CN103804490B - 噻苯隆抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噻苯隆抗原及其制备方法与应用。该噻苯隆抗原的结构式如式A所示。本发明提供的噻苯隆抗原的制备方法，包括如下步骤：（1）5-氨基-1,2,3-噻二唑与式B所示含有酯基的苯异氰酸酯进行反应得到式C所示化合物；（2）在酸或碱存在的条件下，式C所示化合物经水解反应得到式D所示化合物；（3）式D所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式E所示化合物；（4）式E所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示噻苯隆抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。用本发明方法制备的噻苯隆抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。

Description

噻苯隆抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种噻苯隆抗原及其制备方法与应用。
背景技术
噻苯隆（Thidiazuron），化学名为1-苯基-3-（1,2,3-噻二唑-5-基）脲，CAS登记号：51707-55-2；分子式为：C9H8N3OS；相对分子量为：220.2。噻苯隆在棉花种植上作落叶剂使用，被植株吸收后，可促进叶柄与茎之间的分离组织自然形成而脱落，是很好的脱叶剂。其化学结构式如下：
目前，噻苯隆的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（HPLC-MS/MS）等。但是这几种检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种噻苯隆抗原及其制备方法与应用。
本发明提供的式A所示噻苯隆抗原，
式A
式A中，n为0~6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。
本发明提供了了式A所示噻苯隆抗原的制备方法，包括如下步骤：
（1）5-氨基-1,2,3-噻二唑与式B所示含有酯基的苯异氰酸酯进行反应得到式C所示化合物；
式B                                                    式C
式B和式C中，n为0~6的整数；
（2）在酸或碱存在的条件下，式C所示化合物经水解反应得到式D所示化合物；
式D
式C中，n为0~6的整数；
（3）式D所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式E所示化合物；
式E
式E中，n为0~6的整数；
（4）式E所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示噻苯隆抗原；所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。
上述的制备方法中，步骤（1）中，式B所示含有酯基的苯异氰酸酯选自4-异氰酸酯基-苯甲酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯乙酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯丙酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯丁酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯戊酸乙酯和4-异氰酸酯基-苯己酸乙酯中至少一种。
上述的制备方法中，步骤（1）中，所述5-氨基-1,2,3-噻二唑与式B所示含有酯基的苯异氰酸酯的摩尔份数比可为（1~10）：1；
所述反应的温度可为0~100℃，时间可为6~48小时；
所述反应的溶剂选自甲苯、苯和二甲苯中至少一种。
上述的制备方法中，步骤（2）中，所述酸选自浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸和甲酸中至少一种；所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾中至少一种。
上述的制备方法中，步骤（3）中，式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比可为1：（1~5）：（1~5）；
式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比可为1：（1~5）：（1~5）；
所述偶联反应的温度可为0~50℃，时间可为4~24小时。
上述的制备方法中，步骤（4）中，式E所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比可为（5~30）：1；
所述偶联反应的温度可为0~50℃，时间可为8~36小时；所述偶联反应在pH值为5~9的条件下进行；
式E所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均可为7.5；
步骤（4）之后，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值可为4~10、浓度可为0.01~0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
本发明提供的噻苯隆抗原是噻苯隆与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式D上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。
本发明还提供了由式A所示噻苯隆抗原制备得到的抗体。
本发明还进一步提供了式A所示噻苯隆抗原和/或抗体在检测样品中噻苯隆中的应用；以及在制备用于检测样品中噻苯隆的酶联免疫试剂盒、噻苯隆的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用，检测样品可为水体、药品、食品或土壤。
本发明提供的制备噻苯隆抗原的制备方法，能够方便、快捷地获得噻苯隆抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的噻苯隆抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本发明的制备噻苯隆抗原的方法及由该方法获得的噻苯隆抗原在噻苯隆的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。
附图说明
图1为噻苯隆抗原的合成路线图。
图2为建立的噻苯隆间接ELISA法标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
5-氨基-1,2,3-噻二唑、4-异氰酸酯基-苯甲酸乙酯、环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS）弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司；羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺（OPD）、氨基乙酸、氨基丙酸等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。
实施例1、噻苯隆-卵清白蛋白（噻苯隆-OVA）抗原的制备
合成路线图如图1所示。
1）式I所示化合物的合成
在三口烧瓶中加入5-氨基-1,2,3-噻二唑（12mmol）和30mL甲苯，搅拌溶解后，加入4-异氰酸酯基-苯甲酸乙酯（10mmol），在70℃下继续反应24h，TLC检测原料基本反应完全后，抽滤，固体部分用少量甲苯洗涤数次，得乳白色粉末状固体。
1H-NMR(DMSO):1.29(t,CH3,3H),4.30(m,CH2,2H),7.65(d,CH,2H),7.93(d,CH,2H),8.69(s,CH,1H),9.88(s,NH,1H),11.01(s,NH,1H).
