CN104892764A

CN104892764A - 一种用于检测克伦特罗或其衍生物的量子点免疫荧光试剂盒

Info

Publication number: CN104892764A
Application number: CN201410081724.3A
Authority: CN
Inventors: 王文珺; 吴小平; 李志平; 金世清; 温凯; 王世恩; 韩京朋; 李杰超; 王照鹏
Original assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明公开了一种用于检测克伦特罗或其衍生物的量子点免疫荧光试剂盒。本发明首先保护一种抗体，是以式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的量子点免疫荧光试剂盒，包括量子点标记的所述抗体。本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。

Description

一种用于检测克伦特罗或其衍生物的量子点免疫荧光试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测克伦特罗或其衍生物的量子点免疫荧光试剂盒。

背景技术

克伦特罗（CL）属于苯乙醇胺类β-兴奋剂，临床医学中主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症，在兽医临床中用作牛、马的产道松弛剂。近年来，克伦特罗作为饲料添加剂，在畜牧业非法使用的情况越来越严重。

多数国家都禁止在动物生产过程中使用克伦特罗。有些国家执行最高残留量（MRLs）限制，如英国规定的MRLs为0.5ng/g，荷兰规定的MRLs为1ng/g。我国明确规定禁止CL及其制剂在食品动物的饲养过程中使用。

目前检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC-UV）﹑气-质联机法（GC-UV）和液-质联机等。这些方法都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测克伦特罗或其衍生物的量子点免疫荧光试剂盒。

本发明首先保护一种抗体，是以式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；

所述载体蛋白具体可为BSA或OVA。

本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的试剂盒，包括所述抗体。所述抗体具体可为兔源多克隆抗体。

本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的量子点免疫荧光试剂盒，包括量子点标记的所述抗体。

“量子点标记的所述抗体”的制备方法具体如下：

①取2.5mg量子点，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入0.96mg EDC和1.15mg NHS，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，即为活化后的量子点；

②取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2.5mg活化后量子点、所述抗体（蛋白质含量为0.15mg）和pH8.5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积为0.8ml），25℃反应3.5小时；

③取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤，用1ml pH7.4、0.02M的PBS缓冲液重悬；

④取步骤③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释至150000倍体积。

本发明还保护以上任一所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦特罗衍生物中的应用。

以上任一所述的克伦特罗衍生物具体可为盐酸克伦特罗。

本发明还保护式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物；

所述载体蛋白可为BSA或OVA。

式（Ⅰ）所示的化合物具体可为按如下方法制备得到的化合物：（1）取200mg盐酸克伦特罗、166mg碳酸钾和15ml DMF，搅拌混匀，然后加入77μL4-溴丁酸，90℃搅拌3h，自然冷却至室温，加入50ml蒸馏水，用1M盐酸水溶液调pH至6.0；（2）取步骤（1）得到的溶液，用乙酸乙酯萃取2次（每次可采用50ml乙酸乙酯），合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为式（Ⅰ）所示的化合物。

本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。

附图说明

图1为量子点的扫描图。

图2为标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的。二甲基甲酰胺(DMF)：sigma,型号：D4551。1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)：sigma，型号：165344。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：sigma,型号：56480。盐酸克伦特罗：sigma,型号：54969。

克伦特罗的结构式如下：

实施例1、免疫原和包被原的制备

一、半抗原的制备

1、取200mg盐酸克伦特罗、166mg碳酸钾和15ml DMF，搅拌混匀，然后加入77μL4-溴丁酸，90℃搅拌3h，自然冷却至室温，加入50ml蒸馏水，用1M盐酸水溶液调pH至6.0。

2、取步骤1得到的溶液，用乙酸乙酯萃取2次（每次采用50ml乙酸乙酯），合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为半抗原。

半抗原的结构式见式（Ⅰ）。

二、免疫原的制备

1、取16.2mg步骤一制备的半抗原，溶于2ml DMF，加入8.6mg EDC和10.4mg NHS，室温搅拌2h。

2、取50mg BSA，溶于5ml0.1M碳酸氢钠水溶液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加至步骤2得到的溶液中，室温搅拌10小时，然后装入透析袋，在PBS缓冲液（pH7.4、0.01M）中进行透析（3天，每天换液2次），得到的溶液即为免疫原溶液。

免疫原的结构式见式（Ⅱ）。

三、包被原的制备

用OVA代替BSA，其它同步骤二，得到包被原溶液。

实施例2、多克隆抗体的制备

取实施例1制备的免疫原溶液，采用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用新西兰大白兔作为免疫动物。

免疫过程如下（免疫剂量以蛋白量计）：

首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/kg·b.w.；

加强免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各进行一次加强免疫，将免疫原稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为1mg/kg·b.w.；

