CN111499637A - 一种育亨宾半抗原yha、人工抗原和其抗体及其制备和应用 - Google Patents

一种育亨宾半抗原yha、人工抗原和其抗体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种育亨宾半抗原YHA、人工抗原和其抗体及其制备和应用。本发明首先制备得到了一种育亨宾半抗原YHA，所述育亨宾半抗原YHA的结构式如式(I)所示：
Figure DDA0002452620520000011
应用该半抗原制备得到了育亨宾人工抗原和育亨宾抗体YHA‑IgG，该抗体YHA‑IgG对育亨宾的检测灵敏度高、特异性强，半抑制浓度为0.50μg/kg，对育亨宾的检测范围为0.12～2.18μg/kg，最低检测限为1.13μg/kg，满足了检测要求；另外，育亨宾半抗原YHA、育亨宾人工抗原和育亨宾抗体YHA‑IgG的制备方法简单、成本低，为建立特异性育亨宾的免疫学检测方法提供了核心原材料；因此，该育亨宾抗体YHA‑IgG在检测育亨宾中具有广泛的应用前景。

Description

一种育亨宾半抗原YHA、人工抗原和其抗体及其制备和应用
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种育亨宾半抗原YHA、人工抗原和其抗体及其制备和应用。
背景技术
育亨宾(Yohimbine)是一种天然的生物碱，可从育亨宾树的树皮和萝芙木的根中提取。育亨宾主要用于治疗男性性功能障碍、动脉硬化、风湿病等，同时具有清风热、降肝火、消肿毒的功效。此外，育亨宾还具有加速肌体能量代谢，增加能量供给的作用，因此，育亨宾容易被无良商家非法添加到食品或保健品中。
而育亨宾服用过量时通常会引起激动、焦虑、高血压和心跳加速，严重时会引起急性神经毒性作用，甚至导致人死亡；例如：Drevin等(2013)和Anderson等(2019)均报告了关于服用育亨宾过量而死亡的案例。而捷克共和国农业和食品检疫局更是颁布了禁止将育亨宾用于运动员的食品和食品添加剂中的法律。因此，十分有必要对食品或食品添加剂中的育亨宾进行检测。
目前，育亨宾的检测方法有高效液相色谱(HPLC)、高效液相-质谱联用(HPLC-MS)、高效毛细管电泳法和分子印迹法等方法。这些方法虽然准确度高，但仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作，不符合现场检测“低成本、快速、准确和大批量检测”的要求。而免疫学检测方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测。但是，目前没有应用免疫学方法检测育亨宾的报道，而在建立能够高效、特异性检测育亨宾的免疫学检测方法时，关键在于获得灵敏度高、特异性强的抗体，而要实现这一目标，首先要合成出合适的育亨宾半抗原。因此，迫切需要建立一种检测效率高、灵敏度高、特异性强、能专一检测育亨宾的免疫学检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有免疫学检测育亨宾的方法的空白，提供一种育亨宾半抗原YHA、人工抗原和其抗体及其制备和应用。
本发明的第一个目的是提供一种育亨宾半抗原YHA。
本发明的第二个目的是提供所述育亨宾半抗原YHA的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种育亨宾人工抗原。
本发明的第四个目的是提供所述育亨宾人工抗原的制备方法。
本发明的第五个目的是提供所述育亨宾半抗原YHA或所述育亨宾人工抗原在制备育亨宾抗体YHA-IgG中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种育亨宾抗体YHA-IgG。
本发明的第七个目的是提供一种重组细胞。
本发明的第八个目的是提供所述育亨宾抗体YHA-IgG或所述重组细胞在检测育亨宾中的应用。
本发明的第九个目的是提供一种检测育亨宾的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种育亨宾半抗原YHA，所述育亨宾半抗原YHA的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002452620500000021
所述育亨宾半抗原采用系统命名法命名为：
(1r，2s，4ar，13bs，14as)-2-羟基-1,2,3,4,4a，5,7,8,13,13b，14,14a-十二氢吲哚[2',3'：3,4]吡啶[1,2-b]异喹啉-1-羧酸(即(1R,2S,4aR,13bS,14aS)-2-hydroxy-1,2,3,4,4a,5,7,8,13,13b,14,14a-dodecahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[1,2-b]isoquinoline-1-carboxylic acid)。
优选地，所述育亨宾半抗原YHA的制备方法为：将盐酸育亨宾-甲醇溶液与氢氧化钠水溶液以体积比为1:0.8～1.2进行水解反应后，经酸化、除杂、干燥，即得所述育亨宾半抗原YHA。
更优选地，所述盐酸育亨宾-甲醇溶液与氢氧化钠水溶液的体积比为1：1。
优选地，所述盐酸育亨宾-甲醇溶液的浓度为0.085～0.256mol/L。
更优选地，所述盐酸育亨宾-甲醇溶液的浓度为0.128mol/L。
优选地，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～1.5mol/L。
