CN105481859A - 一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents
一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种他达那非及其结构类似物的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括包被有他达那非抗原的酶标板、他达那非抗体工作液、辣根过氧化物酶标记的二抗、他达那非标准品工作液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液。本发明同时公开了利用所述试剂盒检测保健食品中他达那非及其结构类似物的方法。本发明提供的检测他达那非及其类似物的试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附分析技术,最大检测范围为?0.12~7.45?ng/mL,半抑制浓度为0.933?ng/ml,检出限为0.095?ng/mL,回收率为83.0~119.2%,检出限低、灵敏度高、稳定性好,成本低,非常适合大量样品的初筛,对保健食品中他达那非的违禁添加的快速检测具有重要现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全免疫检测技术领域,更具体地,涉及一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
他达那非(tadalafil)是继西地那非的第二代FDA批准使用的用于治疗男性功能性勃起障碍的处方药,与西地那非一样均是PDE5抑制剂,相比于西地那非,他达那非具有药效持续时间长的优点。
他达拉非与西地那非一样都为非选择性PDE-5,在抑制PDE5的同时也会抑制PDE6,从而引起视觉和听力的损伤。且若过量服用则会引起头痛、消化不良,颜色分辨下降等不良反应,与硝酸酯类药物的共同服用时更会导致严重的低血压,甚至导致心悸猝死,故PDE-5药物一定要在医生的指导下服用。
但近年来发现,一些保健食品中尤其是天然的补肾壮阳保健品被一些不法商家人为的添加了PDE-5药物,若患有糖尿病、高血压,高血脂、冠心病等疾病的病人在服用硝酸酯类药物的同时又服用这些含有他达那非类PDE-5药物的保健品,将会导致不可预估的危害,因此对他达那非等PDE-5药物的检测的研究也尤其迫切和重要。
他达那非的检测目前最常用的方法为仪器分析法,沈志武等人用反相高效液相色谱法对胶囊中他达那非进行检测,检出限可以达到5ng/L,王美玲等人采用高效液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱法检测保健品中28种磷酸二酯酶-5抑制剂(PDE-5)及其类似物的含量,该方法的检出限为0.2~7.0μg/L。行标SN/T1951-2007中采用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)方法对出口食品中的他达那非进行检测。虽然上述几种仪器分析法的检测精确度高,但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等,从而阻碍了其推广应用,因而通常作为实验室确证方法,但是无法满足现场或者大批量的快速筛查检测。而免疫分析法因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低,值得我们推广成为常用的筛选方法。目前关于他达那非的免疫分析方法鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中他达那非检测方法出现的上述缺陷,提供一种他达那非的人工半抗原。
本发明的第二个目的是提供一种他达那非的人工抗原。
本发明的第二个目的是提供他达那非的人工抗体。
本发明的第三个目的是提供上述他达那非的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的的第四个目的是提供上述试剂盒的使用方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种他达那非半抗原,其结构式为:
。
申请人将氨基他达那非与多种物质结合,研究其免疫效果,结果表明当和顺丁烯二酸酐相结合制备半抗原后,利用所述半抗原制备抗原,具有优异的免疫效果。
本发明还提供式(I)所述化合物作为检测他达那非及其结构类似物的半抗原的应用,其特征在于,式(I)的结构式为:
(I)。
所述他达那非的结构类似物为正辛基他达那非、正丁基他达那非、羟丙基他达那非、环戊基他达那非、去甲基他达那非、乙酰他达那非、氨基他达那非。
本发明所述半抗原的制备方法,是按投料摩尔比为1:1~1.4将氨基他达那非和顺丁烯二酸酐置于反应器中,加入适量的DMF溶解,60~65℃水浴2~4h;将得到的反应物60~75℃旋转蒸发除去DMF;得到的残渣用乙酸乙酯溶解,再滴加正己烷进行重结晶,过滤收集沉淀即得。
氨基他达那非和顺丁烯二酸酐的投料比以及二者的反应温度显著影响获得半抗原的效果,必须要在上述范围内才能获得效果良好的半抗原。
本发明还提供一种他达那非人工抗原,由所述他达那非半抗原与载体蛋白偶联获得,其结构式为:
