CN104341409B - 一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用 - Google Patents

一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种噻苯咪唑半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述噻苯咪唑半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的噻苯咪唑半抗原是式1所示产物，用式1所示产物与载体蛋白连接可以得到噻苯咪唑抗原。所述噻苯咪唑抗原可应用于制备噻苯咪唑特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的噻苯咪唑人工抗原，通过免疫动物可产生了针对噻苯咪唑的特异性抗体，可用于制备检测噻苯咪唑残留的酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种噻苯咪唑半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。
背景技术
噻苯咪唑英文名TBZ(Thiabendazole)，别名：特克多；腐绝；硫苯唑；涕灭灵，分子式：C10H7N3S，分子量：201.25，原药为白色粉末，熔点：304～305℃，310℃升华。室温时溶解度为：丙酮28g/L，甲醇9.3g/L，二甲基亚砜80g/L，二甲基甲酰胺39.0g/L，苯2.3g/L，氯仿0.8g/L。在中性及酸性、碱性水溶液中稳定。
噻苯咪唑属于苯并咪唑类药物(benzimidazoles，BMZs)，为广谱、高效、低毒驱肠虫药，由于对对蛔、钩、鞭、蛲、粪圆线虫和旋毛虫感染，均有驱除作用，至今仍在广泛使用。噻苯咪唑可引起食欲不振、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、眩晕、头痛、嗜睡及黄视等。农业部235号公告规定了动物源性食品中噻苯咪唑的残留限量为100μg/kg。
目前的TBZ检测方法多为色谱法，但是需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为TBZ是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、方便、准确的检测牛奶中的TBZ残留，可为建立监控动物源性食品中TBZ残留提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种噻苯咪唑半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。
本发明提供的噻苯咪唑半抗原，是式1所示化产物：
式1
所述噻苯咪唑半抗原的合成路线示意图见图1。
本发明还公开了式1所示产物的制备方法，包括如下步骤：
取5-羟基噻苯咪唑220 mg、邻苯二甲酸酐500 mg和吡啶2 mL在20 mL 二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到式1所示产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯。
本发明提供的噻苯咪唑抗原，是将式1所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
所述噻苯咪唑抗原的结构示意图见图3。
本发明还保护所述噻苯咪唑抗原的制备方法，包括如下步骤：
（1）取式1所示产物10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；
（2）取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24 h，即可得到反应液A；
（3）称取载体蛋白50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24 h；
（4）用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
（5）分装，于-20℃保存备用。
常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。
所述噻苯咪唑抗原可以作为免疫原制备噻苯咪唑特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。
所述抗体具体可为单克隆抗体。
式1所示产物、所述噻苯咪唑抗原、所述抗体均可应用于检测噻苯咪唑。
本发明还公布了应用噻苯咪唑抗原和噻苯咪唑单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。
所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有噻苯咪唑抗原的酶标板、酶标抗体工作液、噻苯咪唑系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。
本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对噻苯咪唑样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的噻苯咪唑人工抗原，通过免疫动物可产生了针对噻苯咪唑的特异性抗体，用于快速检测食品中的噻苯咪唑残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。
附图说明
图1为噻苯咪唑半抗原合成路线图。
图2为噻苯咪唑半抗原核磁图谱。
图3为噻苯咪唑抗原的结构示意图。
图4为噻苯咪唑酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、噻苯咪唑半抗原的制备和鉴定
一、噻苯咪唑半抗原的制备
取5-羟基噻苯咪唑220 mg、邻苯二甲酸酐500 mg和吡啶2 mL在20 mL 二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到式1所示产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯。
二、噻苯咪唑半抗原的鉴定
将步骤一制备得到的噻苯咪唑半抗原进行核磁鉴定。
核磁图见图2。图谱显示8.0 ppm左右增加的两组芳环信号峰以及13.3 ppm左右增加的羧基信号峰说明半抗原合成成功。
实施例2、噻苯咪唑人工抗原的制备和鉴定
一、噻苯咪唑免疫抗原（TBZ-BSA）的合成
（1）取式1所示产物10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；
（2）取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24 h，即可得到反应液A；
（3）称取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24 h；
（4）用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
（5）分装，于-20℃保存备用。
二、噻苯咪唑包被抗原（TBZ-OVA）的合成
（1）取式1所示产物10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；
