CN104086647B - 一种孕酮人工抗原合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种孕酮人工抗原合成方法，属于生物化工技术领域。本发明利用孕酮类似物化合物Ⅰ上特有的羟基作为反应基团，和2‑溴乙酸反应得到孕酮半抗原，采用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白BSA相连合成孕酮人工抗原或将半抗原与载体蛋白OVA相连合成包被原。本方法成功的合成孕酮人工抗原，合成过程简单，合成产物充分的暴露多种激素甾体环结构相同的部分，用于免疫分析中，可以得到群选性孕酮单克隆抗体，满足国家孕激素多重检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种孕酮人工抗原合成方法，得到的新型人工抗原可以用到免疫分析领域，属于生物化工技术领域。
背景技术
孕酮（Progesterone，P）属于天然孕激素，是由卵巢黄体分泌，维持妊娠所必须，又称为黄体酮，是一种助孕素。临床医学方面主要用于习惯性流产、痛经、经血过多或血崩症、闭经等。大量口服也用于经前综合征、排卵停止所致月经紊乱、良性乳腺病、绝经前和绝经期等。孕酮属于内源性激素，机体可以产生，孕早期大量的摄入可导致胎儿脊柱、肛门、四肢等部位发生畸形的概率增加。现有的检测孕酮方法是仪器检测，其中包括高效液相色谱法（HPLC）、液质联用（LC-MS）、气质联用（GC-MS）等。这些方法检测结果准确，灵敏度高，但是样品前处理过程繁琐，检测耗时，不能满足现场大批量快速检测的需求。相比较，酶联免疫分析技术（ELISA）可以在短时间内完成现场快速大批量检测。 ELISA最关键的步骤就是免疫原的设计与合成，目前合成孕酮免疫原的方法都是在孕酮原有的结构上引入或者改变基团，得到的多数是特异性抗体。本发明利用孕酮的类似物17α-甲基-17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮D环17位碳上的羟基，修饰带有羧基连接蛋白，充分暴露孕激素的共同结构，使得筛选高效群选性孕酮单克隆抗体成为可能。
发明内容
本发明的目的是为了避免改造孕酮和其他孕激素的共同结构，提供了一种新型的孕酮半抗原和人工抗原的合成方法，为制备群选性孕酮单克隆抗体奠定基础。
本发明的技术方案，一种孕酮人工抗原合成方法，以孕酮类似物
化合物Ⅰ
为原料，通过氢氧化钾和2-溴乙酸进行取代，得到孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到孕酮人工抗原，用紫外鉴定结果。
具体合成步骤如下：
（1）孕酮半抗原的制备：化合物Ⅰ 34.4mg（0.1mmol）溶解于3 mL无水二甲亚砜，加入氢氧化钾粉末208.5mg（1.5mmol），充分溶解后溶液为淡黄色，称为A液。2-溴乙酸27.8mg（0.2mmol）溶解于1.4mL二甲亚砜中，缓慢的滴加到A液中，颜色逐渐变为深黄色，室温反应4h。用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色孕酮半抗原（P-hapten）粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。
（2）孕酮人工抗原的制备：称取孕酮半抗原4.02mg（0.01mmol，Mw=402）溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF），置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入5.94μL（0.025mmol,Mw=185.35,ρ=0.78）三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入3.24μL（0.025mmol，Mw=136.6，ρ=1.053）氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌2h，得活化后小分子溶液B液。称取载体蛋白BSA10.6mg（0.00016mmol，Mw=64000）溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将小分子溶液B液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到产品孕酮人工抗原混合液。
将透析袋剪取约8.0cm，煮沸10min，冲洗多次，将孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三天，6-8h更换一次透析液，透析结束后取出孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用。
该孕酮人工抗原作为免疫原。将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
合成路线如下：
。
（3）孕酮人工抗原鉴定：紫外分光光度法对孕酮人工抗原鉴定。在偶联的过程中，利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，偶联产物会因为光谱叠加原理有二种偶联物质的吸收峰，由此得出偶联是否成功。
酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价：
（1）包被：用0.05M、pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释包被抗原，每孔100μL，37℃孵育2h；
（2）洗涤：倾去板内溶液，每孔200μL PBST溶液，置于摇床振荡3 min，甩干，连续3次洗涤；以下洗涤方法相同；
（3）封闭：拍干洗涤液，每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育2h；洗涤后烘干备用；
（4）加样：酶标板上半部分加入PBS，每孔50μL（称为0标），下半部分加入等量不同浓度的孕酮标准品（称为加标，用PBS稀释），将抗血清从1:1000开始梯度稀释，每孔50μL，上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μL，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
（5）显色：充分洗涤酶标板后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15 min；
（6）终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
（7）结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
本发明的有益效果：本发明成功改造孕酮类似物上的羟基，得到孕酮半抗原，采用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白BSA相连合成孕酮人工抗原或将半抗原与载体蛋白OVA相连合成包被原。合成过程简单，产物充分暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性孕酮单克隆抗体奠定基础，满足国内对孕激素多重检测的需求。
