CN111484448A - 氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用、检测氟吡菌酰胺的抗体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用、检测氟吡菌酰胺的抗体和方法，涉及氟吡菌酰胺检测技术领域。本发明公开的半抗原结构为
Figure DDA0002487016360000011
该半抗原能够方便、快捷地获得，合成成本低，效果好；且由该半抗原免疫得到的抗体特异性好、最低检测限值低，能够有效地针对氟吡菌酰胺进行检测，具有广阔的应用前景。

Description

氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用、检测氟吡菌酰胺 的抗体和方法
技术领域
本发明涉及氟吡菌酰胺检测技术领域，具体而言，涉及氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用、检测氟吡菌酰胺的抗体和方法。
背景技术
氟吡菌酰胺英文名称为fluopyram，化学名为N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]乙基-a,a,a-邻三氟甲基苯甲酰胺}。商品名称：路富达，CAS登记号:658066-35-4，分子式为：C16H11ClF6N2O，相对分子量为：396.71。
氟吡菌酰胺通过抑制琥珀酸脱氢酶的电子转移而抑制线粒体呼吸，具有广谱性和内吸性，可防治真菌病原菌引起的灰霉病、白粉病和霜霉病等，单用和混用均表现出较高的活性，使用剂量很低。目前剂型有悬浮剂。拜耳公司推出的银发利(6.25％氟吡菌酰胺+62.5％霜酶威混剂)对致病疫霉抗甲霜灵菌株TZ25的引起的番茄晚疫病有很好的防效。目前拜耳作物科学在中国国内登记了氟吡菌酰胺的原药(登记证号PD20121673)和41.7％的悬浮剂(登记证号PD20121664)，另外还有两种复配，氟菌、肟菌酯和氟菌、戊唑醇悬浮剂。
其化学结构式如下：
Figure BDA0002487016340000021
目前，氟吡菌酰胺的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)。但该检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适于农药残留现场快速检测。与仪器分析方法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且能大幅度降低检测成本。
但是目前，缺乏针对氟吡菌酰胺的抗体。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用、检测氟吡菌酰胺的抗体和方法，本发明的半抗原能够方便、快捷地获得，合成成本低，效果好；且由本发明的半抗原免疫得到的抗体特异性好、最低检测限值低，能够有效地针对氟吡菌酰胺进行检测，具有广阔的应用前景。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种氟吡菌酰胺的半抗原，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0002487016340000022
其中，R1为连接基团；所述连接基团能够与载体蛋白偶联以使所述半抗原形成完全抗原。
现有技术中，氟吡菌酰胺存在合成困难，价格贵等特点，导致采用氟吡菌酰胺作为抗原免疫动物制备抗体的成本高，这是目前市场上缺乏检测氟吡菌酰胺抗体的重要原因。针对这一问题，本发明通过研究发现，在氟吡菌酰胺的结构基础上，将苯环上-CF3基团去除，并在苯环上任意位置引入能够与载体蛋白偶联的连接基团，得到的结构即式(I)具有抗原性；将该结构与载体蛋白偶联进行免疫得到抗体，能够识别并特异性结合氟吡菌酰胺。
此外，式(I)结构的半抗原相较于氟吡菌酰胺，其更容易获得，合成的步骤少，简洁明了，合成成本低，合成的效果也好；使用本发明的半抗原可以提高针对氟吡菌酰胺抗体制备的速度和效率，为检测氟吡菌酰胺提供技术基础。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述半抗原的结构如下：
Figure BDA0002487016340000031
在苯环的酰胺基的对位上设置连接基团，可以使得半抗原的结构能够被充分暴露，以此结构进行免疫所制得的抗体其特异性识别能力也更强，能够有效地识别氟吡菌酰胺。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述连接基团为羧基、氨基、羟基或其形成的活性结构。
需要说明的是，连接基团的具体结构本领域技术人员可以根据实际的需要进行选择，可以是羧基、氨基或羟基等，也可以由羧基、氨基或羟基等与其他化合物反应形成反应活性更强的活性结构(例如羧基与N-羟基琥珀酰亚胺活化形成的活泼酯结构)，该活性结构可以使得半抗原更容易与载体蛋白偶联，提高偶联的成功率。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述半抗原为如下结构所示的半抗原A：
Figure BDA0002487016340000041
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述半抗原为如下结构所示的半抗原B：
Figure BDA0002487016340000042
另一方面，本发明提供制备如上所述的半抗原的方法，在式(II)所示化合物的苯环上任意位置引入所述连接基团：
Figure BDA0002487016340000043
可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述半抗原为上述半抗原A时，所述制备方法包括：将2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺、对苯二甲酸单甲酯、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶于有机溶剂中混合进行反应。
