CN110872344B - 一种氯霉素完全抗原及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氯霉素完全抗原及其制备方法与应用。本发明氯霉素完全抗原，为半抗原与载体蛋白的偶联物；其中，所述半抗原的结构式如下式Ⅰ所示：
Description
技术领域
本发明涉及一种氯霉素完全抗原及其制备方法与应用，属于免疫检测领域。
背景技术
在骆驼和羊驼体内可以产生一种独特的轻链缺失的重链抗体，克隆这种重链抗体可变区可得到单域抗体，也称为纳米抗体。它具有许多常规抗体不具有的优良特性，如免疫原性低、亲和力高、水溶性好、高稳定性强等。并且，纳米抗体还修正了单链可变区抗体scFv容易粘连，易产生突变与筛选困难的缺点。进行纳米抗体制备，首先要准备氯霉素完全抗原，进而免疫羊驼，才能够得到含有重链抗体的血液样本用于分离外周血淋巴细胞进行纳米抗体的基因克隆及后续噬菌体库构建与筛选。
氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，广泛用于动物各种传染性疾病的治疗。但是，由于氯霉素有严重的副作用，可以抑制人体骨髓造血功能，进而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等，因此动物食品中的氯霉素残留会对人体健康造成潜在的危害。我国农业部发布了《2013年动物及动物产品兽药残留监控计划》，规定氯霉素不得检出。氯霉素残留的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、质谱联用技术等，但这些方法都需要昂贵的仪器，测试时间长，对检测人员要求高，不能满足现场快速检测的需求。而免疫检测法则可迎合高通量快速检测的要求，是质量监控的有力手段。免疫检测最为关键的试剂是抗体，而制备抗体首先要有合适的完全抗原，目前文献报道的不同氯霉素完全抗原主要是用于兔和小鼠的抗体制备，现亟需开发一种用于骆驼和羊驼的氯霉素完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种氯霉素完全抗原及其制备方法与应用，本发明氯霉素完全抗原能够用于羊驼抗体制备的氯霉素完全抗原，为进一步筛选高质量的氯霉素纳米抗体奠定条件。
本发明提供的一种氯霉素完全抗原，为半抗原与载体蛋白的偶联物；
其中，所述半抗原的结构式如下式Ⅰ所示：
上述的氯霉素完全抗原中，所述氯霉素完全抗原为所述半抗原中羧基与所述载体蛋白中氨基偶联形成酰胺键连接的偶联物；
所述氯霉素完全抗原的结构式如下式Ⅱ所示：
上述的氯霉素完全抗原中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。
本发明还提供了上述的氯霉素完全抗原的制备方法，包括如下步骤：先合成所述半抗原；然后将所述半抗原活化，与所述载体蛋白进行偶联，即得到所述氯霉素完全抗原。
上述的制备方法中，具体包括如下步骤：1)在有机溶剂中，将氯霉素碱与4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯混合反应，得到所述半抗原；
2)将所述半抗原与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，进行活化反应，得到活化的半抗原；
3)将所述活化的半抗原与载体蛋白进行偶联反应，即得到所述氯霉素完全抗原。
上述的制备方法中，步骤1)中，合成所述半抗原的反应在碱存在的条件下进行；所述碱具体为三乙胺；
所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮或氯仿；
所述氯霉素碱、所述4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯和所述碱的反应摩尔比可为1：1：2～5，具体可为1：1：3；
合成所述半抗原的反应的条件如下：温度为0～30℃，时间为0.5～2小时，具体可为：(a)4℃反应1小时，(b)室温反应1小时。
上述的制备方法中，步骤2)中，所述活化反应在溶剂为二甲基甲酰胺中进行；
所述活化反应的条件如下：温度为16～25℃、避光，所述温度优选为20℃或24℃；时间可为15～20小时，具体可为16h；
所述半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比可为1：1～3：1～3，具体可为1：1.5：1.5、1：1～1.5：1～1.5、1：1.5～3：1.5～3。
上述的制备方法中，步骤3)中，所述活化的半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为10～30：1，优选为20:1；
所述偶联反应的条件如下：温度可为4～25℃，pH值可为7.0～8.0，反应时间可为12～24h；具体可为：反应温度为25℃，pH值为7.5，反应时间为16h。
步骤3)中还包括在所述活化的半抗原与所述载体蛋白反应前，将所述载体蛋白溶解于缓冲液中的步骤；所述缓冲液具体选自碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐和HEPES缓冲液中的至少一种，pH值可为9.0～10.0，具体可为9.5。
本发明进一步提供了一种氯霉素抗体，它通过上述的氯霉素完全抗原制备。