更优选地，所述氢氧化钠水溶液的浓度为1mol/L。
本发明还提供了一种育亨宾人工抗原，所述育亨宾人工抗原的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002452620500000031
其中，P为阳离子化的牛血清蛋白或阳离子化的卵清蛋白。
优选地，所述育亨宾人工抗原的制备方法为：采用活泼酯法将所述的育亨宾半抗原YHA与阳离子化的牛血清蛋白或阳离子化的卵清蛋白偶联而得到。
所述育亨宾半抗原YHA或所述育亨宾人工抗原在制备育亨宾抗体YHA-IgG中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种育亨宾抗体YHA-IgG，由所述育亨宾半抗原YHA或所述育亨宾人工抗原制备而得到。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为能够表达所述育亨宾抗体YHA-IgG的细胞。
另外，所述育亨宾抗体YHA-IgG或所述重组细胞在检测育亨宾中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种检测育亨宾的方法，以所述育亨宾半抗原YHA与阳离子化的卵清蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，以所述育亨宾抗体YHA-IgG作为检测抗体进行检测。
优选地，所述方法为ELISA检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种育亨宾半抗原YHA、人工抗原和其抗体及其制备和应用。本发明制备得到了育亨宾半抗原YHA，应用该半抗原制备得到了育亨宾人工抗原和育亨宾抗体YHA-IgG，该抗体YHA-IgG对育亨宾具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为0.50μg/kg，对育亨宾的检测范围为0.12～2.18μg/kg，最低检测限为1.13μg/kg；说明本发明制备得到的育亨宾抗体YHA-IgG能够满足检测要求，且对育亨宾的检测灵敏度高、特异性强；另外，育亨宾半抗原YHA育亨宾人工抗原和育亨宾抗体YHA-IgG的制备方法简单、成本低，为建立特异性育亨宾的免疫学检测方法提供了核心原材料，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是育亨宾半抗原的合成过程示意图。
图2是紫外全波长扫描鉴定结果图。
图3是育亨宾抗体YHA-IgG的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1育亨宾半抗原YHA的合成与鉴定
1、实验方法
(1)将盐酸育亨宾(YHB·HCl)溶解于甲醇中，得到的浓度为0.128mol/L的盐酸育亨宾-甲醇溶液与1mol/L的氢氧化钠水溶液进行水解反应(体积比为1：1)，反应产物经盐酸酸化后，旋蒸除去溶剂，用无水甲醇溶液复溶后过滤，得到的滤液用无水硫酸钠干燥；
(2)将液体真空旋转蒸干后，用液相纯化产物，流动相为0.1％甲酸水溶液，柱温40℃，流速300μL/min，收集目标产物；
(3)用育亨宾的标准品进行核磁鉴定，将目标产物冻干后，进行核磁共振氢谱鉴定和质谱鉴定。
育亨宾半抗原的合成过程示意图如图1所示。
2、实验结果
目标产物的核磁共振氢谱结果如下：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)
δ7.47(d,J＝7.9Hz,2H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),7.17–7.11(m,2H),7.05(t,J＝7.5Hz,2H),4.71(d,J＝12.2Hz,2H),4.33(q,J＝2.8Hz,2H),3.81(s,1H),3.62–3.51(m,4H),3.35(s,1H),3.08(d,J＝16.2Hz,2H),2.37(dd,J＝11.6,2.6Hz,2H),2.29–2.20(m,2H),1.97(dq,J＝13.6,3.4Hz,2H),1.82(d,J＝12.1Hz,2H),1.75–1.66(m,2H),1.65–1.54(m,4H),1.53–1.48(m,3H)。
目标产物的质谱结果如下：MS:C20H24N2O3:340，ESI+[M-H]+:341。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功合成了目标产物，命名为育亨宾半抗原YHA，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002452620500000051
所述育亨宾半抗原采用系统命名法命名为：
(1r，2s，4ar，13bs，14as)-2-羟基-1,2,3,4,4a，5,7,8,13,13b，14,14a-十二氢吲哚[2',3'：3,4]吡啶[1,2-b]异喹啉-1-羧酸(即(1R,2S,4aR,13bS,14aS)-2-hydroxy-1,2,3,4,4a,5,7,8,13,13b,14,14a-dodecahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[1,2-b]isoquinoline-1-carboxylic acid)。
实施例2育亨宾人工抗原的合成与鉴定