其中,Pro为载体蛋白,所述载体蛋白选自牛血清蛋白、人血蓝蛋白或卵清蛋白。
本发明所述的他达那非人工抗原的制备方法采用活泼酯法,具体步骤如下:
(1)将等摩尔的前述方法制备得到的他达那非半抗原、DCC、NHS溶解于DMF中,4℃反应过夜;
(2)将步骤(1)所得的反应物离心取上清液,将上清液加入到含有载体蛋白(牛血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白)的PBS缓冲液中,将混合物在4℃反应12h;
(3)将步骤(2)中反应物装入到透析袋中,透析得到所述他达那非人工抗原。
本发明还提供所述他达那非人工抗原制备得到的他达那非抗体,包括他达那非单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体。
所述的他达那非多克隆抗体的制备方法如下:将上述他达那非人工抗原作免疫原免疫兔子或小鼠,制备他达那非多克隆抗体,最后收集抗血清,用辛酸硫酸铵沉淀纯化及过亲和层析柱进行纯化。
所述的他达那非单克隆抗体的制备方法如下:
为本实验室前期制备得到,其具体制备方法如下:将上述他达那非人工抗原作免疫原免疫兔子或小鼠,用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养,获得含高浓度单克隆抗体的腹水,并对腹水纯化得到高特异性抗他达那非单克隆抗体。
本发明还提供上述他达那非半抗原在检测他达那非及其结构类似物方面的应用;本发明还提供上述他达那非半抗原在制备检测他达那非及其结构类似物的制剂方面的应用。
本发明还提供上述他达那非人工抗原在检测他达那非及其结构类似物方面的应用;本发明还提供上述他达那非人工抗原在制备检测他达那非及其结构类似物的制剂方面的应用。
本发明还提供上述他达那非人工抗体在检测他达那非及其结构类似物方面的应用;本发明还提供上述他达那非人工抗体在制备检测他达那非及其结构类似物的制剂方面的应用。
本发明还提供一种他达那非及其结构类似物酶联免疫检测方法,是利用他达那非人工抗原包被酶标板。
本发明还提供一种用于检测他达那非及其结构类似物的酶联免疫分析试剂盒,所述试剂盒含有上述人工抗原和/或抗体。
优选地,所述试剂盒包括:包被有他达那非人工抗原的酶标板;他达那非抗体工作液;辣根过氧化物酶标记的二抗;他达那非标准品工作液;底物液和底物缓冲液;反应终止液和浓缩洗涤液。
其中所述的包被的他达那非抗原为他达那非人工合成半抗原与卵清蛋白的偶联物。
包被他达那非抗原的包被液优选为按比例将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到,他达那非抗原的包被浓度为31.25μg/ml;封闭液优选为取0.1gBSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mLPBS(0.01mol/LpH7.4)溶液得到。
所述包被有他达那非抗原的酶标板是96孔或40孔酶标板,材质为聚苯乙烯,包被有能与抗他达那非抗体特异性结合的他达那非抗原,并封闭微孔表面未吸附他达那非抗原的位点。
另外,可以作为固定他达那非抗原固相载体的物质较多,例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠等。
所述的辣根过氧化物酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标鼠二抗或兔二抗,二抗的工作浓度为1:5000。
所述他达那非标准品工作液的浓度为1mg/mL;所述他达那非抗体的工作浓度为1:8000。
所述的底物液为含有3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)或领苯二胺(OPD)的pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液。
所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液。
所述的反应终止液为1-2mol/L的硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。
所述的浓缩洗涤液为含有0.5~1.5%(V/V)吐温-20的磷酸盐缓冲液;所述浓缩洗涤液pH值为7.4.浓缩洗涤液浓度为0.1mol/L。所述浓缩洗涤液使用时用去离子水稀释成1倍制成洗涤液。
本发明还提供所述试剂盒在检测他达那非及其结构类似物方面的应用。
具体地,所述应用是利用所述试剂盒检测他达那非及其结构类似物,包括如下步骤:
S1.将试剂盒从冷藏环境中取出,置于15~35℃平衡30min~45min;
S2.取出包被有上述他达那非人工抗原的酶标板,往标准孔中加入经稀释过的,不同浓度的他达那非标准品溶液(所述他达那非标准品溶液由他达那非标准品工作液经稀释获得),样品孔中加入待测样品,然后每孔加入他达那非抗体,盖上盖板膜振摇混匀,孵育;
S3.吸除板孔中的反应液,用洗涤液进行洗涤,将酶标板拍干;
S4.加入辣根过氧化物酶标记的二抗,轻拍混匀,孵育;
S5.吸除板孔中的反应液,用洗涤液进行洗涤,将酶标板拍干;
S6.将底物液和底物缓冲液等体积混合得到显色液,每孔加入显色液,轻拍混匀,避光孵育;