本发明中，所述氯霉素抗体通过所述氯霉素完全抗原在羊驼和/或骆驼身上免疫制得。
本发明所述的氯霉素完全抗原或所述的氯霉素抗体在如下1)或2)中的应用：
1)检测样品中氯霉素；
2)制备成检测样品中氯霉素的酶联免疫试剂盒、试纸条和免疫亲和色谱柱中至少一种；
其中，所述样品为水体和/或食品。所述食品中具体包含蔬菜。
本发明还提供了一种化合物，其结构式如上述的氯霉素完全抗原中式Ⅰ所示：
本发明进一步提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：在有机溶剂中，将氯霉素碱与4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯混合反应，即得到式Ⅰ所示的所述化合物。
上述化合物的制备方法中，所述反应在碱存在的条件下进行；所述碱具体为三乙胺；
所述有机溶剂为二氯甲烷；
所述氯霉素碱、所述4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯和所述碱的反应摩尔比为1：1：2～5，具体可为1：1：3；
所述反应的条件如下：温度为0～30℃，时间为0.5～2小时，具体可为：(a)4℃反应1小时，(b)室温反应1小时。
本发明具有以下优点：
本发明的制备氯霉素完全抗原的方法能够方便、快捷地获得氯霉素完全抗原，且合成步骤少、成本低。用本发明方法制备的氯霉素完全抗原进行羊驼免疫得到的抗体的效价高。本发明的制备氯霉素完全抗原方法及由该方法获得的氯霉素完全抗原在氯霉素纳米抗体的制备中将有广阔的前景。
附图说明
图1为氯霉素完全抗原的合成路线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的搅拌，均为采用磁力搅拌器搅拌(采用江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司的HJ-1型磁力搅拌器)。
氯霉素碱、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、二甲基甲酰胺、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。MK3型酶标仪购自Thermo公司。
实施例1、免疫原和包被原的制备
按照图1所示的氯霉素完全抗原的合成路线制备，具体包括如下步骤：
一、半抗原的制备
将212mg氯霉素碱和300mg三乙胺溶于40mL二氯甲烷并降温至4℃，搅拌条件下，将200mg 4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯溶于20mL二氯甲烷往上述溶液里面缓慢滴加，滴加完毕后反应体系保持低温继续搅拌1小时。将反应体系倒入分液漏斗，加入100mL二氯甲烷，有机相用水洗三次后干燥、浓缩得白色固体。白色固体用20mL甲醇溶解，并加入80mg氢氧化钠和20mL水，反应体系室温搅拌1小时后将其倒入分液漏斗并加入4mL乙酸和100mL水，乙酸乙酯萃取两次后合并有机相，有机相干燥、浓缩后柱色谱纯化得半抗原，记为LMS-02。
半抗原如式Ⅰ所示。
二、免疫原制备
1、将将7.2mg式Ⅰ所示化合物溶于1mL二甲基甲酰胺，加入6.4mg二环己基碳二亚胺和4mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌16小时，此为A液；
2、将23mg牛血清白蛋白溶于5mL碳酸盐缓冲液(pH9.5、0.1mol/L)，此为B液；
3、将A液边搅拌边加入B液中，然后4℃搅拌16小时；
4、取步骤3得到的溶液，在磷酸缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)中4℃透析2天(每天换液4次)，然后收集透析袋中的溶液，即为免疫原溶液，-20℃保存备用，即得到氯霉素完全抗原，记为LMS-02-BAS。
三、包被原的制备
用鸡卵清白蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤二，得到包被原溶液(又称LMS-02-OVA)。
实施例2、羊驼多克隆抗体的制备
将本发明实施例1制备的免疫原溶液用磷酸缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)稀释成1mg/mL的溶液(以蛋白量计)，加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，得到首次免疫制剂。将本发明实施例1制备的免疫原用磷酸缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)稀释成1mg/mL的溶液(以蛋白量计)，加入等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，得到加强免疫制剂。
取2岁大的雌性羊驼，采用多点皮下注射的方式进行首次免疫，首次免疫剂量为0.2mg；分别于首次免疫2周后、4周后、6周后各加强免疫一次，均采用多点皮下注射的方式，加强免疫制剂的单次剂量为0.2mg(以蛋白量计)；最后一次加强免疫5天后，采血分离血清(包含抗体)，-20℃保存备用，即得到氯霉素抗体。
实施例3、抗体效价的确定(间接ELISA法)
1、采用本发明实施例1制备的包被抗原溶液包被酶标板，100μL/孔，包被抗原稀释倍数分别为1：500、1：1000、1：2000和1：4000倍，然后37℃孵育3小时。