产品经1H-NMR确证，为式I所示化合物。
式I
2）式Ⅱ所示化合物的合成
将式I所示化合物（5mmol）加入浓盐酸/冰醋酸(15mL，3:2，V:V))中，加热至100℃反应6小时，反应完毕后冷却至室温，加入水30mL，过滤所得固体用少量甲醇洗涤数次，真空干燥，即得式Ⅱ所示化合物。
1H-NMR(DMSO):7.63(d,CH,2H),7.90(d,CH,2H),8.64(s,CH,1H),10.13(s,NH,1H),11.30(s,NH,1H).
HRMS:m/z calcd for C10H9N4O3S(M+H+)265.0390,found 265.0392
式Ⅱ
3）偶联反应
方法（1）：称取步骤2）得到的式Ⅱ所示噻苯隆半抗原4-（3-（2-氯-4-吡啶）-脲）-苯甲酸(4-(3-(2-chloropyridin-4-yl)ureido)benzoic acid)(0.04mmol)，NHS(0.052mmol)和DCC(0.044mmol)用1mL无水DMF溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分钟，取上清液，得到式Ⅲ所示化合物；
方法（2）：称取步骤2）得到的式Ⅱ所示噻苯隆半抗原4-（3-（2-氯-4-吡啶）-脲）-苯甲酸(0.036mmol)、NHS(0.047mmol)和EDC(0.040mmol)用1mL水溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，得到式Ⅲ所示化合物；
式Ⅲ
4）将步骤3）所得式Ⅲ所示化合物的溶液缓慢滴加入载体蛋白OVA溶液（该载体蛋白溶液是由105mg OVA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐（PBS）缓冲液混匀而得）中，式Ⅲ所示化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15：1，在4°C搅拌过夜。
5）透析：将步骤4）所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液（噻苯隆-OVA）稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的噻苯隆半抗原或其它小分子，得到式Ⅳ-1所示4-（3-（2-氯-4-吡啶）-脲）-苯甲酸与OVA的偶联物，也即式A所示噻苯隆抗原。
式Ⅳ-1
其中，该PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O以质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。
实施例2、噻苯隆-牛血清白蛋白（噻苯隆-BSA）抗原的制备
反应路线图如图1所示。
1）噻苯隆半抗原4-（3-（2-氯-4-吡啶）-脲）-苯甲酸的合成及其活化与实施例1中无差别，在此不再赘述。
2）将实施例1中步骤3）所得式Ⅲ所示化合物缓慢滴加到载体蛋白溶液中（该载体蛋白溶液是由157.5mg BSA溶于10mLpH值为7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）），式B化合物4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与载体蛋白的投料摩尔比为15：1，在4°C搅拌过夜。
3）透析：将步骤2）所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液（噻苯隆-BSA）稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸或未反应的其它小分子，得到式Ⅳ-2所示4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与OVA的偶联物，也即式A所示噻苯隆抗原。
式Ⅳ-2
其中，该PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O以质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。
实施例3、噻苯隆-牛血清白蛋白（噻苯隆-BSA）抗原的应用
一、利用噻苯隆-牛血清白蛋白（噻苯隆-BSA）抗原制备抗体
（1）取8-10周龄的Bal b/c小白鼠作为实验动物。
（2）基础免疫：由实施例2中得到稀释好的噻苯隆-BSA抗原溶液（浓度为1mg/mL），经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。
（3）加强免疫：基础免疫2周后，取1mL上述稀释好的噻苯隆-BSA抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原（8周龄的Bal b/C小鼠体重约23-25g）。
加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3~5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被原为1mg/mL噻苯隆-OVA稀释500倍用，待效价大于1：8000后（效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数），眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到噻苯隆-BSA抗体，用于下述各实验。
二、抗体效果检测
下述实验中所用的各种缓冲液如下：
（1）包被缓冲液：0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；
（2）磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.5）：称量4.0g NaCl、0.1g KH2PO4、1.48gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水定容到500mL，浓度为0.1M、pH为7.5磷酸盐缓冲液；
