CN112876506B - 一种沙林模拟剂半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯半抗原、人工抗原和抗体的制备方法。本发明的甲基膦酸二甲酯半抗原结构简单，易合成，同时对环境友好。甲基膦酸二甲酯人工抗原以牛血清白蛋白和卵清蛋白作为载体蛋白，合成的人工抗原偶联比值大，具有很好的免疫活性；且人工抗原中保留了膦酸酯基团，有利于制备出高质量抗体。以合成的人工抗原通过动物免疫获得人工甲基膦酸二甲酯多克隆抗体，本发明制备的抗体效价高、特异性强；可用于开发甲基膦酸二甲酯免疫快速分析技术、方法和产品。

Description

一种沙林模拟剂半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯半抗原、人工抗原和抗体的制备方法。
背景技术
近几年，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测小分子量物质由于其操作简便、灵敏性高、特异性强以及快速准确的优点备受关注，在农药残留检测方面的应用发展迅速。甲胺磷、甲基对硫磷、菊酯类农药、氟虫腈杀虫剂、除虫脲农药等的ELISA分析方法都有大量报道。随着生物技术、传感器技术的迅猛发展，ELISA方法在生防菌监测、除草剂残留检测、农药残留(水和土壤)检测以及环境致病菌监测中得到了广泛的应用。
甲基膦酸二甲酯(Dimethyl methylphosphonate，DMMP)是一种有机膦酸酯神经毒剂，具有与剧毒化学品沙林类似的分子结构。由于DMMP毒性远低于沙林，经常被用来当作沙林的模拟试剂。传统检测DMMP的方法是气相色谱，灵敏度高并且选择性好，但存在设备昂贵笨重，样品前期处理过程繁琐，受限于实验室条件检测等缺点。便携的检测DMMP方法多采用表面声波(SAW)传感器、石英晶体微天平(QCM)传感器、半导体传感器等，但亦面临特异性差、抗环境干扰能力差、检出灵敏度较低的问题。
发明内容
基于此，本发明的目的是基于ELISA方法，提供一种沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯(DMMP)半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法。应用该方法制备的抗体可进一步用于开发DMMP免疫快速分析技术、方法和产品。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种以DMMP为骨架的人工半抗原，其分子结构为：
Figure BDA0002929227580000021
H1:R1＝—(CH2)2COOH (Ⅰ)
或
Figure BDA0002929227580000022
H2：R2＝—NH—(CH2)5COOH (Ⅱ)
一种甲基膦酸二甲酯半抗原的制备方法，制备上述的甲基膦酸二甲酯半抗原，其方法具体如下：
S1、将羧基化合物和氢氧化钾溶于无水甲醇中，然后逐滴加入氯磷酸二甲酯，滴加完毕后，搅拌加热，反应10-15h；
S2、反应结束后，先减压蒸馏，除去甲醇，接着用乙酸乙酯将残留物溶解，再加入氢氧化钠溶液，最后用盐酸调节反应液pH值至1-4；
S3、调完pH值后，用乙酸乙酯萃取多次并合并有机层，再用水洗涤，最后加入无水硫酸镁干燥过夜，过滤，减压蒸馏除去乙酸乙酯，获得目标产物；
S4、将步骤S3中目标产物用柱层析法进行提纯，其中所用的洗脱液为氯仿、乙酸乙酯、乙酸混合物。
进一步的，羧基化合物为对羟基苯丙酸、6-氨基己酸中任意一种。
进一步的，洗脱液中氯仿、乙酸乙酯、乙酸的摩尔比为25-40:1-10:1
本发明提供一种以上述合成的半抗原与载体蛋白偶联制备的人工抗原及其制备方法，所述人工抗原是由载体蛋白和所述的甲基膦酸二甲酯半抗原进行偶联反应得到。
所述人工抗原的结构为：
Figure BDA0002929227580000031
具体的偶联方法，是由所述甲基膦酸二甲酯半抗原在二环己基碳化二亚胺的作用下，与N-羟基琥珀酰亚胺反应，生成活化酯衍生物；所述活化酯衍生物与所述载体蛋白上氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物。
进一步的，载体蛋白为牛血清蛋白和卵清蛋白。
本发明提供一种以上述合成的抗原进行动物免疫实验，制备甲基膦酸二甲酯抗体的方法，所述甲基膦酸二甲酯抗体为多克隆抗体，所述抗体是由上述人工抗原进行免疫实验动物获得。