本发明实施例提供的制备方法能够方便、快捷地获得氟吡菌酰胺半抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。
可选地，在本发明的一些实施方案中，2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺、对苯二甲酸单甲酯、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为：0.9-1.1:0.9-1.3:1-3:0.5-1，进一步优选为1:1.2:3:0.5。
可选地，在本发明的一些实施方案中，进行反应的温度为0-50℃，进一步优选为25℃。
可选地，在本发明的一些实施方案中，反应的时间为6-48小时，进一步优选为12小时。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选为N,N-二甲基甲酰胺。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：在反应完毕后加水终止反应，用乙酸乙酯提取，收集有机相，干燥后减压浓缩，然后溶于甲醇并加入NaOH，搅拌后调节至pH值为5.8-6.2，用水和乙酸乙酯进行分层，收集有机相，干燥后减压浓缩得到浓缩物，该浓缩物用柱层析法进行纯化，得到半抗原A。
可选地，在本发明的一些实施方案中，使用硫酸钠进行干燥。
可选地，在本发明的一些实施方案中，用HCl调节pH。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述柱层析法所用的洗脱液为石油醚与醋酸乙酯的混合液。
可选地，在本发明的一些实施方案中，石油醚与醋酸乙酯的体积比为1.8-2.2:1，进一步优选为2:1。
上述的反应条件可以提高半抗原A的合成效率和收率。
可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述半抗原为上述半抗原B时，所述制备方法包括：将上述半抗原A与N-羟基琥珀酰亚胺混合进行活化反应，制得半抗原B。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述活化反应在有机溶剂或水中进行。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，进一步优选为N,N-二甲基甲酰胺。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述活化反应的反应体系中还含有催化剂。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述催化剂选自二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述活化反应的反应体系中半抗原A、N-羟基琥珀酰亚胺与所述催化剂的摩尔比为1:1.2-1.4:1.1-1.2，进一步优选为1:1.3:1.1。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述活化反应的温度为0-50℃，进一步优选为25℃，反应时间为4-24小时，进一步优选为8小时。
另一方面，本发明提供一种氟吡菌酰胺的完全抗原，其由如上所述的半抗原与载体蛋白偶联得到。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述完全抗原为如下结构所示的完全抗原C：
Figure BDA0002487016340000061
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中的任意一种。
另一方面，本发明提供如上所述的完全抗原的制备方法，其包括：将前述的半抗原与所述载体蛋白偶联。
可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述完全抗原为完全抗原C时，所述制备方法包括：
偶联步骤：将半抗原B与含所述载体蛋白的溶液混合进行偶联反应，以制得所述完全抗原。
可选地，在本发明的一些实施方案中，在所述偶联步骤中，在所述偶联反应的反应体系中，所述半抗原B与所述载体蛋白的摩尔比为5-30:1，优选为15:1。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述偶联反应条件如下：
反应温度为0-50℃，进一步优选为4℃，反应时间为8-36小时，进一步优选为12小时，pH为5-9，进一步优选为7.5。
可选地，在本发明的一些实施方案中，含所述载体蛋白的溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、绷酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的至少一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，含所述载体蛋白的溶液的pH值为5-9，进一步优选为7.5。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法还包括：在所述偶联步骤结束之后，对所述偶联反应的反应体系进行透析。
可选地，在本发明的一些实施方案中，进行透析时所用的透析液为PBS溶液，pH为7-10，浓度为0.01-0.2mol/L。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述透析液的pH值为7.5，浓度为0.1mol/L。
另一方面，本发明提供上述半抗原或者上述完全抗原在制备针对氟吡菌酰胺的抗体中的应用。
采用本发明提供的半抗原或者完全抗原所制备的抗体特异性好、最低检测限值低，与氟吡菌酰胺类似物的交叉反应率很小，能够实现对氟吡菌酰胺特异性识别和结合，可以用于制备基于抗原抗体免疫反应原理的检测试剂，以检测氟吡菌酰胺。
