬微球；
用pH＝6.8的PBS缓冲液溶解链霉亲和素得到40μg/ml的链霉亲和素溶液；每管加链霉亲和素0.52mL，140W超声25min使链霉亲和素与微球上的活性羧基基团共价偶联；
(5)封闭：偶联结束后向每管微球中加入5％BSA55μl，140W超声25min封闭微球表面剩余活化羧基基团，13000rpm离心15min；
(6)缓冲液重悬：离心好的微球，用紫外手电照射观察，多数沉在管底，有少量贴壁，吸去上清，每管加0.12mL缓冲液，得到微球混合液；
(7)生物素亲和素反应：将微球混合液在300W超声4min，先后添加8μg/ml生物素标记二抗11μl和8μg/ml生物素标记HRP 11μl，140W超声4min后即得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
实施例3
(1)洗球：选择粒径80nm的聚苯乙烯羧基微球，取清洗干净的1.5mL离心管，加1mlpH＝5的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液和10μl微球，12000rpm条件下离心30min；
(2)重悬：离心后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加1mL pH＝5的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，280w超声5min重悬微球；
(3)活化：用pH＝5的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液溶解DMAP得到1mg/ml的DMAP溶液；
向步骤(2)得到的重悬微球溶液中添加DMAP溶液50μl，120W超声30min活化微球表面羧基基团，12000rpm条件下离心30min；
(4)偶联：离心结束后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加0.5mLpH＝6的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，280W超声5min重悬微球；
用pH＝6的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液溶解链霉亲和素得到20μg/ml的链霉亲和素溶液；每管加的链霉亲和素溶液0.5mL，120W超声30min使链霉亲和素与微球上的活性羧基基团共价偶联；
(5)封闭：偶联结束后向每管微球中加入5％酪蛋白50μl，120W超声30min封闭微球表面剩余活化羧基基团，12000rpm条件下离心20min；
(6)缓冲液重悬：离心好的微球，用紫外手电照射观察，多数沉在管底，有少量贴壁，吸去上清，每管加0.1mL缓冲液，得到微球混合液；
(7)生物素亲和素反应：将微球混合液在280W超声5min，先后添加10μg/ml生物素标记二抗10μl和10μg/ml生物素标记HRP10μl，120W超声5min即得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
实施例4
(1)洗球：选择粒径200nm的二氧化硅羧基微球，取清洗干净的1.5mL离心管，加1mlpH＝6的PBS缓冲液和10μl微球，12000rpm条件下离心30min；
(2)重悬：离心后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加1mL pH＝6的PBS缓冲液，280w超声5min重悬微球；
(3)活化：用pH＝6的PBS缓冲液分别溶解DCC和DMAP，得到1mg/ml的DCC溶液和1mg/ml的DMAP溶液；
向步骤(2)得到的重悬微球溶液中添加DCC溶液100μl和DMAP溶液100μl，120W超声30min活化微球表面羧基基团，12000rpm条件下离心30min；
(4)偶联：离心结束后取出管，用紫外手电筒照管，观察微球离心情况，正常微球沉在管底，壁上可能粘附少量微球，吸去上清，再向离心管中加0.5mLpH＝6.8的PBS缓冲液，280W超声5min重悬微球；
用pH＝6.8的PBS缓冲液溶解链霉亲和素得到40μg/ml的链霉亲和素溶液；每管加链霉亲和素0.5mL，120W超声30min使链霉亲和素与微球上的活性羧基基团共价偶联；
(5)封闭：偶联结束后向每管微球中加入10％DB113050μl，120W超声30min封闭微球表面剩余活化羧基基团，12000rpm条件下离心20min；
(6)缓冲液重悬：离心好的微球，用紫外手电照射观察，多数沉在管底，有少量贴壁，吸去上清，每管加0.1mL缓冲液，得到微球混合液；
(7)生物素亲和素反应：将微球混合液在280W超声5min，先后添加10μg/ml生物素标记呕吐毒素抗原10μl和10μg/ml生物素标记HRP10μl，120W超声5min即得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
试验例1
黄曲霉毒素B1抗原0.2ug/ml包被酶标板，分别用传统ELISA方法和信号放大方法测试标曲灵敏度。
试剂准备：
传统ELISA方法：黄曲霉毒素B1抗体1ug/ml；酶标二抗0.5ug/ml；黄曲霉毒素B1标品：0ppt，1ppt，5ppt，25ppt，50ppt，200ppt，800ppt，1600ppt；显色液；终止液。
信号放大方法：黄曲霉毒素B1抗体0.01ug/ml；实施例1中制备的用于信号放大的微球；黄曲霉毒素B1标品：0ppt，1ppt，5ppt，25ppt，50ppt，200ppt，800ppt，1600ppt；显色液；终止液。
灵敏度测试方法：
传统ELISA方法：取黄曲霉毒素B1抗原0.2ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入黄曲霉毒素B1标品：0ppt，1ppt，5ppt，25ppt，50ppt，200ppt，800ppt，1600ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入黄曲霉毒素B1抗体1ug/ml 50ul，加入酶标二抗0.5ug/ml50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