进一步的，抗体对甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷及乐果等小分子竞争物对所述抗体均不显示交叉反应性，且所述甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、乐果的50％抑制竞争物浓度IC50均大于105ng/mL。
本发明的有益效果：由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明首次公开了甲基膦酸二甲酯半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法。该方法制备DMMP人工抗原的半抗原易于获得，对环境友好，人工抗原制备成本低，在制备的人工抗原中同时保留了膦酸酯基团，有利于制备出高质量抗体；
本发明甲基膦酸二甲酯人工抗原由以牛血清白蛋白和卵清蛋白作为载体蛋白和甲基膦酸二甲酯半抗原偶联得到，具有良好的免疫活性；
本发明用所合成的人工抗原免疫动物，从而得到效价高、灵敏度高的特异性抗体，该抗体为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的甲基膦酸二甲酯检测方法提供了新手段。
附图说明
图1为本发明实施例1中半抗原合成路线图。
图2为本发明实施例2中半抗原合成路线图。
图3为本发明实施例1中半抗原质谱图。
图4为本发明实施例2中半抗原质谱图。
图5为本发明实施例1中人工半抗原合成路线图。
图6为本发明实施例2中人工半抗原合成路线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例一：
(1)半抗原(Ⅰ)的合成路线：
Figure BDA0002929227580000041
称取2.125g(12.8mmol)对羟基苯丙酸和1.8g KOH(32mmol)，在0℃的条件下，溶于100mL的无水甲醇中，然后逐滴加入2.770g(19.2mmol)氯磷酸二甲酯，滴加完毕后，搅拌加热，缓慢升温至65℃，继续搅拌反应12h。
反应结束后，减压蒸馏反应液，除去甲醇，得初产物，用15mL乙酸乙酯将其溶解，之后加入2mol/L的NaOH溶液15mL，然后用浓盐酸调pH值至2.0左右。
用乙酸乙酯3×20mL萃取，弃水层，合并乙酸乙酯层，用蒸馏水2×10mL 洗涤乙酸乙酯层，加无水硫酸镁干燥过夜，减压蒸馏除去乙酸乙酯得到目标产物。
目标产物用柱层析法进行提纯，所用洗脱液为氯仿和乙酸乙酯和乙酸的混合液，其体积比为：氯仿:乙酸乙酯:乙酸＝30:5:1，平均产率为73％。
(2)抗原H1-Protein合成路线
含有羧基的小分子半抗原在二环己基碳化二亚胺(DCC)的作用下，与N- 羟基琥珀酰亚胺反应，生成活化酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物。
抗原H1-Protein合成路线如下：
Figure BDA0002929227580000051
抗原具体合成步骤如下：
称取合成的半抗原0.33mmol，溶于300μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 中，加入0.14mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS溶于300μL DMF)和24mg N, N-二环己基碳二亚胺(DCC，溶于300μL DMF)，室温搅拌lh，然后4℃过夜，有不溶物生成。
次日离心(离心条件：10000转速、30分钟、4℃)，离心后将上清液加入到5mL浓度为4mg/mL的蛋白质(BSA或OVA)的PBS溶液中，4℃反应5h。
反应结束后将反应液装入透析袋，于4℃pH＝7.4的PBST溶液进行中透析，透析步骤如下：用透析袋夹子夹紧透析袋的一端；将要透析的溶液移入透析袋内；用透析袋夹子将袋子另一端夹紧，检查整个袋子是否密闭；将其放在10倍于袋子内溶液体积的缓冲液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌以促进溶液交换，透析60h，8h换一次PBS溶液。
最后精确量取透析后溶液的体积，测定蛋白浓度和结合比，分装，于-20 ℃保存。
经计算，半抗原(Ⅰ)与BSA的偶联比为75:1，与OVA的偶联比为42:1，该半抗原与载体蛋白的偶联比值较大。
(3)DMMP多克隆抗体制备
用以上合成的免疫抗原H1-BSA溶液免疫动物制备DMMP多克隆抗体，方法如下：
选取体重2-3kg约3个月龄健康白兔，饲养于标准实验动物房，观察一周后免疫。