另一方面，本发明提供一种制备针对氟吡菌酰胺的抗体的方法，其包括：将上述完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物血液中分离得到抗氟吡菌酰胺的抗体，或者从杂交瘤细胞株制备的腹水分离纯化得到。
在本发明的公开的半抗原或完全抗原基础上，本领域技术人员容易想到采用合适的抗体制备方法制备出抗氟吡菌酰胺的抗体，无论其采用何种动物进行免疫，无论其免疫条件或参数如何设置或改变，只要其使用了本发明所提供的半抗原或完全抗原，即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种针对氟吡菌酰胺的抗体，其由上述的制备方法制备得到。
本发明提供的抗体特异性好、最低检测限值低，与氟吡菌酰胺类似物的交叉反应率很小，能够实现对氟吡菌酰胺特异性识别和结合，可以用于制备基于抗原抗体免疫反应原理进行检测的检测试剂以检测氟吡菌酰胺。
本发明的抗体可以是含有抗体的血清，纯化的抗体，单克隆抗体，多克隆抗体，或纳米抗体等，无论是何种形式的抗体，只要其是利用本发明的半抗原或完全抗原制备所得，即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种检测氟吡菌酰胺的试剂或试剂盒，其含有上述抗体。
另一方面，本发明提供一种检测氟吡菌酰胺的方法，使用上述抗体或者上述试剂或试剂盒进行检测。
在获得了抗体的前提下，本领域技术人员容易想到采用本领域熟知的检测方法对氟吡菌酰胺进行检测，例如酶联免疫法、免疫荧光法、化学发光免疫测定、免疫印迹法或放射免疫测定等，无论何种方法，其只要使用了本发明的半抗原、完全抗原或抗体，即属于本发明的保护范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中的氟吡菌酰胺半抗原A的合成路线。
图2为实施例6中的氟吡菌酰胺间接icELISA法标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实例中部分材料的来源：2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺，DMF，对苯二甲酸单甲酯、DMAP购自阿拉丁，乙酸乙酯、硫酸钠、甲醇、氢氧化钠、盐酸、石油醚、醋酸乙酯、邻苯二胺(OPD)、碳酸钠、氯化钠、十二水磷酸二氢钠、明胶、一水合柠檬酸、Tween20、浓硫酸均购自国药集团化学试剂有限公司，二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购自Sigma公司，羊抗鼠IgG-HRP购自Jackson公司。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
合成氟吡菌酰胺半抗原A(N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基-苯甲酰胺)，结构如下：
Figure BDA0002487016340000101
合成路线见图1，将0.2g 2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺溶于10mL DMF中，然后加入0.19g对苯二甲酸单甲酯、0.55g二环己基碳二亚胺(DCC)和50mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)(摩尔比为1:1.2:3:0.5)，在常温下搅拌12小时，然后加入50mL水终止反应，加入100mL乙酸乙酯进行提取。收集有机相并用硫酸钠干燥，然后减压浓缩得到一种黄色的粘性液体，这种物质不需要任何纯化处理就可直接用于下一步操作。
本实施例中，对其进一步纯化鉴定：将上述粘性液体溶于5mL甲醇并加入5mL的2NNaOH，该混合物在常温下搅拌2小时，然后用2N HCl调节至pH值为6，最后用水和乙酸乙酯进行分层。收集有机相并用Na2SO4干燥，然后减压浓缩得到一种黄色的物质，该物质用柱层析法(洗脱液为石油醚与醋酸乙酯体积比2:1的混合)进行纯化，得到150mg氟吡菌酰胺半抗原A(白色粉末，两步反应的总回收率是45.3％)。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.28(s,1H),8.90(s,1H),8.78(t,J＝5.6Hz,1H),8.42(s,1H),8.01(d,J＝8.3Hz,2H),7.89(d,J＝8.3Hz,2H),3.73(dd,J＝12.8,6.7Hz,2H),3.27(t,J＝6.9Hz,2H)；
13C NMR(126MHz,DMSO)δ167.34,166.16,161.50,144.47,144.44,138.57,134.61,134.59,133.74,131.53,129.68,127.80,125.10,124.84,124.52,122.35,38.16,35.16。
HRMS calcd for C16H12ClF3N2O3:[M+H+]373.0561,found 373.0559
产品经1H NMR,13C NMR和HRMS确证，为式A所示氟吡菌酰胺半抗原：N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基-苯甲酰胺化合物。
实施例2
合成氟吡菌酰胺半抗原B：
Figure BDA0002487016340000111
称取实施例1制备所得式A所示氟吡菌酰胺半抗原N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基苯甲酰胺(0.036mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.047mmol)和DCC(0.040mmol)用1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，在室温25℃搅拌反应8小时后，将反应液在8000r/min下离心5分钟，取上清液备用，得到含有氟吡菌酰胺半抗原B的反应物，该反应产物可直接用于后续载体蛋白的偶联。
实施例3