S7.每孔加入反应终止液,混合均匀,在波长450nm或492nm处,以空气为空白,测定各孔的吸光值;
优选地,步骤S2中所述待测样品为补肾糖浆、胶囊、片剂、玛卡酒等。
优选地,所述待测样品需要检测前需要进行前处理,具体如下:
片剂、胶囊试样:称取1g试样(精确至0.01g)置于25mL容量瓶中,加入20mL甲醇,盖上盖混匀,超声30min,冷却至室温后,用甲醇定容至刻度,摇匀。取1.0mL样液于10mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶液定容后混匀,待净化。
液体试样:准确移取1.0mL试样置于10mL容量瓶中,加入8mL0.1mol/L盐酸溶液,超声30min,定容至刻度,摇匀,待净化。
净化:将处理好的样液以小于1mL/min的流速过OASISHLBSPE柱净化,用2mL水淋洗SPE柱,真空抽干,用甲醇+乙腈(1+1,体积比)洗脱,收集洗脱液,40℃氮气吹干,用1.0mL0.1%盐酸+甲醇(9+1,体积比)复溶解用于分析。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种他达那非及其结构类似物的人工抗原、抗体及其酶联免疫检测试剂盒,是以氨基他达那非为原料,氨基他达那非与顺丁烯二酸酐反应生成含有4个碳原子手臂的半抗原,本发明他达那非半抗原能更充分的暴露给动物的免疫系统;将本发明他达那非半抗原与蛋白偶联制备人工抗原,将他达那非人工抗原免疫动物,获得多克隆抗体,并采用细胞融合技术制得对他达那非高特异性的单克隆抗体,使用本发明得到的抗体建立免疫检测试剂盒不仅能特异、快速检测他达那非,还能检测他达那非结构类似物,这对保健食品中他达那非违禁添加的快速检测具有很重要的现实意义。
附图说明
图1为他达那非标准曲线。
图2为抗原紫外扫描图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换,均属于本发明的范围;若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所使用试剂的制备方法如下:
包被液:将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到。
封闭液:取0.1gBSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mLPBS溶液(0.01mol/LpH7.4)得到。
实施例1半抗原的合成
称取氨基他达那非78mg(0.2mM),顺丁烯二酸酐18mg(0.2mM)置于圆底烧瓶,并将混合物用少量无水DMF溶解,60℃回流2h,展开剂甲醇:氯仿1:10进行反应监控,反应结束后,75℃真空旋转蒸发除去DMF,残渣用少量乙酸乙酯溶解,滴加正己烷进行重结晶,过滤烘干,得到的淡黄色粉末即为他达那非-顺丁烯二酸酐半抗原。
实施例2人工抗原的合成
称取实施例1得到的他达那非-顺丁烯二酸酐半抗原0.02mM,NHS3.22mg(0.028mM)和DCC5.78mM(0.028mM)溶于200μlDMF中,4℃搅拌过夜,将反应液8000r/min离心10min,取上清液,得A液;称取13.6mgBSA(或4.5mgKLH、9mgOVA)溶于4mLPBS缓冲液中,4℃搅拌,将A液逐滴加入到BSA溶液(或者KLH溶液或者OVA溶液)中,避光反应过夜。将反应液装入透析袋中用PBS透析三天。紫外扫描证实偶联成功,得到他达那非-顺丁烯二酸酐抗原。
实施例3免疫动物及多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物,以他达那非-顺丁烯二酸酐半抗原与载体蛋白BSA的偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,多次免疫后测定血清抗体效价,心脏采血,经辛酸-硫酸铵分级沉淀及蛋白A层析柱得到纯化的多克隆抗体。
实施例4单克隆抗体的制备
本发明采用雌性Balb/c小鼠作为免疫动物,以他达那非-顺丁烯二酸酐半抗原与载体蛋白KLH的偶联物为免疫原对7周龄雌性Balb/c小鼠进行免疫,4次免疫后,尾部取血测定抗血清效价和特异性,待抗血清效价和特异性合格后,进行一次不含佐剂的加强免疫,加强免疫3天后进行细胞融合;用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养,获得含高浓度单克隆抗体的腹水,并对腹水纯化得到高特异性抗他达那非单克隆抗体。
实施例5酶联免疫试剂盒的制备
1、准备试剂
(1)包被有他达那非-顺丁烯二酸酐抗原的酶标板:96孔可拆酶标板,已包被他达那非-顺丁烯二酸酐抗原及封闭液,包被浓度为31.25μg/L(包被他达那非-顺丁烯二酸酐抗原用包被液稀释)。所述他达那非-顺丁烯二酸酐抗原为他达那非半抗原与OVA的偶联物。
酶标板微孔板的包被:每孔内加入100μL包被液,37℃孵育过夜,倾去孔内液体,洗涤液洗涤2次,拍干。然后每孔中加入120μL封闭液,37℃孵育3h,倾去孔内液体,置于37℃烘箱中烘干后,用铝箔袋真空密封4℃保存。
