CN105061339A - 一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用。本发明提供的半抗原为式(Ⅰ)所示的化合物。本发明还保护一种人工抗原，为式(Ⅰ)所示化合物与载体蛋白的偶联物。以所述人工抗原为免疫原得到的抗体也属于本发明的公开范围。本发明还保护用标记酶标记式(Ⅰ)所示化合物得到的酶标抗原。本发明可在喹乙醇残留标志物检测中发挥重要作用。

Description

一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

背景技术

喹乙醇(OLA)，分子式C₁₂H₁₃N₃O₄，是喹噁啉类抗菌药物的典型代表，其主要代谢物为3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)。由于OLA对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性(即致畸、致突变和致癌)，很多国家规定禁止或限制使用OLA，我国规定只能用于35kg以下的仔猪。MQCA为指定的喹乙醇的主要残留标志物，用于监控OLA在畜牧生产中的违禁使用情况。欧盟、美国和中国分别制定了MQCA的最高残留限量(MRLs)。我国规定MQCA在猪肝和猪肉中的最高残留限量分别为50μg/kg和4μg/kg。

利用仪器方法检测MQCA的技术相对复杂、耗时长、成本高，而酶联免疫方法(ELISA)具有快速、灵敏、简便、高效等优点，能满足目前生产链所需要的大量样本的快速筛选和现场检测的要求。该技术研究的关键是半抗原分子的设计与合成、人工抗原与抗体的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种半抗原、其人工抗原及其在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

本发明提供的半抗原为式(Ⅰ)所示的化合物；

本发明还保护式(Ⅰ)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)乙酰乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亚胺和4-硝基邻苯二胺发生反应，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干；

(2)取步骤(1)的产物，在无水乙醇中与氯化亚锡发生反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸干；

(3)取步骤(2)的产物，在甲醇和水中与氢氧化锂发生反应，减压蒸干，得到式(Ⅰ)所示化合物。

式(Ⅰ)所示化合物的制备方法具体包括如下步骤：

(1)将650mg乙酰乙酸乙酯溶于20mL蒸馏水，然后加入1.06gN-溴代丁二酰亚胺并室温反应0.5h，然后加入750mg4-硝基邻苯二胺并室温反应16小时，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物2；

(2)将500mg化合物2溶于15mL无水乙醇，然后加入570mg氯化亚锡并室温反应4h，然后加入20mL1MNaOH水溶液，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物3；

(3)取230mg化合物3，溶于甲醇-水混合液(将5mL甲醇和2mL水混合，得到甲醇-水混合液)，然后加入120mg氢氧化锂并室温反应16小时，减压蒸干，得到式(Ⅰ)所示的化合物。

本发明还保护一种人工抗原，为式(Ⅰ)所示化合物与载体蛋白的偶联物。

所述人工抗原的结构式具体如下：

所述载体蛋白可为人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、甲状腺球蛋白(TG)、卵清蛋白(OVA)或血兰蛋白(KLH)等。

所述人工抗原具体可为式(Ⅰ)所示的化合物与人血清白蛋白的偶联物。所述人工抗原中，式(Ⅰ)所示的化合物和人血清白蛋白的偶联物的偶联比具体可为1:8。

所述人工抗原的制备方法包括如下步骤：式(Ⅰ)所示化合物与人血清白蛋白进行重氮偶联反应，得到偶联物。

所述人工抗原的制备方法具体如下：将25mg式(Ⅰ)所示化合物溶于2mL水，然后加入2mL1M盐酸水溶液，然后依次加入20mg亚硝酸钠和200mg人血清白蛋白，混匀，然后2-8℃搅拌反应1-2小时(具体可4℃、120rpm搅拌反应2小时)，然后在PBS缓冲液中透析，得到人工抗原。

本发明还保护所述人工抗原在制备抗体中的应用。

以所述人工抗原为免疫原得到的抗体也属于本发明的公开范围。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述多克隆抗体可为兔源抗体、鼠源抗体、马源抗体、羊源抗体、猪源抗体或豚鼠源抗体。所述抗体具体可为将所述人工抗原免疫新西兰大耳兔后得到的血清。

本发明还保护所述抗体在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

本发明还保护用标记酶标记式(Ⅰ)所示化合物得到的酶标抗原。所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。所述酶标抗原中，所述辣根过氧化物酶可通过EDC法或高碘酸钠法与式(Ⅰ)所示化合物交联。