取前期制备的抗原2mg溶于2mL生理盐水中，吸入5mL消毒注射器中，再加入2mL弗氏安全佐剂(首免用弗氏安全佐剂，二免开始用弗氏不安全佐剂)，混合乳化，用硅橡胶管连接另一支5mL的消毒注射器，双手对推，混合乳化至油包水(W/O)状态，向白兔背部皮内注射，依此进行首免、二免、三免、四免、五免、六免；首免与二免之间间隔两周，其它免疫间隔三周。
免疫四次后开始试血，即四免后7天-10天，从耳缘静脉采血0.5mL-1.0 mL，室温下静置2h，使血球凝固，以4000rpm离心，取血清进行倍比稀释，采用间接酶联免疫(ELISA)方法检查抗血清效价。
待效价大于或等于50000:1以后，白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为DMMP多克隆抗体，经分装后冻存。
最佳包被原浓度为2.5μg/mL，包被原采用包被缓冲液(pH＝9.6的碳酸盐缓冲液)进行稀释。
结果表明，免疫原H1BSA中点效价(OD492nm＝1)为12800:1，终点效价 (P/N≥2)为60000:1。
(4)人工抗体特异性测定
分别以甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷和乐果等相关化合物作为小分子竞争物，采用所建立的ELISA方法，进行间接竞争性抑制试验。根据抑制曲线进行回归计算，计算产生50％抑制(或结合)的竞争物浓度IC50和各竞争物相对于半抗原(Ⅰ)的交叉反应性，测定结果见表1。
表1抗体特异性和交叉反应性
Figure BDA0002929227580000061
Figure BDA0002929227580000071
结果表明，该实施例所选的相关化合物对抗体均不显示交叉反应性，四种竞争物的IC50均大于105ng/mL，表明产生的抗体具有较高的特异性识别能力。
实施例二：
(1)半抗原(Ⅱ)的合成路线
Figure BDA0002929227580000072
半抗原(Ⅱ)的合成中，除反应物为1.680g(12.8mmol)6-氨基己酸和用碱量为0.9gKOH(16mmol)，其余反应物和合成步骤同实施例一中半抗原 (Ⅰ)的合成。
(2)抗原H2合成路线
Figure BDA0002929227580000073
抗原H2-Protein的合成步骤同实施例一中抗原H1-Protein的合成步骤。
经计算，半抗原(Ⅱ)与BSA的偶联比为58:1，与OVA的偶联比为 61:1。
(3)DMMP多克隆抗体制备
用以上合成的抗原H2-BSA溶液免疫动物制备DMMP多克隆抗体，其合成步骤以及透析袋预处理步骤同实施例一。
经透析袋预处理后计算，半抗原H2与BSA的偶联比为58:1，半抗原 H2与OVA的偶联比为61:1。
抗体效价测定结果表明，免疫原H2BSA中点效价(OD492nm＝1)为 25600:1，终点效价(P/N≥2)为100000:1。
(4)抗体特异性测定
分别以甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷和乐果等相关化合物作为小分子竞争物，采用所建立的ELISA方法，进行间接竞争性抑制试验。根据抑制曲线进行回归计算，计算产生50％抑制(或结合)的竞争物浓度IC50和各竞争物相对于半抗原(Ⅱ)的交叉反应性，测定结果见表2。
表2抗体特异性和交叉反应性
Figure BDA0002929227580000081
结果表明，该实施例所选的相关化合物对抗体均不显示交叉反应性，四种竞争物的IC50均大于105ng/mL，表明产生的抗体具有较高的特异性识别能力。
实施例三
实施例一中免疫抗原H1-BSA溶液免疫动物制备DMMP多克隆抗体的方法中采用间接非竞争ELISA方法进行方阵滴定，以测定抗血清与包被原的结合效价。
免疫原为半抗原与BSA的偶联物，包被原为与之对应的半抗原与OVA 的结合物。包被浓度分别设为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、 1.25μg/mL和0.625μg/mL，包被原采用包被缓冲液(pH＝9.6的碳酸盐缓冲液)进行稀释。具体操作步骤如下：
a)实施例一中的抗原H1-Protein包被：用系列稀释的包被原包被酶联反应板，每孔100μL，4℃过夜。
b)洗涤：取出酶联反应板恢复至室温，弃去包被液，用PBST溶液洗涤反应板五次，每次3min，每孔300μL，然后甩干酶联反应板。
c)封闭：以包被缓冲液配制的0.1％的明胶，每孔200μL，37℃水浴封闭100min。
d)洗涤：同b。