(2)他达那非标准品溶液的配制:准确称取他达那非标准品工作液,用色谱级甲醇稀释成1mg/mL,再用0.01mol/LPBST缓冲液(配方为NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、500μlTween-20,定容至1L)分别配制0.0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L的他达那非标准品溶液,4℃保存。
(3)采用商品化的辣根过氧化酶标记的二抗,用0.01mol/LPBST缓冲液(配方为NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、500μlTween-20,定容至1L)稀释,工作浓度为1:5000,这里的二抗是羊抗兔二抗或羊抗鼠二抗。
(4)他达那非抗体工作液,使用时用PBS缓冲液(配方为NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH2PO40.2g,定容至1L)稀释,工作浓度为1:8000。
(5)底物液:将3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)80mg溶于10mLpH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液(配方为25.7mL0.2M的Na2HPO4,24.3mL0.1M的柠檬酸,加蒸馏水50mL),4℃保存。
(6)底物缓冲液:30%过氧化氢30μL溶于19mLpH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液。
(7)浓缩洗涤液为含0.5~1.5%(V/V)吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4,0.1M),所述浓缩洗涤液pH为7.4,浓度为0.1M,使用时用去离子水稀释成1倍。
(8)反应终止液:1~2mol/L的硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。
2、试剂分装
将各试剂测定合格后无菌分装,已稀释好的他达那非标准品工作液lmL/瓶,他达那非抗体工作液7mL/瓶,已稀释的辣根过氧化酶标记的二抗7mL/瓶,底物液7mL/瓶,底物缓冲液7mL/瓶,20倍浓缩洗涤液50mL/瓶,反应终止液7mL/瓶。分装后贴标签,注明批号和有效期,4℃保存。
3、试剂盒的组装
分别将上述包被有他达那非-顺丁烯二酸酐抗原的酶标板1块,他达那非抗体工作液、辣根过氧化酶标记的二抗、底物液、底物缓冲液、20倍浓缩洗涤液各1瓶,他达那非标准品工作液6瓶和使用说明书1份置于试剂盒内指定位置,试剂盒检验合格后封装,4℃保存。
实施例6他达那非酶联免疫检测试剂盒的应用
1、样品前处理
片剂、胶囊试样:称取1g试样(精确至0.01g)置于25mL容量瓶中,加入20mL甲醇,盖上盖混匀,超声30min,冷却至室温后,用甲醇定容至刻度,摇匀。取1.0mL样液于10mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶液定容后混匀,待净化。
液体试样:准确移取1.0mL试样置于10mL容量瓶中,加入8mL0.1mol/L盐酸溶液,超声30min,定容至刻度,摇匀,待净化。
净化:将处理好的样液以小于1mL/min的流速过OASISHLBSPE柱净化,用2mL水淋洗SPE柱,真空抽干,用甲醇+乙腈(1+1,体积比)洗脱,收集洗脱液,40℃氮气吹干,用1.0mL0.1%盐酸+甲醇(9+1,体积比)复溶解用于分析。
2、利用实施例5制得的试剂盒进行检测
(1)取出试剂盒,置于室温(20~24℃)平衡30min以上,取出包被有他达那非-顺丁烯二酸酐抗原的酶标板,用0.01mol/LPBST缓冲液将他达那非标准品工作液稀释成一系列不同浓度的他达那非标准品溶液(0.0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L)。
(2)在标准孔加入50μL不同浓度的他达那非标准品溶液,样品孔加入50μL待测样品,然后每孔加入50μL用0.01mol/LPBS稀释好的实施例5制备得到的他达那非抗体,盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后,置于37℃孵育40min。
(3)吸除板孔中的液体,各孔加入洗涤液(用前稀释成1倍)约300μL,静置20秒左右,除去其中液体,如此共洗5次,最后一次将板拍干;也可用自动洗板机洗板5次,洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每轮洗板拍打3次),以保证完全除去孔中的液体。
(4)每孔中加入100μL用稀释液PBST(配方为NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、500μlTween-20,定容至1L)稀释的酶标二抗。盖上盖板膜在微量振荡器上振摇混匀,室温孵育30min;
(5)重复步骤(3)
(6)每孔加入100μL显色液(底物液和底物缓冲液等体积混合得到),轻拍混匀,盖上盖板膜,暗处室温孵育10min;
(7)加入50μL反应终止液到微孔中,混合后,在波长450nm(以空气为空白)处测定各吸光值,必须在加入终止液后60min内读取吸光值;