2、洗板。
3、对照孔加入50μL磷酸缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)，抑制孔加入50μL含1000ng/mL氯霉素标准样品的磷酸缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)，再向对照孔和抑制孔中加入实施例2制备的血清的梯度稀释液，37℃孵育0.5小时，洗板。
4、每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗羊驼IgG，37℃孵育0.5小时，洗板。
5、每孔加入100μL邻苯二胺显色液，避光显色15min。
6、每孔加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD492nm。
每个稀释度设置三个重复孔，结果取平均值。
结果见表1。
表1羊驼血清效价检测吸光值OD492
结果表明，免疫羊驼血清效价超过免疫羊驼血清效价超过1：4000，对照孔与抑制吸光值均存在差异，证明本发明提供的氯霉素完全抗原可以制备出高效价、灵敏度的羊驼抗体。
Claims (12)
1.一种氯霉素完全抗原，其特征在于：该氯霉素完全抗原为半抗原与载体蛋白的偶联物；
其中，所述半抗原的结构式如下式Ⅰ所示：
所述氯霉素完全抗原为所述半抗原中羧基与所述载体蛋白中氨基偶联形成酰胺键连接的偶联物；
所述氯霉素完全抗原的结构式如下式Ⅱ所示：
所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的一种。
2.权利要求1所述的氯霉素完全抗原的制备方法，包括如下步骤：先合成所述半抗原；然后将所述半抗原活化，与所述载体蛋白进行偶联，即得到所述氯霉素完全抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法，包括如下步骤：1)在有机溶剂中，将氯霉素碱与4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯混合反应，得到所述半抗原；
2)将所述半抗原与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，进行活化反应，得到活化的半抗原；
3)将所述活化的半抗原与载体蛋白进行偶联反应，即得到所述氯霉素完全抗原。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，合成所述半抗原的反应在碱存在的条件下进行；
所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮或氯仿；
所述氯霉素碱、所述4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯和所述碱的反应摩尔比为1：1：2～5；
合成所述半抗原的反应的条件如下：温度为0～30℃，时间为0.5～2小时；
和/或，步骤2)中，所述活化反应在溶剂为二甲基甲酰胺中进行；
所述活化反应的条件如下：温度为16～25℃、避光，时间为15～20小时；
所述半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述碱为三乙胺。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述活化的半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为10～30：1；
所述偶联反应的条件如下：温度为4～25℃，pH值为7.0～8.0，反应时间为12～24h；
步骤3)中还包括在所述活化的半抗原与所述载体蛋白反应前，将所述载体蛋白溶解于缓冲液中的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液选自碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐和HEPES缓冲液中的一种，pH值为9.0～10.0。
8.权利要求1所述的氯霉素完全抗原在如下1)或2)中的应用：
1)检测样品中氯霉素；
2)制备成检测样品中氯霉素的酶联免疫试剂盒、试纸条和免疫亲和色谱柱中至少一种；
其中，所述样品为水体和/或食品。
9.一种化合物，其结构式如权利要求1所述的氯霉素完全抗原中式Ⅰ所示：
10.权利要求9中式Ⅰ所示的所述化合物的制备方法，包括如下步骤：在有机溶剂中，将氯霉素碱与4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯混合反应，即得到式Ⅰ所示的所述化合物。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述反应在碱存在的条件下进行；所述有机溶剂为二氯甲烷；所述氯霉素碱、所述4-(氯甲酰基)苯甲酸甲酯和所述碱的反应摩尔比为1：1：2～5；所述反应的条件如下：温度为0～30℃，时间为0.5～2小时。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述碱为三乙胺。
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