附图说明
图1 孕酮半抗原LC-MS图；
(a)紫外图；(b) 色谱图；(c) 质谱图，质谱图目标质核比402，负离子。
图2 孕酮人工抗原紫外光谱图；
BSA：牛血清白蛋白；OVA：鸡血清白蛋白；P-hapten：孕酮半抗原；P-hapten-OVA：包被原；P-hapten-BSA：免疫原。
具体实施方式
实施例1
（1）孕酮半抗原的制备：化合物Ⅰ 34.4mg（0.1mmol）溶解于3 mL无水二甲亚砜，加入氢氧化钾粉末208.5mg（1.5mmol），溶液为淡黄色，称为A液。2-溴乙酸27.8mg（0.2mmol）溶解于1.4 mL无水二甲亚砜中，缓慢的滴加到A液中，颜色逐渐变为深黄色，室温反应4h。用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色孕酮半抗原（P-hapten）粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。鉴定结果如图1所示，质谱图目标质核比402，负离子。
（2）孕酮人工抗原的制备：称取孕酮半抗原4.02mg（0.01mmol，Mw=402）溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF），置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入5.94μL（0.025mmol，Mw=185.35，ρ=0.78）三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入3.24μL（0.025mmol，Mw=136.6，ρ=1.053）氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌2h，得活化后小分子溶液B液。称取载体蛋白BSA10.6mg（0.00016mmol，Mw=64000）溶解于pH9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将B液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到孕酮人工抗原混合液。
将透析袋剪取约8.0cm，煮沸10min，冲洗多次，将孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三天，6-8h更换一次透析液，透析结束后取出孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用。
该孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
（3）孕酮人工抗原鉴定：
紫外分光光度法对孕酮完全抗原鉴定，鉴定结果如图2所示。在偶联的过程中，利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，偶联产物会因为光谱叠加原理有二种偶联物质的吸收峰，由此得出偶联是否成功。
酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价：
（1）包被：用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释包被抗原，每孔100μL，37℃孵育2h；
（2）洗涤：倾去板内溶液，每孔200μL PBST溶液，置于摇床振荡3min，甩干，连续3次洗涤；以下洗涤方法相同；
（3）封闭：拍干洗涤液，每孔加入200μL 封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：酶标板上半部分加入PBS，每孔50μL（称为0标），下半部分加入等量不同浓度的孕酮标准品（称为加标，用PBS稀释），将抗血清从1:1000开始梯度稀释，每孔50μL，上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μL，37℃孵育30 min，洗涤后拍干；
（5）显色：充分洗涤酶标板后，每孔加入100 uL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15 min；
（6）终止和测定：取出酶标板，每孔加入50 μL 终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
（7）结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
鉴定结果如表1所示，孕酮IC50=0.5ppb，甲羟孕酮IC50=0.1ppb。
表1
。
Claims (2)
1.一种孕酮人工抗原合成方法，其特征在于：以孕酮类似物
化合物Ⅰ
为原料，通过氢氧化钾和2-溴乙酸进行取代，得到孕酮半抗原，然后利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到孕酮人工抗原；
具体步骤为：
（1）孕酮半抗原的制备：取化合物Ⅰ0.1mmol溶解于3mL无水二甲亚砜中，加入氢氧化钾粉末1.5mmol，充分溶解后溶液为淡黄色，命名为A液；取2-溴乙酸0.2mmol充分溶解于1.4mL无水二甲亚砜中，缓慢的滴加到A液中，颜色逐渐变为深黄色，室温反应4h；用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色孕酮半抗原P-hapten粉末，产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定；
（2）孕酮人工抗原的制备：称取步骤（1）制备的孕酮半抗原0.01mmol，溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入0.025mmol氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌2h，得活化后小分子溶液B液；称取载体蛋白BSA 0.00016mmol溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴条件下，将小分子溶液B液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h；反应结束后，将溶液离心，取上清，即得到产品孕酮人工抗原混合液；
将孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS中透析三天，6-8h更换一次透析液，透析结束后取出孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在-20℃保存，备用。
2.根据权利要求1所述孕酮人工抗原合成方法，其特征在于：将步骤（2）中所用载体蛋白替换为OVA，合成的完全抗原为包被原。
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