3、检测结果计算与分析
抑制率(%)=B/B0×100(%),式中:B为不同浓度标准品溶液孔(或待测样品孔)的吸光值;B0为0浓度标准品溶液吸光值。
以抑制率为纵坐标,他达那非标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线,以他达那非的吸光值代入上述标准曲线中求出待测样品中他达那非的含量。不考虑检测人员操作熟练程度的影响,整个检测过程仅仅需要90min左右即可完成。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。
4、标准曲线
通过对标准品溶液的检测结果分析得到他达那非标准曲线图(如附图1所示),表明了本发明试剂盒对对他达那非的线性检测范围为0.12~7.45ng/mL,半抑制浓度为0.933ng/ml,检出限为0.095ng/mL。
实施例7他达那非酶联免疫检测试剂盒特异性测定
选择他达那非类似物进行交叉反应,评价他达那非酶联免疫方法的特异性,结果如下表所示:
从表1可以看出他达那非抗体仅对他达那非的结构类似物有较高的交叉,而对于他达那非功能类似物均没有交叉,说明该抗体特异性好。
实施例8他达那非酶联免疫检测试剂盒的应用及精密度、准确度试验
1、他达那非标准品溶液的重复性试验
从3批按照实施例5中的方法制备的酶标板中,各随机抽出20个微孔,按照实施例6中试剂盒的检测方法测定1μg/L他达那非标准品溶液的吸光值,重复20次,计算变异系数CV%,结果如表2所示。
结果表明,本发明试剂盒标准品溶液检测的批内变异系数范围在3.9~7.2%之间,批间变异系数为8.6%。
2、样本重复性与准确度试验
准确度是指测得值与真值的符合程度,在酶联免疫测定中,准确度常以回收率表示,精密度常以变异系数来表示。在空白样品中,添加他达那非至终浓度为0.2、1.0、6.5μg/L,每个浓度各10个平行,测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表3。
结果表明,补肾糖浆、片剂、胶囊、玛卡酒样品的添加回收率在83.0~119.2%之间,批内变异系数在1.9~8.6%,批间变异系数5.8~9.8%之间,符合国家对于试剂盒各项指标的标准。
实施例9他达那非酶联免疫检测试剂盒保存期实验
1、将实施例5的试剂盒放置于2~8℃,分别取储存了0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒,对他达那非标准品溶液(1μg/L)的吸光度值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
2、将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天,每天对他达那非标准品溶液(1μg/L)的吸光度值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
3、将试剂盒在-20℃冰箱保存12天,每天对他达那非标准品溶液(1μg/L)的吸光度值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。
结果表明,经过三种条件保存试验,他达那非标准品溶液(1μg/L)的吸光度值下降小于10%,各项指标均符合质量要求,因此,试剂盒可以在2~8℃保存12个月。
Claims (10)
1.一种他达那非半抗原,其特征在于,其结构式为:
。
2.式(I)所述化合物作为检测他达那非及其结构类似物的半抗原的应用,其特征在于,式(I)的结构式为:
(I)。
3.权利要求1所述半抗原的制备方法,其特征在于,是按投料摩尔比为1:1~1.4将氨基他达那非和顺丁烯二酸酐置于反应器中,加入适量的DMF溶解,60~65℃水浴2~4h;将得到的反应物60~75℃旋转蒸发除去DMF;得到的残渣用乙酸乙酯溶解,再滴加正己烷进行重结晶,过滤收集沉淀即得。
4.一种他达那非人工抗原,其特征在于,由权利要求1所述他达那非半抗原与载体蛋白偶联获得,其结构式为:
其中,Pro为载体蛋白,所述载体蛋白选自牛血清蛋白、人血蓝蛋白或卵清蛋白。
5.权利要求4所述人工抗原制备得到的他达那非抗体。
6.权利要求1所述他达那非半抗原或权利要求4所述他达那非人工抗原在检测他达那非及其结构类似物方面的应用。
7.一种他达那非及其结构类似物酶联免疫检测方法,其特征在于,利用权利要求4所述他达那非人工抗原包被酶标板。
8.一种用于检测他达那非及其结构类似物的酶联免疫分析试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有权利要求4所述他达那非人工抗原和/或权利要求5所述他达那非抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:包被有他达那非人工抗原的酶标板;他达那非抗体工作液;辣根过氧化物酶标记的二抗;他达那非标准品工作液;底物液和底物缓冲液;反应终止液和浓缩洗涤液。
10.权利要求9所述试剂盒在检测他达那非及其结构类似物方面的应用。
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