（3）样品稀释液PBSTG：由0.5mL吐温20、0.5g明胶和500mL浓度为0.1M、pH为9.6的PBS缓冲液混合得到；
（4）柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液：由柠檬酸三钠、Na2HPO4和水组成；柠檬酸三钠在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.01M，Na2HPO4在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03M；柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的pH值为5.5；
（5）底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺（OPD）溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30%的H2O2水溶液得到的溶液，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为（4）中所述；
（6）终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液；
（7）洗涤液：由NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、Tween-20和水组成；NaCl在洗涤液中的浓度为8.0g/L，KH2PO4在洗涤液中的浓度为0.2g/L，Na2HPO4·12H2O在洗涤液中的浓度为2.96g/L，Tween-20在洗涤液中体积百分含量为1：1000。
（一）抗体抑制实验
1、噻苯隆-OVA包被抗原溶液的配制
将上述实施例1制备的稀释后的1mg/mL的噻苯隆-OVA抗原完全解冻后，用包被缓冲液按1：1000、1：2000、1：4000、1：8000进行梯度稀释，得到不同浓度的噻苯隆-OVA的包被抗原溶液。
2、噻苯隆标准品溶液的配制
（1）称取5mg噻苯隆标样，充分溶解于10mL无水甲醇中，即得到0.5mg/mL噻苯隆标准品溶液；
（2）用样品稀释液将上述步骤（1）的1mg/mL噻苯隆标准品溶液配成浓度为2000ng/mL的噻苯隆标准品溶液。
3、噻苯隆-BSA抗血清稀释液的配制
将上述步骤一制备的噻苯隆-BSA抗体用样品稀释液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行梯度稀释，得到噻苯隆-BSA抗血清稀释液。
4、抗原、抗体的棋盘格实验
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL步骤1制备得到的噻苯隆-OVA包被抗原溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
封闭：封闭液150μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。
竞争：零孔每孔加50μl样品稀释液，抑制孔每孔加入50μl步骤2制备得到的噻苯隆标准品溶液。将上述步骤3得到的噻苯隆-BSA抗血清稀释液（从2.5×103倍到40×103倍）加入酶标板中（50μl/孔），置湿盒中37℃条件下30min,洗板4次。
加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗（IgG-HRP，Jackson公司，产品目录号为79556）(0.1mg/mL)稀释1000倍，稀释液是0.1M，pH为9.6的PBSTG，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。
显色：将底物缓冲液加入酶标板中，每孔100μl。避光显色15min。
终止：每孔加入50μL终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
效价的定义为零孔OD值为1时的血清稀释倍数。
结果如表1所示。
表1抗噻苯隆小鼠的血清效价检测（OPD 37℃显色10min，500ng标样抑制）
注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。
结果说明上述实施例1制备的噻苯隆-BSA可以作为免疫原制备出检测噻苯隆的抗体。
（二）噻苯隆标准曲线的建立
将上述制备的噻苯隆标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL和3.125ng/mL。
（1）包被原的包被：将上述制备的噻苯隆-OVA抗原按照1:8000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；
（2）在步骤（1）的酶标板中分别加入上述不同浓度的噻苯隆标准品溶液（实验孔），每孔50μL，对照孔中不添加噻苯隆标准品溶液而加入50μL样品稀释液；
（3）分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1:8000的噻苯隆-BSA抗血清稀释液，每孔50μL；37℃温育30分钟；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；
（4）在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1:1000的IgG-HRP（Jackson公司，产品目录号为79556）(0.1mg/mL)，37℃温育30分钟；用洗涤液洗板4次，倒掉酶标板中的溶液，甩干；
（5）向实验孔和对照孔中分别加入100μL底物缓冲液，37°C温育15分钟后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；
（6）在492nm下测定吸光值；