本发明成功合成了育亨宾-EDC-cBSA人工抗原、育亨宾-EDC-cOVA人工抗原，具体的实验方法和结果如下：
1、载体蛋白的阳离子化
(1)取0.675g牛血清蛋白(BSA)(0.015mmol)和56mg乙基-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)(0.3mmol)溶于20mL PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)，置于磁力搅拌器上室温搅拌30min，使其充分溶解；
(2)将缓冲液缓慢加入到溶解有18mg乙二胺的(0.3mmol)20mL PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)中，置于磁力搅拌器上室温搅拌2h；
(3)将混合溶液转移至透析袋中，以PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)为透析液，置于4℃环境下搅拌透析3天，每6h更换1次透析液，以除去过量的乙二胺；
(4)将透析后的溶液在4000r/min、4C下离心30min，收集上清液冻干，得白色絮状固体，得到阳离子化的牛血清蛋白(cBSA)，-20℃保存；
同理，取相同量的卵清蛋白(OVA)，用相同的方法制备得到阳离子化的卵清蛋白(cOVA)。
2、育亨宾-EDC-cBSA人工抗原、育亨宾-EDC-cOVA人工抗原的合成
1)实验方法
(1)称取10mg实施例1制备得到的育亨宾半抗原YHA，4mg的NHS和7mg的EDC溶解于100uL无水DMF中，室温搅拌4h；
(2)称取23.5mg cBSA加入到0.9mL的PBS缓冲液中；
(3)将步骤(1)所得溶液逐滴缓慢加入步骤(2)所得溶液中，4℃搅拌过夜(12h)；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，收集透析产物1；
其中，PBS的配方为：Na2HPO4·12H2O 14.50g，NaCl 42.50g，KCl 1.00g，KH2PO41.00g，加蒸馏水定容至1000mL。
同理，用cOVA替代cBSA作为载体蛋白，用相同的方法制备得到透析产物2。
然后，将cOVA、cBSA、育亨宾半抗原YHA、透析产物1和透析产物2分别用紫外全波长扫描法(200～400nm)进行鉴定。
2)实验结果
紫外全波长扫描鉴定结果图如图2所示，比较偶联前后的cOVA、cBSA、育亨宾半抗原YHA、透析产物1和透析产物2的最高吸光值可知，透析产物1和透析产物2的吸收曲线与cOVA、cBSA的吸收曲线明显不同，且透析产物1和透析产物2在350nm处出现了育亨宾的特征吸收峰；因此，透析产物1和透析产物2的吸收曲线是cOVA、cBSA分别与育亨宾半抗原YHA累加的吸收峰；说明育亨宾半抗原YHA分别成功偶联了cOVA、cBSA，本发明成功制备得到了育亨宾-EDC-cBSA人工抗原、育亨宾-EDC-cOVA人工抗原。
实施例3育亨宾抗体YHA-IgG的制备
育亨宾抗体YHA-IgG的制备方法，包括以下步骤：
(1)以300μL育亨宾-EDC-cBSA人工抗原(1mg/mL)为免疫原，用2只5周龄的新西兰大白兔(雌性和雄性)进行免疫，初次免疫时将YHA-cBSA按体积比1：1与弗式完全佐剂乳化，分别免疫雌性新西兰大白兔和雄性新西兰大白兔；之后将YHA-cBSA按体积比1：1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行1次加强免疫，共加强免疫5次；
(2)第三次免疫一周后开始对兔子进行耳缘静脉取血，收集兔血，标记后在4℃条件下，5000r/min离心20min，获得上清液，用于ELISA检测免疫效果；
(3)第六次免疫取兔子心脏血，将所得兔血在37℃温育2h后，在4℃条件下放置过夜(12h)，第二天将水层清液取出，然后在4℃条件下，3000r/min离心10min，去除沉淀，获得上清液；
(4)取1体积的兔血清与2体积的pH 4.8的醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸，使用量为75μL正辛酸/mL兔血清；
(5)室温搅拌混合30min，4℃静止2h使其充分沉淀，然后在4℃条件下，12000r/min离心15min，去除沉淀；
(6)将上清经砂芯漏斗或125μm尼龙网过滤后，加入1/10体积的0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液，用2M的氢氧化钠调pH至7.4，计算总溶液体积；
(7)冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸铵，使其成为45％饱和溶液；
(8)4℃静止1h以上后，4℃条件下，12000r/min离心15min，弃上清；
(9)沉淀用0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液透析三天，即得育亨宾抗体YHA-IgG。
实施例4育亨宾抗体YHA-IgG的ELISA检测的灵敏度验证
1、实验方法
(1)将兔血清用PBST稀释为1：1000，同时设置空白对照孔(未加入兔血清IgG，用PBST代替)；
(2)将育亨宾-EDC-cOVA人工抗原作为包被原，用包被液稀释至1μg/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜，弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(1％鱼胶蛋白)，37℃封闭30min，弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