本发明还包括所述酶标抗原在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

本发明还保护一种用于检测喹乙醇残留标志物的试剂盒，包括所述酶标抗原和所述抗体。

所述试剂盒由如下组件组成：包被有多克隆抗体的酶标板，标准溶液1，标准溶液2，标准溶液3，标准溶液4，标准溶液5，标准溶液6，酶标抗原溶液，浓缩洗涤液，浓缩显色液，显色液稀释液，终止液；

标准溶液1：PBS缓冲液；

标准溶液2：含有0.30μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液3：含有1.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液4：含有3.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液5：含有10.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液6：含有30.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

酶标抗原溶液：将5mg式(Ⅰ)所示化合物溶于1mL水，然后逐滴加入0.5mLEDC水溶液(含5mgEDC)和0.5mLNHS水溶液(含3mgNHS)并混匀，然后4℃搅拌5min，然后加入1mL20mg/mLHRP溶液(将辣根过氧化物酶溶于PBS缓冲液，得到HRP溶液)并4℃、120rpm搅拌反应16小时，然后在生理盐水中透析，得到酶标抗原溶液；

浓缩洗涤液：含有0.5％(质量百分含量)吐温-20的PBS缓冲液；

浓缩显色液：浓度为1mg/ml的四甲基联苯胺溶液(溶剂为二甲基甲酰胺)；

显色液稀释液：含有0.2M磷酸氢二钠和0.2M柠檬酸的水溶液，pH5.0；

终止液：1mol/L硫酸溶液；

包被有多克隆抗体的酶标板的制备方法：①取所述抗体，用包被缓冲液(pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液)稀释，得到蛋白浓度为0.2μg/mL的溶液；②取酶标板，每孔加入150μL步骤①制备的溶液，37℃静置2h，然后4℃静置16小时，弃去孔内液体，用洗涤液(将浓缩洗涤液用水稀释至10倍体积，即为洗涤液)洗涤3次(每次30秒)，拍干；③完成步骤②后，取所述酶标板，每孔加入250μL含5％(质量百分含量)脱脂牛奶的PBS缓冲液，37℃温育1小时，弃去孔内液体，干燥后得到包被有多克隆抗体的酶标板。

以上任一所述喹乙醇残留标志物具体可为3-甲基喹噁啉-2-羧酸。

兽药半抗原的设计总体来说就是对兽药分子的电性和空间性的模拟。半抗原与待测物结构尽可能相似是半抗原设计的一个主要原则。目前制备小分子半抗原的抗体常规方法是选择具有毒理学意义的原型药物或代谢产物作为待测物，设计合成保留待测物分子结构特征并带有活性基团的人工半抗原，通过键合的方法使半抗原和蛋白质载体偶联制备免疫原，经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体。待测物分子中存在-COOH、-OH或-NH₂等易于和蛋白质或间隔臂发生偶联的官能团，常被用作连接点来制备免疫原。目前已有检测MQCA的方法大多数是直接在MQCA分子的-COOH位置设计改造抗原。实际上，在合成人工抗原的过程中，即使半抗原绝大部分的官能团与待测物都是一致的，但在药物分子与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽。以测定喹噁啉类药物研究为例，如果选择在-COOH位置进行人工抗原设计和改造并偶联载体蛋白，MQCA的部分特征性基团和结构(-COOH、氮杂环)不能充分暴露作为B淋巴细胞的抗原表位，进而影响抗体灵敏度或特异性。因此，连接位点的选择对于抗体质量至关重要，这就要求对半抗原进行科学合理的设计与改造。

本发明提供的半抗原，既完整保留喹乙醇残留标志物分子特征性基团和结构(-COOH、氮杂环)，同时又带有便于发生键合反应的连接基团-NH₂(便于通过键合的方法使半抗原和蛋白质载体偶联制备人工抗原)，使得相应的人工抗原能充分暴露并作为B淋巴细胞的抗原表位，进而利于高灵敏度和特异性抗体的制备。

本发明提供的半抗原具有如下优点：(1)制备所需的原料简单、低廉，易于购买；(2)制备所需的化学反应安全、易于操作、重现性好；(3)将半抗原与载体蛋白偶联后免疫动物，所得抗体的效价、特异性都很高，可用于制备酶联免疫试剂盒。

应用本发明提供的酶联免疫试剂盒检测喹乙醇残留标志物，具有如下优点：操作简单，1小时之内可得出测定结果，可同时快速检测大批样品，具有最低检测限低、特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点，本发明可在喹乙醇残留标志物检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为喹乙醇残留标志物半抗原的合成路线示意图。