末次免疫：首次免疫16周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释液，免疫剂量为1mg/kg·b.w.。

末次免疫1周后，采血并分离血清，即为免疫原对应的多克隆抗体（简称多克隆抗体甲）。

实施例3、量子点免疫荧光检测试剂盒的组装

量子点购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为该量子点的表征如下：粒径为20nm、粒径的CV为15%，量子产率为60%，表面羧基含量为5×10^-3mmol/mg，水溶性，CdSe/ZnS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm；红色荧光量子点。量子点的扫描图如图1所示。量子点上的羧基与蛋白质上的氨基形成肽键并连接起来。

量子点免疫荧光检测试剂盒包括如下组件：

1、包被了包被原的微孔板

取实施例1制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液即pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液），得到蛋白浓度为5ng/mL的包被原稀释液。将10g牛血清白蛋白、0.1mL proclin300和1000mL pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。

（1）将包被原稀释液加入微孔板（100μL/孔），37℃孵育16小时。

（2）完成步骤（1）后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。

（3）完成步骤（2）后，每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h。

（4）完成步骤（3）后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

2、量子点标记的多克隆抗体工作液

①取2.5mg量子点，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入0.96mg EDC和1.15mg NHS，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，即为活化后的量子点。

②取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2.5mg活化后量子点、实施例2制备的多克隆抗体甲（蛋白质含量为0.15mg）和pH8.5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积为0.8ml），25℃反应3.5小时（多克隆抗体和量子点形成稳定的肽键共价结合）。

③取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%（目的是对剩余活性氨基位点进行封闭），37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤，用1ml pH7.4、0.02M的PBS缓冲液重悬，4℃保存待用。

④取步骤③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释至150000倍体积，得到一抗工作液甲。

3、标准品溶液

将盐酸克伦特罗溶于pH7.4、0.02M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0.002ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL和5ng/mL的标准品溶液。将pH7.4、0.02M的磷酸盐缓冲液作为标准品溶液的阴性对照溶液，称为0溶液。

4、稀释液

pH7.4、0.02M的PBS缓冲液。

5、20×浓缩洗涤液

将1000mL磷酸盐缓冲液（pH7.4、0.5M）与1mL proclin300混合，得到20×浓缩洗涤液（将20×浓缩洗涤液用水稀释至20倍体积，即为洗涤液）。

实施例4、量子点免疫荧光检测试剂盒的使用方法

向包被了包被原的微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液50_μL，一抗工作液甲50_μL，室温反应30min，弃上清，洗涤3次（每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清），用吸水纸拍干，用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长620nm。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值（B）除以0溶液的发光强度值（B₀），再乘以100%，即结合率。计算公式：结合率（%）=B/B₀×100%。以标准品溶液中的盐酸克伦特罗浓度（ng/mL）为X轴，B/B₀为Y轴，绘制标准曲线图（见图2）。根据标准曲线的回归方程可以求出待测样本溶液中克伦特罗或克伦特罗衍生物的浓度。本发明中检测结果的分析可以利用专业软件，可以实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需60分钟就可以完成。结合率（B/B₀）为50%时对应的标准品溶液中的盐酸克伦特罗浓度即为IC₅₀值。根据标准曲线图，IC₅₀=0.024ng/mL。

试剂盒的检测原理：当在微孔板上预包被半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液，随后加入量子点标记的抗体，样本中残留的克伦特罗或克伦特罗衍生物与微孔板上包被的包被原竞争结合量子点标记的抗体，样本荧光强度与样本中克伦特罗或克伦特罗衍生物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗或克伦特罗衍生物的残留量。

对比例、免疫原对照物和包被原对照物的制备

一、制备免疫原对照物

1、取10mg盐酸克伦特罗，溶于1ml0.2mol/L HCl水溶液，置于冰浴中并加入10mg亚硝酸钠，然后室温搅拌30min。

2、取50mg BSA，溶于5ml1mol/L碳酸钠水溶液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析袋，在生理盐水中进行透析（3天，每天换液2次），然后用0.22μm孔径的滤膜进行过滤并收集滤液，即为免疫原对照物溶液。

二、制备包被原对照物

1、取6mg盐酸克伦特罗，溶于1ml0.2mol/L HCl水溶液，在于冰浴中并加入6mg亚硝酸钠，室温搅拌30min。

2、取30mg OVA，溶于5ml1mol/L碳酸钠水溶液。

3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析袋，在生理盐水中进行透析（3天，每天换液2次），然后用0.22μm孔径的滤膜进行过滤并收集滤液，即为包被原对照物溶液。