(4)用PBST 1000倍稀释兔血清，并将育亨宾稀释至1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064ng/mL；
(5)每行加50μL育亨宾稀释液(三组平行)，再加50μL兔血清稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次，拍干；
(6)加入羊抗兔二抗IgG-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；
(7)每孔加入显色液100μL显色10min；
(8)加入50μL10％H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值。
2、实验结果
育亨宾抗体YHA-IgG的间接竞争ELISA标准曲线如图3所示，可以看出，育亨宾抗体YHA-IgG的半抑制浓度(IC50)为0.50μg/kg，对育亨宾的检测范围为(IC20～IC80)为0.12～2.18μg/kg，最低检测限为1.13μg/kg；说明本发明制备得到的育亨宾抗体YHA-IgG能够满足检测要求，且对育亨宾具有高灵敏度的识别能力，对育亨宾的检测灵敏度高。
实施例5育亨宾抗体YHA-IgG的ELISA检测的特异性验证
1、实验方法
通过育亨宾与其类似物进行交叉反应实验来确定育亨宾抗体YHA-IgG的特异性，用交叉反应率(CR)表示抗体的特异性，交叉反应越小，特异性越好。
将育亨宾及其类似物(酚妥拉明、妥拉唑林、利血平、哌唑嗪、特拉唑嗪)作为竞争抗原，分别做系列稀释，采用间接竞争ELISA方法测定，步骤参考实施例4灵敏度验证的实验方法，得到各类似物的IC50值。用以下公式计算育亨宾和各类似物的交叉反应率(CR)：
Figure BDA0002452620500000081
2、实验结果
育亨宾与其类似物交叉反应实验结果如表1所示，结果发现：育亨宾抗体YHA-IgG对育亨宾的交叉反应率为100％，IC50值为0.50，而对其类似物无反应或其交叉反应率均小于0.1％；说明育亨宾抗体YHA-IgG对育亨宾具有极高的特异性，可有效的排除其类似物的干扰，可专门用于育亨宾的检测。
以上结果说明：本发明制备得到的育亨宾抗体YHA-IgG对育亨宾具有很强的检测特异性。
表1育亨宾与其类似物交叉反应实验结果
Table 1Cross-reactivity of yohimbine antibody towards analogues
Figure BDA0002452620500000082
Figure BDA0002452620500000091
Figure BDA0002452620500000101
注：NR表示无反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种育亨宾半抗原YHA，其特征在于，所述育亨宾半抗原YHA的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002452620490000011
2.权利要求1所述育亨宾半抗原YHA的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将盐酸育亨宾-甲醇溶液与氢氧化钠水溶液以体积比为1:0.8～1.2进行水解反应后，经酸化、除杂、干燥，即得所述育亨宾半抗原YHA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐酸育亨宾-甲醇溶液的浓度为0.085～0.256mol/L；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～1.5mol/L。
4.一种育亨宾人工抗原，其特征在于，所述育亨宾人工抗原的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0002452620490000012
其中，P为阳离子化的牛血清蛋白或阳离子化的卵清蛋白。
5.权利要求4所述育亨宾人工抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法为采用活泼酯法将权利要求1所述的育亨宾半抗原YHA与阳离子化的牛血清蛋白或阳离子化的卵清蛋白偶联而得到。
6.权利要求1所述育亨宾半抗原YHA或权利要求4所述育亨宾人工抗原在制备育亨宾抗体YHA-IgG中的应用。
7.一种育亨宾抗体YHA-IgG，其特征在于，由权利要求1所述育亨宾半抗原YHA或权利要求4所述育亨宾人工抗原制备而得到。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为能够表达权利要求7所述育亨宾抗体YHA-IgG的细胞。
9.权利要求7所述育亨宾抗体YHA-IgG或权利要求8所述重组细胞在检测育亨宾中的应用。
10.一种检测育亨宾的方法，其特征在于，以权利要求1所述育亨宾半抗原YHA与阳离子化的卵清蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，以权利要求7所述育亨宾抗体YHA-IgG作为检测抗体进行检测。
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