图2为喹乙醇残留标志物半抗原的核磁共振谱图。

图3为喹乙醇残留标志物酶联免疫检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲均为如下：PBS缓冲液(pH7.2)：含有0.01M磷酸二氢钠和0.01M磷酸氢二钠的水溶液。MQCA：Sigma-Aldrich公司，CAS号：74003-63-7。

实施例1、半抗原的合成和鉴定

一、半抗原的合成

半抗原的合成路线示意图见图1。

(1)将650mg乙酰乙酸乙酯溶于20mL蒸馏水，然后加入1.06gN-溴代丁二酰亚胺(NBS)并室温反应0.5h，然后加入750mg4-硝基邻苯二胺(化合物1)并室温反应16小时，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物2。

(2)将500mg化合物2溶于15mL无水乙醇，然后加入570mg氯化亚锡并室温反应4h，然后加入20mL1MNaOH水溶液，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，减压蒸干，得到化合物3。

(3)取230mg化合物3，溶于甲醇-水混合液(将5mL甲醇和2mL水混合，得到甲醇-水混合液)，然后加入120mg氢氧化锂并室温反应16小时，减压蒸干，得到化合物4。化合物4即为半抗原。

二、半抗原的鉴定

化合物4的LC-MS图谱结果如下(ESI,m/z)：204[M+H]⁺。图谱中，得到m/z比为204的主峰，对应半抗原的[M+H]⁺。

化合物4的核磁共振谱图见图2。¹HNMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.71(d,J＝9.0Hz,1H),7.29(dd,J＝9.0,1.8Hz,1H),6.92(d,J＝1.8Hz,1H),6.13(br,2H),2.68(s,3H)。

以上鉴定结果表明，化合物4的结构式如下：

实施例2、人工抗原的制备和鉴定

一、人工抗原的合成

将25mg实施例1制备的化合物4溶于2mL水，然后加入2mL1M盐酸水溶液，然后依次加入20mg亚硝酸钠和200mg人血清白蛋白，混匀，然后4℃、120rpm搅拌反应2小时(实际应用中2-8℃搅拌反应1-2小时均可，重氮偶联反应)，然后在PBS缓冲液中透析，得到人工抗原溶液(人工抗原即半抗原-人血清白蛋白的偶联物)，-20℃保存备用。

二、人工抗原的鉴定

取步骤一制备的人工抗原溶液，用PBS缓冲液稀释至1mg/mL(以蛋白浓度计)，作为溶液甲；将含1mg/mL化合物4的PBS缓冲液作为溶液乙；将含1mg/mL人血清白蛋白的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(250-400nm)光谱扫描。

与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明半抗原与人血清白蛋白成功偶联。溶液乙在260nm处有最大吸收值，溶液丙在278nm处有最大吸收值。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)分别计算乙、丙化合物的消光系数(K)。分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的半抗原的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比。半抗原和人血清白蛋白的偶联比为8:1，即8个半抗原结合1个人血清白蛋白。

实施例3、多克隆抗体的制备

一、多克隆抗体的制备

采用新西兰大耳兔作为免疫动物，以实施例2中制备的人工抗原为免疫原。首次免疫用乳液按照如下方法配制：2mL浓度为2mg/mL(以蛋白浓度计)的免疫原水溶液与2mL完全弗氏佐剂乳化。加强免疫用乳液按照如下方法配制：2mL浓度为2mg/mL(以蛋白浓度计)的免疫原水溶液与2mL不完全弗氏佐剂乳化。首次免疫采用背部皮下多点注射以及后脚掌趾间注射(免疫原的剂量为1mg/只)；加强免疫采用大腿肌肉注射(免疫原的剂量为0.5mg/只)，每次免疫间隔2周，共加强免疫10次，最后一次不加免疫佐剂直接肌肉注射，最后一次加强免疫7天后采血，收集血清，即为多克隆抗体。

二、多克隆抗体的效价检测(直接竞争ELISA法)

1、取步骤一制备的多克隆抗体，用包被缓冲液(pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液)梯度稀释，得到各个抗体稀释液。

2、取酶标板，每孔加入150μL步骤1制备的抗体稀释液，37℃静置2h，然后4℃静置12小时，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次(每次30秒)，拍干。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入250μL含5％(质量百分含量)脱脂牛奶的PBS缓冲液，37℃温育1小时，弃去孔内液体，干燥。

4、完成步骤3后，取所述酶标板，在不同的孔中分别加入0浓度标准溶液(即PBS缓冲液)和含10ng/mLMQCA的PBS缓冲液(50μL/孔)，然后每孔加入100μL酶标抗原溶液并静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸拍干，然后每孔加入100μL显色液并避光显色15min，最后每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定450nm处吸光值(A₄₅₀值)。加入0浓度标准溶液的孔的吸光度值为B₀。加入含10ng/mLMQCA的PBS