e)加入抗血清：将抗血清用PBST稀释液倍比稀释成不同浓度，分别稀释成100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600和51200倍，另设一个阴性对照血清和PBST空白对照。加入系列稀释的抗血清和对照溶液，每孔100μL，37℃水浴反应lh。
f)洗涤：同b。
g)加酶标二抗：用样品稀释液稀释合适浓度的羊抗兔酶标IgG，每孔加 100μL，37℃水浴反应lh。
h)洗涤：同b。
i)显色：加底物液，每孔150μL，37℃显色15min。
j)终止：向每孔中加入2mol/L的H2SO4溶液50μL终止反应。
k)测定：用酶标仪检测492nm波长下的各孔吸光值。
选择的对应的最佳包被原浓度分别2.5μg/mL。在最佳包被原浓度条件下，OD492nm＝0.8～1.2时相应的抗血清稀释度即为ELISA中点效价(工作效价)。OD值为阴性血清OD值的二倍时(即P/N≥2，P为代测血清在某一稀释倍数测定的吸光度值，N为阴性对照在相应稀释倍数测定的吸光度值) 对应的抗血清稀释度即为终点效价(阳性效价)。(阴性血清OD492nm＝0.1)。
结果表明免疫原H1BSA、包被原H1OVA，最佳包被原浓度2.5μg/mL，中点效价1：12800，终点效价＞50000。
实施例四：
实施例二中的抗原H2-Protein，包被步骤同实施例3，结果表明免疫原结果表明免疫原H2BSA、包被原H2OVA，最佳包被原浓度2.5μg/mL，中点效价1：25600，终点效价＞50000。
实施例五：
实施例一的人工抗原合成步骤中透析前，用2.0mol/L的NaOH溶液或 2.0mol/L的HCl溶液调节PBST溶液的pH值，配制pH值为5.0、6.2、7.4 和8.6的反应液，以此稀释甲基膦酸二甲酯标准液和抗血清，进行间接竞争 ELISA的检测。
pH值 5.0 6.2 7.4 8.6
IC<sub>50</sub>(ng/mL) 123 81 75 83
Slope -18.2 -20.89 -20.32 -19.68
结果表明可见，pH值偏弱酸性时，甲基膦酸二甲酯对抗体的竞争性抑制作用减弱，而pH值在6.2和8.6之间时，反应体系pH值对竞争反应影响并不显著。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种甲基膦酸二甲酯人工抗原，其特征在于，分子结构式为如下所示：
Figure 70339DEST_PATH_IMAGE001
，
其中H2-Protein的合成底物对应甲基膦酸二甲酯半抗原
Figure DEST_PATH_IMAGE002
R2 = —NH—(CH2)5COOH，
所述Protein为载体蛋白中牛血清蛋白。
2.一种制备如权利要求1所述的甲基膦酸二甲酯人工抗原的方法，其特征在于，使用甲基膦酸二甲酯半抗原先在二环己基碳化二亚胺的作用下，与N-羟基琥珀酰亚胺发生活化酯反应，生成活化酯衍生物，所述活化酯与牛血清蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物。
3.一种甲基膦酸二甲酯抗体，其特征在于，所述甲基膦酸二甲酯抗体由权利要求1所述人工抗原进行免疫实验动物获得，具体步骤如下：
S1、选取体重2-3kg约3个月龄健康白兔，饲养于标准实验动物房，观察一周后免疫；
S2、取前期制备的抗原2mg溶于2mL生理盐水中，吸入5mL消毒注射器中，再加入2mL弗氏安全佐剂，混合乳化，用硅橡胶管连接另一支5mL的消毒注射器，双手对推，混合乳化至油包水状态，向白兔背部皮内注射，依此进行首免、二免、三免、四免、五免、六免；首免与二免之间间隔两周，其它免疫间隔三周；
S3、免疫四次后开始试血，即四免后7天-10天，从耳缘静脉采血0.5 mL -1.0 mL，室温下静置2 h，使血球凝固，以4000 rpm离心，取血清进行倍比稀释，采用间接酶联免疫方法检查抗血清效价；
S4、待效价大于或等于50000:1以后，白兔颈动脉采血，常规方法制备大批量抗血清，这些抗血清即为DMMP多克隆抗体，经分装后冻存；
S5、最佳包被原浓度为2.5μg / mL，包被原采用pH=9.6的碳酸盐缓冲液进行稀释。
4.根据权利要求3所述的甲基膦酸二甲酯抗体，其特征在于，甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷及乐果对所述抗体均不显示交叉反应性，且所述甲胺磷、甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、乐果的50%抑制竞争物浓度IC 50 均大于105ng/mL。
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