合成氟吡菌酰胺半抗原B，其方法与实施例2基本相同，不同的是用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)代替DCC，也能够得到含有氟吡菌酰胺半抗原B的上清液。
实施例4
合成氟吡菌酰胺完全抗原C1：
Figure BDA0002487016340000121
氟吡菌酰胺抗原C1是氟吡菌酰胺半抗原B与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；酰胺键是氟吡菌酰胺半抗原B的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成。合成方法：将实施例2或实施例3得到的上清液缓慢滴加入载体蛋白OVA(卵清白蛋白)溶液(该载体蛋白溶液是由105mg OVA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀而得)中，式B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15:1，在4℃搅拌过夜后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液稀释为1mg/mL的溶液，置于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基-苯甲酰胺或其它小分子，得到式C1所示的化合物，即N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基-苯甲酰胺与OVA的偶联物。
实施例5
合成氟吡菌酰胺完全抗原C2：
Figure BDA0002487016340000122
将实施例2得到的上清液缓慢滴加到载体蛋白液中(该载体蛋白溶液是由157.5mgBSA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS))，式B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15：1，在4℃搅拌过夜后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液稀释为1mg/mL的溶液，置于-40℃冻存待用。
得到式C2所示的化合物，即N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基)乙基]-对羧基-苯甲酰胺与BSA的偶联物。
实施例6
氟吡菌酰胺完全抗原的应用
一、利用实施例5的氟吡菌酰胺完全抗原C2抗原制备抗体
(1)取8-10周龄的Balb/C小鼠作为实验动物。
(2)基础免疫：由实施例5得到稀释好的氟吡菌酰胺完全抗原C2抗原溶液(浓度为1mg/mL)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。
(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL上述稀释好的氟吡菌酰胺完全抗原C2抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原(8周龄的Balb/c小鼠体重约23-25g)。
加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被抗原为1mg/mL氟吡菌酰胺完全抗原C1稀释500倍用，待效价大于1:8000后(效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到氟吡菌酰胺抗体。用于下述各实验。
二、抗体效价检测
下述实验中所用的各种缓冲液如下：
(1)包被缓冲液(pH 9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):Na2CO3 1.5g；NaHCO32.94g，加纯水定容至1000mL；
(2)磷酸盐缓冲液PBS(0.01M pH7.4)：0.2g KH2PO4；8g NaCl；2.92g NaH2PO4·12H2O，加纯水至1000mL；
(3)洗涤缓冲液(PBST)：在配好的1000mL PBS溶液中加入1mL Tween-20；
(4)样品稀释液(PBSTG)：配好的PBS中加入1mL Tween-20、1g明胶(微波炉加热融化)，定容至1L；
(5)底物缓冲液(Ph 5.5)：9.22g Na2HPO4·12H2O；2.55g一水合柠檬酸；0.5mLTween-20，加纯水至1L；
(6)终止液(2M H2SO4)：蒸馏水445.6mL，逐滴加入浓硫酸(98％)54.4mL并搅拌。
(一)抗体抑制实验
1、氟吡菌酰胺完全抗原C1包被抗原溶液的配制
将上述实施例4制备的稀释后1mg/mL的氟吡菌酰胺完全抗原C1完全解冻后，用包被液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000进行梯度稀释，得到不同浓度的氟吡菌酰胺完全抗原C1的包被抗原溶液。
2、氟吡菌酰胺标准品溶液的配制
(1)称取10mg氟吡菌酰胺标样，充分溶解于10mL DMF中，即得到1mg/mL氟吡菌酰胺标准品溶液。
(2)用样品稀释液将上述(1)的1mg/mL氟吡菌酰胺标准品溶液配制成终浓度为50ng/mL的氟吡菌酰胺标准品溶液。
3、氟吡菌酰胺抗血清/抗体稀释液的配制
将上述步骤制备的氟吡菌酰胺抗血清/抗体用样品稀释液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000进行梯度稀释，得到氟吡菌酰胺的抗血清/抗体稀释液。
4、抗原、抗体的棋盘格实验
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL步骤1制备得到的氟吡菌酰胺完全抗原C1包被抗原溶液，4℃过夜，用PBST洗涤3次，甩干。
竞争：零孔每孔加入50μL样品稀释液，抑制孔每孔加入50μL步骤2制备得到的氟吡菌酰胺标准品溶液。将上述步骤3得到的氟吡菌酰胺抗血清稀释液加入酶标板中(50μL/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，洗板3次，甩干。