缓冲液的孔的吸光度值为B。

B₀大于1.5且百分吸光度值为50％以下判断为阳性。百分吸光度值越低，抗体灵敏度越高。按此要求血清抗体效价达1:5000。

酶标抗原溶液的制备方法、洗涤液的制备方法、显色液的制备方法和终止液的制备方法见实施例4。

实施例4、酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

试剂盒的组成如下：包被有多克隆抗体的酶标板；A试剂瓶(装有标准溶液1)，B试剂瓶(装有标准溶液2)，C试剂瓶(装有标准溶液3)，D试剂瓶(装有标准溶液4)，E试剂瓶(装有标准溶液5)，F试剂瓶(装有标准溶液6)；G试剂瓶(装有酶标抗原溶液)；H试剂瓶(装有浓缩洗涤液；使用时，将浓缩洗涤液用水稀释至10倍体积，即为洗涤液)；I试剂瓶(装有浓缩显色液；使用时，将浓缩显色液用显色液稀释液稀释，使四甲基联苯胺浓度为0.1mg/mL，即为显色液)；J试剂瓶(装有显色液稀释液)；K试剂瓶(装有终止液)。

二、所用试剂的配制

标准溶液1：PBS缓冲液；

标准溶液2：含有0.30μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液3：含有1.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液4：含有3.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液5：含有10.00μg/LMQCA的PBS缓冲液；

标准溶液6：含有30.00μg/LMQCA的PBS缓冲液。

酶标抗原溶液：将5mg实施例1制备的化合物4溶于1mL水，然后逐滴加入0.5mLEDC水溶液(含5mgEDC)和0.5mLNHS水溶液(含3mgNHS)并混匀，然后4℃搅拌5min，然后加入1mL20mg/mLHRP溶液(将辣根过氧化物酶溶于PBS缓冲液，得到HRP溶液；辣根过氧化物酶购自Roche公司，CAS号为9003-99-0)并4℃、120rpm搅拌反应16小时，然后在生理盐水中透析，得到酶标抗原溶液，-20℃保存备用。

浓缩洗涤液：含有0.5％(质量百分含量)吐温-20的PBS缓冲液。

浓缩显色液：浓度为1mg/ml的四甲基联苯胺溶液(溶剂为二甲基甲酰胺)。

显色液稀释液：含有0.2M磷酸氢二钠和0.2M柠檬酸的水溶液，pH5.0。

终止液：1mol/L硫酸溶液。

三、包被有多克隆抗体的酶标板的制备

包被缓冲液：pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液。

1、取实施例3制备的多克隆抗体，用包被缓冲液稀释，得到蛋白浓度为0.2μg/mL的溶液。

2、取酶标板，每孔加入150μL步骤1制备的溶液，37℃静置2h，然后4℃静置16小时，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次(每次30秒)，拍干。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入250μL含5％(质量百分含量)脱脂牛奶的PBS缓冲液，37℃温育1小时，弃去孔内液体，干燥后得到包被有多克隆抗体的酶标板。

包被有多克隆抗体的酶标板用铝膜真空密封保存。

实施例5、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度试验

检测实施例4制备的试剂盒的灵敏度、特异性、精密度和准确度。

一、样品的前处理及检测方法

1、猪肝、猪肉、鸡肉、鸡蛋样品前处理

(1)称取2(±0.02)g均质样品至50mL离心管中，加入8mL乙酸乙酯，涡旋混匀；

(2)完成步骤(1)后，取所述离心管，加入4mL1.5M盐酸水溶液，涡旋混匀，用振荡器振荡5min，5000r/min室温离心5min，取上清液；

(3)取5mL步骤(2)得到的上清液至另一新的50mL离心管中，加入3mL33.3％(质量百分比)NaCl水溶液，涡旋混匀，5000r/min室温离心5min，取上清液；

(4)取4mL步骤(3)得到的上清液至10mL干净玻璃试管中，于50-60℃水浴氮气流下吹干；

(5)完成步骤(4)后，取所述玻璃试管，加入1mL正己烷，涡旋溶解干燥残留物，然后加入1mL水，涡旋混匀，静置分层；

(6)完成步骤(5)后，取所述玻璃试管，除去上层有机相，取下层水相，用水稀释至两倍体积，即为待测样本溶液。

2、检测方法

(1)制作标准曲线

取包被有多克隆抗体的酶标板，每孔加入50μL标准品溶液(标准溶液1、标准溶液2、标准溶液3、标准溶液4、标准溶液5或标准溶液6)，然后每孔加入100μL酶标抗原溶液并18℃-30℃放置30min，然后用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸拍干，然后每孔加入100μL显色液并避光显色15min，最后每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定450nm处吸光值(A₄₅₀值)。