三、多克隆抗体乙的制备

用免疫原对照物溶液代替免疫原溶液进行实施例2，得到免疫原对照物对应的多克隆抗体（简称多克隆抗体乙）。

四、应用包被原对照物和多克隆抗体乙检测盐酸克伦特罗

用包被原对照物溶液代替包被原溶液进行实施例3的步骤1，得到对照微孔板。

用多克隆抗体乙代替多克隆抗体甲进行实施例3的步骤2，得到一抗工作液乙。

用对照微孔板代替“包被了包被原的微孔板”，用一抗工作液乙代替“一抗工作液甲”，其它同实施例4，IC₅₀值=0.044ng/mL。

实施例5、量子点免疫荧光检测试剂盒的特异性

分别检测8种待测药物（与克伦特罗结构或功能类似物的9种药物）与克伦特罗的交叉反应率。

1、将待测药物溶于pH7.4、0.02M的磷酸盐缓冲液，得到不同浓度的溶液。

2、向包被了包被原的微孔板中加入步骤1制备的溶液50μL，一抗工作液甲50μL，室温反应30min，弃上清，洗涤3次（每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清），用吸水纸拍干，用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长620nm。

交叉反应率（%）=（盐酸克伦特罗的IC₅₀值/待测药物的IC₅₀值）×100%。结果见表1。试剂盒的特异性良好。

表1交叉反应率结果

药物名称		交叉反应率（%）
			盐酸克伦特罗	中国兽药监察所	100
沙丁胺醇	中国兽药监察所	1.0
			西马特罗	中国兽药监察所	1.6
特布他林	中国兽药监察所	＜0.1
			莱克多巴胺	中国兽药监察所	＜0.1
齐帕特罗	中国兽药监察所	＜0.1
			拉贝洛尔	中国兽药监察所	＜0.1
氧烯洛尔	中国兽药监察所	＜0.1
			肾上腺素	中国兽药监察所	＜0.1

实施例6、试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

一、样本前处理的方法（制备空白样本）

尿样（如猪尿）：取不含克伦特罗和盐酸克伦特罗的尿样，澄清的尿液可直接用于检测，若尿液混浊需先3000g离心5min，取50μL上清液用于分析。

肌肉组织或内脏组织（如猪肉或猪肝）：称取5g不含克伦特罗和盐酸克伦特罗的肌肉或内脏，加入10mL0.1mol/L盐酸水溶液匀浆，然后80℃水浴中孵育30分钟，冷却后3000g离心15min，将2mL上清液用1M NaOH水溶液调pH值为7-9，取50μL用于检测。

二、试剂盒保存期实验

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定盐酸克伦特罗的IC₅₀值。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行热加速实验。结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。

表2低温保存实验结果

时间（d）	0	10	20	30	60	90	120	150	180
										IC₅₀(ng/mL)	0.152	0.166	0.155	0.157	0.173	0.161	0.177	0.163	0.157

表3热加速实验

时间（d）	1	2	3	4	5	6
							IC₅₀(ng/mL)	0.161	0.158	0.173	0.167	0.181	0.175

三、灵敏度、精密度、准确度

1、灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样本，检测信号值，计算空白样本荧光强度的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的待测物浓度，计算各对应浓度值的标准差（SD），由平均值加三倍标准差即为该样本的最低检测限，结果见表4。

表4克伦特罗在猪尿和猪肉中的最低检测限

2、精密度

从三批试剂盒（01批、02批、03批）中每批抽取五个试剂盒，测定0.2ng/ml、0.5ng/ml两个浓度（即在猪尿空白样本中加入盐酸克伦特罗），每个浓度设置5个平行，重复5次，根据标准曲线，算出各个RLU对应的浓度值，并计算板内板间变异系数，结果见表5，批内批间变异都＜15%，说明试剂盒的精密性良好。

表5试剂盒的精密度

3、准确度

试剂盒的添加实验反映其准确度。在猪尿空白样本中加入盐酸克伦特罗，使其浓度为0.2ng/ml或0.5ng/ml。猪肉空白样本中加入盐酸克伦特罗，使其浓度为0.3ng/ml或0.5ng/ml。每个浓度5个平行。样本处理后，测定克伦特罗的浓度，同时考虑稀释倍数，代入标准曲线计算回收率，同时计算变异系数（三个批次的试剂盒）。结果见表6和表7。

表6猪尿中克伦特罗添加回收率与变异系数

表7猪肉中克伦特罗添加回收率与变异系数

Claims

1.以式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述载体蛋白为BSA或OVA。

3.一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的试剂盒，包括权利要求1或2所述抗体。

4.一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的量子点免疫荧光试剂盒，包括量子点标记的权利要求1或2所述抗体。

5.权利要求4所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦特罗衍生物中的应用。

6.权利要求4所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦特罗衍生物中的应用。

7.式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物；

8.如权利要求7所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为BSA或OVA。