（7）绘制标准曲线：以不同浓度（ng/mL）的噻苯隆标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值（B/B0×100%，其中，B为噻苯隆标准品溶液的平均吸光度值，B0为对照孔的平均吸光度值）作为Y轴，绘制标准曲线图。
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。结果表明，其灵敏度（IC50）为58.0ng/mL，检测范围是13.4ng/mL-270ng/mL。说明上述实施例1制备的噻苯隆-BSA作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的效果。
（三）抗体特异性检测
1、噻苯隆类似物标准品溶液的配制
噻苯隆类似物标准品的配制
参照步骤（一）中噻苯隆标准品的配制方法，制备氯吡脲的标准样品。
用样品稀释液将上述氯吡脲分别稀释成如下浓度：2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL和31.25ng/mL。
2、建立标准曲线，测定抑制中浓度IC50（抑制率达到50%的标样浓度值）。
标准曲线的建立方法与上述噻苯隆标准曲线的建立方法相同。
交叉反应率（%）＝（噻苯隆IC50）/（噻苯隆类似鳌合物IC50）×100%。
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表2所示。
表2由噻苯隆-BSA制备的抗体的特异性检测
分析物 IC50（ng/mL） 交叉反应率（%）
噻苯隆 58.0 100
氯吡脲 >2000 <2.9
结果表明，上述由噻苯隆-BSA制备得到的抗体与其类似物氯吡脲的交叉反应率很小，说明用噻苯隆-BSA制备的抗体对噻苯隆具有很好的特异性。

Claims (11)

1.式A所示噻苯隆抗原，
式A中，n为0～6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。
2.权利要求1所述式A所示噻苯隆抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)5-氨基-1,2,3-噻二唑与式B所示含有酯基的苯异氰酸酯进行反应得到式C所示化合物；
式B和式C中，n为0～6的整数；
(2)在酸或碱存在的条件下，式C所示化合物经水解反应得到式D所示化合物；
式D中，n为0～6的整数；
(3)式D所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式E所示化合物；
式E中，n为0～6的整数；
(4)式E所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示噻苯隆抗原；所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，式B所示含有酯基的苯异氰酸酯选自4-异氰酸酯基-苯甲酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯乙酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯丙酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯丁酸乙酯、4-异氰酸酯基-苯戊酸乙酯和4-异氰酸酯基-苯己酸乙酯中至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述5-氨基-1,2,3-噻二唑与式B所示含有酯基的苯异氰酸酯的摩尔份数比为(1～10)：1；
所述反应的温度为0～100℃，时间为6～48小时；
所述反应的溶剂选自甲苯、苯和二甲苯中至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述酸选自浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸和甲酸中至少一种；所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾中至少一种。
6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；
式D所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；
所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为4～24小时。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，式E所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比为(5～30)：1；
所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为8～36小时；所述偶联反应在pH值为5～9的条件下进行；
式E所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.5；
步骤(4)之后，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为4～10、浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
8.一种抗体，其由权利要求1所述式A所示噻苯隆抗原制备得到。
9.权利要求1所述式A所示噻苯隆抗原和/或权利要求8所述抗体在检测样品中噻苯隆中的应用。
10.权利要求1所述式A所示噻苯隆抗原和/或权利要求8所述抗体在制备用于检测样品中噻苯隆的酶联免疫试剂盒、噻苯隆的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。
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