信号放大方法：取黄曲霉毒素B1抗原0.2ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入黄曲霉毒素B1标品：0ppt，1ppt，5ppt，25ppt，50ppt，200ppt，800ppt，1600ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入黄曲霉毒素B1抗体0.01ug/ml 50ul，加入微球50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
结果：
传统ELISA方法：
灵敏度50ppt，IC50＝398ppt；
信号放大方法：
灵敏度1ppt，IC50＝9.6ppt；
结论：信号放大方法比传统ELISA方法灵敏度提高50倍。(此处灵敏度指B/B0小于85％的最大标品浓度。)
试验例2
玉米赤霉烯酮抗原3ug/ml包被酶标板，分别用传统方法和信号放大方法测试标曲灵敏度。
试剂准备：
传统ELISA方法：玉米赤霉烯酮抗体1ug/ml；酶标二抗0.5ug/ml；玉米赤霉烯酮标品：0ppt，4ppt，20ppt，100ppt，200ppt，400ppt，800ppt，1600ppt；显色液；终止液。
信号放大方法：玉米赤霉烯酮抗体0.04ug/ml；实施例2中制备的用于信号放大的微球；玉米赤霉烯酮标品：0ppt，4ppt，20ppt，100ppt，200ppt，400ppt，800ppt，1600ppt；显色液；终止液。
灵敏度测试方法：
传统ELISA方法：取玉米赤霉烯酮抗原3ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入玉米赤霉烯酮标品：0ppt，4ppt，20ppt，100ppt，200ppt，400ppt，800ppt，1600ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入玉米赤霉烯酮抗体1ug/ml 50ul，加入酶标二抗0.5ug/ml50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
信号放大方法：取玉米赤霉烯酮抗原3ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入玉米赤霉烯酮标品：0ppt，4ppt，20ppt，100ppt，200ppt，400ppt，800ppt，1600ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入玉米赤霉烯酮抗体0.04ug/ml 50ul，加入微球50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
结果：
传统ELISA方法：
灵敏度100ppt，IC50＝552ppt；
信号放大方法：
灵敏度4ppt，IC50＝22.3ppt；
结论：信号放大方法比传统ELISA方法灵敏度提高25倍。(此处灵敏度指B/B0小于85％的最大标品浓度。)
试验例3
氟苯尼考抗原0.6ug/ml包被酶标板，分别用传统方法和信号放大方法测试标曲灵敏度。
试剂准备：
传统ELISA方法：氟苯尼考抗体0.2ug/ml；酶标二抗0.5ug/ml；氟苯尼考标品：0ppt，1ppt，5ppt，20ppt，40ppt，80ppt，160ppt，320ppt；显色液；终止液。
信号放大方法：氟苯尼考抗体0.01ug/ml；实施例3中制备的用于信号放大的微球；氟苯尼考标品：0ppt，1ppt，5ppt，20ppt，40ppt，80ppt，160ppt，320ppt；显色液；终止液。
灵敏度测试方法：
传统ELISA方法：取氟苯尼考抗原0.6ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入氟苯尼考标品：0ppt，1ppt，5ppt，20ppt，40ppt，80ppt，160ppt，320ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入氟苯尼考抗体0.2ug/ml50ul，加入酶标二抗0.5ug/ml 50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
信号放大方法：取氟苯尼考抗原0.6ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入氟苯尼考标品：0ppt，1ppt，5ppt，20ppt，40ppt，80ppt，160ppt，320ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入氟苯尼考抗体0.01ug/ml 50ul，加入微球50ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
结果：
传统ELISA方法：
灵敏度20ppt，IC50＝128ppt；
信号放大方法：
灵敏度1ppt，IC50＝7.4ppt；
结论：信号放大方法比传统ELISA方法灵敏度提高20倍。(此处灵敏度指B/B0小于85％的最大标品浓度。)
试验例4
呕吐毒素抗体5ug/ml和0.1ug/ml包被酶标板，分别用与传统ELISA方法和信号放大方法测试标曲灵敏度。
试剂准备：
传统ELISA方法：HRP酶标记呕吐毒素抗原0.5ug/ml；呕吐毒素标品：0ppt，10ppt，50ppt，250ppt，500ppt，1500ppt，4000ppt，8000ppt；显色液；终止液。
信号放大方法：实施例4中制备的用于信号放大的微球；呕吐毒素标品：0ppt，10ppt，50ppt，250ppt，500ppt，1500ppt，4000ppt，8000ppt；显色液；终止液。
灵敏度测试方法：
传统ELISA方法：取呕吐毒素抗体5ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入呕吐毒素标品：0ppt，10ppt，50ppt，250ppt，500ppt，1500ppt，4000ppt，8000ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入HRP酶标记呕吐毒素抗原0.5ug/ml 100ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