加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP，Jackson公司))稀释1000倍，稀释液是0.1M，pH为9.6的PBSTG，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板3次，甩干。
显色：显色底物现用现配，每10mL底物缓冲液中加入15-20mg OPD，将称好的OPD溶于底物缓冲液后，每10mL加入4μL 30％的双氧水，每孔加入100μL，常温避光显色10min。
终止：每孔加入50μL 2M的终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
抑制率的计算公式：抑制率＝(A0-A50)/A0×100％)，A0为对照孔OD值；A50为抑制孔OD值。
结果如表1和表2所示。
表1抗氟吡菌酰胺小鼠的血清效价检测(OPD 37℃显色15min，1200ng标样抑制)
Figure BDA0002487016340000151
Figure BDA0002487016340000161
注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。
表1结果表明，当包被抗原和抗体的稀释度均为1：4000时，此时的抑制率最好，为21.4％，也即此时的抑制效果最好。
表2抗氟吡菌酰胺小鼠的单克隆抗体效价检测(OPD 37℃显色10min，50ng标样抑制)
Figure BDA0002487016340000162
注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。
表2结果表明，当包被抗原稀释度为1：4000时，此时的抑制率最好，为87.3％，也即此时的抑制效果最好。说明上述实施例5制备的氟吡菌酰胺完全抗原C2可以作为免疫原制备出检测氟吡菌酰胺的抗体。
(二)氟吡菌酰胺标准曲线的建立
将上述制备的氟吡菌酰胺标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL。
(1)抗原的包被：将上述制备的氟吡菌酰胺完全抗原C1按1:4000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，置于湿盒中4℃过夜；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；
(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的氟吡菌酰胺标准品溶液(实验孔)，每孔50μL，对照孔中不添加氟吡菌酰胺标准品溶液而加入50μL样品稀释液；
(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1:4000的氟吡菌酰胺抗体稀释液，每孔50μL，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；
(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1:1000的IgG-HRP二抗(Jackson公司)，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；
(5)向实验孔和对照孔中分别加入100μL配制好的底物缓冲液，37℃温育10min后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；
(6)在492nm下测定吸光值；
(7)绘制标准曲线：以氟吡菌酰胺标准品溶液的不同浓度(ng/mL)作为X轴，以吸光度值的比值(B/B0×100％，其中，B为氟吡菌酰胺标准品溶液的平均吸光度值，B0为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。
结果表明，其灵敏度(IC50)为15.60ng/mL，检测范围是5.04ng/mL-58.17ng/mL。说明上述实施例5制备的氟吡菌酰胺完全抗原C2作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的检测效果，检测限低。
(三)抗体特异性检测
1、氟吡菌酰胺类似物标准品溶液的配制
氟吡菌酰胺类似物标准品的配制
参照步骤(一)中氟吡菌酰胺标准品的配制方法，制备氟唑菌酰胺、3-氯-5-三氟甲基吡啶-2-甲酸、邻三氟甲基苯甲酸、吡噻菌胺、氟吡菌胺的标准样品。
用样品稀释液将上述5种类似物分别稀释成如下浓度：3200ng/mL，1600ng/mL，800ng/mL，400ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL。
建立标准曲线，测定抑制中浓度IC50(抑制率达到50％的标样浓度值)，标准曲线的建立方法与上述氟吡菌酰胺标准曲线的建立方法相同。
交叉反应率(％)＝(氟吡菌酰胺IC50)/(类似物IC50)×100％。
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表3所示。
表3由氟吡菌酰胺半抗原-BSA制备的单克隆抗体的特异性检测
Figure BDA0002487016340000181
表3结果表示，上述由氟吡菌酰胺半抗原-BSA制备得到的抗体与氟吡菌酰胺类似物的交叉反应率很小，说明用氟吡菌酰胺完全抗原C2制备的抗体对氟吡菌酰胺有很好的特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种氟吡菌酰胺的半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0002487016330000011
其中，R1为连接基团，其能够与载体蛋白偶联以使所述半抗原形成完全抗原。
2.根据权利要求1所述的半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构如下：