(B—为标准溶液或待测样本溶液的吸光度平均值；B₀—为标准溶液1的吸光度平均值)

以标准溶液中喹乙醇残留标志物浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，用Excel绘制标准曲线。

50％抑制浓度(即IC₅₀，指标准溶液1吸光度值的50％处所对应的药物浓度)常作为评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。用实施例4制备的试剂盒分别测定10次标准曲线的50％抑制浓度，确定该试剂盒的IC50在1.8-2.1μg/L范围之内。试剂盒标准校正曲线见图3。

(2)待测样本的检测

取包被有多克隆抗体的酶标板，每孔加入50μL待测样本溶液，然后每孔加入100μL酶标抗原溶液并18℃-30℃放置30min，然后用洗涤液洗涤酶标板3次并用吸水纸拍干，然后每孔加入100μL显色液并避光显色15min，最后每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定450nm处吸光值(A₄₅₀值)。从标准曲线上计算出待测样本溶液中喹乙醇残留标志物浓度。

二、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度试验

1、试剂盒灵敏度试验

用实施例4制备的试剂盒测定各个空白样品(已确认不含喹乙醇残留标志物的猪肝、猪肉、鸡肉、鸡蛋，各20份)的A₄₅₀值，每个样品进行3次重复，取三次实验结果的平均值。将各样品的A₄₅₀平均值分别代入标准曲线中，获得各样品中的喹乙醇残留标志物浓度，计算最低检测限(即喹乙醇残留标志物浓度的平均值加3倍标准差)。

实施例4制备的试剂盒对猪肝空白样品、猪肉空白样品、鸡肉空白样品、鸡蛋空白样品的最低检测限依次为0.42、0.23、0.28、0.28μg/kg。

2、特异性测定

选择与MQCA结构和功能类似的5种药物，配制成如下浓度的类似物溶液：0、10、30、100、300、1000μg/L。用类似物溶液代替标准溶液，按照步骤2的方法制作标准曲线，得到各类似物的50％抑制浓度，与MQCA50％抑制浓度相比，得出一系列交叉反应率，结果见表1。

表1交叉反应率

药物名称		交叉反应率％
			MQCA	Sigma-Aldrich公司	100
喹噁啉-2-羧酸	Sigma-Aldrich公司	3.6
			乙酰甲喹	Sigma-Aldrich公司	<0.1
喹乙醇	Sigma-Aldrich公司	<0.1
			卡巴氧	百灵威科技有限公司	<0.1
喹烯酮	百灵威科技有限公司	<0.1

3、准确度、精密度测定

在空白猪肉中添加MQCA标准溶液至终浓度分别为1.0μg/kg、2.0μg/kg和4.0μg/kg。各浓度分别制备样品6份，然后采用实施例4制备的试剂盒分别测定其含量，重复3次。分别计算回收率(回收率＝实测值/添加值×100％)、批内变异系数和批间变异系数。

结果见表2。

表2平均回收率与变异系数的结果

结果表明：实施例4制备的试剂盒在猪肉中1.0μg/kg、2.0μg/kg和4.0μg/kgMQCA添加浓度的回收率为70％-97％；批内变异系数CV≤12％，批间变异系数CV≤10％。

Claims (10)

1.式(Ⅰ)所示的化合物；

2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)乙酰乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亚胺和4-硝基邻苯二胺发生反应，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干；

(2)取步骤(1)的产物，在无水乙醇中与氯化亚锡发生反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸干；

(3)取步骤(2)的产物，在甲醇和水中与氢氧化锂发生反应，减压蒸干，得到权利要求1所述化合物。

3.权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物。

4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于：所述偶联物的制备方法包括如下步骤：权利要求1所述化合物与载体蛋白进行重氮偶联反应，得到偶联物。

5.权利要求3或4所述偶联物在制备抗体中的应用。

6.以权利要求3或4所述偶联物为抗原得到的抗体。

7.权利要求6所述抗体在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

8.用标记酶标记权利要求1所述化合物得到的酶标抗原。

9.权利要求8所述酶标抗原在检测喹乙醇残留标志物中的应用。

10.一种用于检测喹乙醇残留标志物的试剂盒，包括权利要求6所述抗体和权利要求8所述酶标抗原。