信号放大方法：取呕吐毒素抗体0.1ug/ml包被好的酶标板2条(每条8个孔)，分别加入呕吐毒素标品：0ppt，10ppt，50ppt，250ppt，500ppt，1500ppt，4000ppt，8000ppt各50ul，每个浓度2个平行。每孔加入微球100ul，室温反应30min后洗板，拍干，每孔加100ul显色液室温显色10min后，每孔加50ul终止液，检测。
结果：
传统ELISA方法：
灵敏度500ppt，IC50＝4097.7ppt；
信号放大方法：
灵敏度10ppt，IC50＝65.8ppt；
结论：信号放大方法比传统ELISA方法灵敏度提高50倍。(此处灵敏度指B/B0小于85％的最大标品浓度。)
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球及其制备方法，将微球经过活化、偶联、封闭和生物素亲和素反应后制得用于ELISA试剂盒信号放大的微球。本申请制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球能够代替传统方法中的酶标记物，提高ELISA试剂盒灵敏度，可使ELISA的灵敏度在原来基础上提高20～50倍。同时简化试剂盒样品前处理操作，省去样品前处理需要吹干复溶的操作和净化操作，缩短了操作时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将活化缓冲液和微球混合后超声处理，得物料1；
(2)将物料1和活化剂溶液混合，超声后离心，弃上清得物料2；
(3)将物料2和偶联缓冲液混合，超声得物料3；
(4)将物料3和链霉亲和素溶液混合，超声后得物料4；
(5)将物料4和封闭剂混合，超声后离心，弃上清得物料5；
(6)将物料5和缓冲液混匀后超声处理后得物料6；
(7)将物料6、生物素标记免疫活性蛋白和生物素标记HRP混合，超声后得到用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
2.根据权利要求1所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的微球使用前经过清洗，所述清洗的方法为：将活化缓冲液和微球混匀并离心，弃上清，得到清洗后的微球；所述活化缓冲液和微球混匀后微球的体积比为80～120：1，所述清洗过程中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为25～35min。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述微球为聚苯乙烯羧基荧光微球、聚苯乙烯羧基微球或二氧化硅羧基微球；所述微球的粒径为50～500nm；所述活化缓冲液为pH值为5～7的有缓冲能力的缓冲液；所述步骤(1)中活化缓冲液和微球的体积比为80～120：1，所述步骤(1)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
4.根据权利要求3所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的活化剂为DCC、NHS、DMAP、EDC或S-NHS；所述活化剂溶液中活化剂的浓度为0.9～1.1mg/ml；所述步骤(2)中超声的时间为25～35min，超声的功率为100～140W，所述步骤(2)中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为25～35min；
所述活化剂溶液为含有DCC的活化缓冲液+含有NHS的活化缓冲液时两者的体积相等，活化剂溶液的用量为微球体积的15～25倍；
所述活化剂溶液为含有DMAP的活化缓冲液时，活化剂溶液的用量为微球体积的3～7倍；
所述活化剂溶液为含有DCC的活化缓冲液+含有DMAP的活化缓冲液时两者的体积相等，活化剂溶液的用量为微球体积的15～25倍。
5.根据权利要求4所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的偶联缓冲液为pH值为6～8的有缓冲能力的缓冲液；所述偶联缓冲液的用量为微球体积的45～55倍；所述步骤(3)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
6.根据权利要求5所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的链霉亲和素溶液为含有链霉亲和素的偶联缓冲液，所述链霉亲和素溶液中链霉亲和素的浓度为20～40μg/ml；所述链霉亲和素溶液的用量为微球体积的45～55倍；所述步骤(4)中超声的时间为25～35min，超声的功率为100～140W。
7.根据权利要求6所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的封闭剂为甘氨酸、酪蛋白、BSA或DB1130，所述封闭剂的的质量浓度为1～10％；所述封闭剂的用量为微球体积的2～6倍；所述步骤(5)中超声的时间为25～30min，超声的功率为100～140W，所述步骤(5)中离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为15～25min。
8.根据权利要求7所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中缓冲液的用量为微球体积的5～15倍；所述步骤(6)中超声的时间为4～6min，超声的功率为250～300W。
9.根据权利要求8所述的一种用于ELISA试剂盒信号放大的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中生物素标记免疫活性蛋白的用量为微球体积的0.5～1.5倍；所述生物素标记HRP的用量为微球体积的0.5～1.5倍；所述生物素标记免疫活性蛋白和生物素标记HRP的浓度为8～12μg/ml，所述步骤(7)中超声的时间为4～6min，超声的功率为100～140W。
10.权利要求1～9任意一项所述制备方法制备的用于ELISA试剂盒信号放大的微球。
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