Figure FDA0002487016330000012
优选地，R1为羧基、氨基、羟基或其形成的活性结构；
优选地，所述半抗原为如下结构所示的半抗原A：
Figure FDA0002487016330000013
优选地，所述半抗原为如下结构所示的半抗原B：
Figure FDA0002487016330000014
3.如权利要求1或2所述的半抗原的制备方法，其特征在于，在式(II)所示化合物的苯环上任意位置引入所述连接基团：
Figure FDA0002487016330000021
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述半抗原为半抗原A时，所述制备方法包括：将2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺、对苯二甲酸单甲酯、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶于有机溶剂中混合进行反应；
优选地，2-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙胺、对苯二甲酸单甲酯、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为：0.9-1.1:0.9-1.3:1-3:0.5-1，进一步优选为1:1.2:3:0.5；
优选地，进行反应的温度为0-50℃，进一步优选为25℃；
优选地，反应的时间为6-48小时，进一步优选为12小时；
优选地，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选为N,N-二甲基甲酰胺；
优选地，所述制备方法还包括：在反应完毕后加水终止反应，用乙酸乙酯提取，收集有机相，干燥后减压浓缩，然后溶于甲醇并加入NaOH，搅拌后调节至pH值为5.8-6.2，用水和乙酸乙酯进行分层，收集有机相，干燥后减压浓缩得到浓缩物，该浓缩物用柱层析法进行纯化，得到半抗原A；
优选地，使用硫酸钠进行干燥；
优选地，用HCl调节pH；
优选地，所述柱层析法所用的洗脱液为石油醚与醋酸乙酯的混合液；
优选地，石油醚与醋酸乙酯的体积比为1.8-2.2:1，进一步优选为2:1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述半抗原为半抗原B时，所述制备方法包括：将半抗原A与N-羟基琥珀酰亚胺混合进行活化反应，制得半抗原B；
优选地，所述活化反应在有机溶剂或水中进行；
优选地，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，进一步优选为N,N-二甲基甲酰胺；
优选地，所述活化反应的反应体系中还含有催化剂；
优选地，所述催化剂选自二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；
优选地，所述活化反应的反应体系中半抗原A、N-羟基琥珀酰亚胺与所述催化剂的摩尔比为1:1.2-1.4:1.1-1.2，进一步优选为1:1.3:1.1；
优选地，所述活化反应的温度为0-50℃，进一步优选为25℃，反应时间为4-24小时，进一步优选为8小时。
6.一种氟吡菌酰胺的完全抗原，其特征在于，其由权利要求1或2所述的半抗原与载体蛋白偶联得到。
7.根据权利要求6所述的完全抗原，其特征在于，所述完全抗原为如下结构所示的完全抗原C：
Figure FDA0002487016330000031
8.根据权利要求7所述的完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清白蛋白和钥孔血蓝蛋白中的任意一种。
9.如权利要求6-8任一项所述的完全抗原的制备方法，其特征在于，其包括：将权利要求1或2所述的半抗原与所述载体蛋白偶联。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，当所述完全抗原为完全抗原C时，所述制备方法包括：
偶联步骤：将半抗原B与含所述载体蛋白的溶液混合进行偶联反应，以制得所述完全抗原；
优选地，在所述偶联步骤中，在所述偶联反应的反应体系中，所述半抗原B与所述载体蛋白的摩尔比为5-30:1，优选为15:1；
优选地，所述偶联反应的条件如下：
反应温度为0-50℃，进一步优选为4℃，反应时间为8-36小时，进一步优选为12小时，pH为5-9，进一步优选为7.5；
优选地，含所述载体蛋白的溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、绷酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的至少一种；
优选地，含所述载体蛋白的溶液的pH值为5-9，进一步优选为7.5；
优选地，所述制备方法还包括：在所述偶联步骤结束之后，对所述偶联反应的反应体系进行透析；
优选地，进行透析时所用的透析液为PBS溶液，pH为7-10，浓度为0.01-0.2mol/L；
优选地，所述透析液的pH值为7.5，浓度为0.1mol/L。
11.权利要求1-2任一项所述的半抗原或者权利要求6-8任一项所述的完全抗原在制备针对氟吡菌酰胺的抗体中的应用。
12.一种制备针对氟吡菌酰胺的抗体的方法，其特征在于，其包括：将权利要求6-8任一项所述的完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物的血液中分离得到抗氟吡菌酰胺的抗体，或者从杂交瘤细胞株制备的腹水中分离纯化得到。
13.一种针对氟吡菌酰胺的抗体，其特征在于，其由权利要求12所述的方法制备得到。
14.一种检测氟吡菌酰胺的试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求13所述的抗体。
15.一种检测氟吡菌酰胺的方法，其特征在于，使用权利要求13所述的抗体，或者权利要求14所述的试剂或试剂盒进行检测。
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