（2）取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24 h，即可得到反应液A；
（3）称取卵清蛋白（OVA）50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24 h；
（4）用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
（5）分装，于-20℃保存备用。
三、噻苯咪唑人工抗原的鉴定
按合成噻苯咪唑免疫抗原和包被抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm~400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得噻苯咪唑人工抗原。经计算，噻苯咪唑半抗原分子与BSA分子的结合比为15.4:1，噻苯咪唑半抗原分子与OVA分子的结合比为10.2:1。
实施例3、酶标单抗的制备和特异性鉴定
一、噻苯咪唑单抗的制备
1、用上述制备出的免疫原(TBZ-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的噻苯咪唑等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代噻苯咪唑作对照，其余步骤同上。若经噻苯咪唑阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
4、将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
二、酶标抗体的制备
（1）称取辣根过氧化物酶（HRP）2 mg溶解于0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/LNaIO4溶液，4℃避光作用30 min；
（2）加入160 mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30 min；
（3）加入步骤一制备的噻苯咪唑单抗2 mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05 mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；
（4）透析液吸至10 mL的离心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混匀后置4℃2 h；
（5）加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30 min后4℃下3000 r/min离心25min，弃上清；
（6）将沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/LpH 7.4 PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS 3次)；
（7）将透析袋中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。
三、酶标噻苯咪唑抗体效价的测定
噻苯咪唑标准品购自Sigma公司。
用方阵滴定法确定噻苯咪唑包被抗原和步骤一制备的单抗的工作浓度，噻苯咪唑包被抗原的工作浓度为2.5μg/mL，单克隆抗体的工作浓度为1:5000。
用不同浓度的噻苯咪唑标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0、1、3、9、27、81μg/L。采用8组平行试验(n=8)。间接竞争性ELISA方法：
（1）用上述工作浓度的噻苯咪唑抗原（TBZ-OVA）包被酶标板，将噻苯咪唑标准品实验溶液与酶标抗体溶液同时加入酶标板微孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将标准品实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，25℃避光环境中反应30min；
（2）倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；
（3）加入底物显色溶液到酶标板微孔中，25℃避光环境中反应15min；
（4）加入终止液，轻轻振荡混匀，用酶标仪在波长450nm处测定OD值。
以OD值为纵坐标，以噻苯咪唑实验溶液浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在10%以内。
根据标准曲线得出半数抑制量(IC50)，确定检测灵敏度。
抑制率用以下式计算：
式中：ODmax：为不加标准品时的吸光值，ODx为标准品x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得噻苯咪唑抗体在缓冲液中的半数抑制量(IC50)为4.3μg/L。
实施例4、检测噻苯咪唑的酶联免疫试剂盒及其制备
一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：
（1）包被噻苯咪唑半抗原(TBZ-OVA)的酶标板；
（2）酶标噻苯咪唑抗体工作液：实施例3中所述酶标抗体溶液；
（3）噻苯咪唑标准品：噻苯咪唑标准品溶液浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L；
（4）底物显色液：由A液和B液组成，A液为2%过氧化脲的水溶液，B液为1%四甲基联苯胺（TMB）的水溶液；
（5）终止液：0.2M硫酸水溶液；
（6）浓缩洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4；
（7）浓缩复溶液：0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液。
二、包被有TBZ-OVA的酶标板及其制备
包被TBZ-OVA的聚苯乙烯酶标板：用0.05M的碳酸盐溶液将抗原稀释至2.5μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL， 37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液：pH9.6，0.05mo1/L的碳酸钠缓冲液；
封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M， pH值为7.2。
三、试剂盒检测方法
(一)牛奶样品前处理
（1）量取牛奶样本400μL至2mL聚苯乙烯离心管中，加入乙腈600μL，涡动，静置2min；
（2）取出上清液50μL至2mL聚苯乙烯离心管中，加入复溶工作液750μL，用涡旋仪涡动30s，混匀；
（3）取50μL用于检测。
牛奶样本稀释倍数为：40
(二)用试剂盒检测
1、标准曲线的制作
向包被有TBZ-OVA的酶标板微孔中加入噻苯咪唑标准品溶液50μL，然后加入酶标抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混合均匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干。加入底物A液50μL/孔、底物B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。
用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值。以噻苯咪唑标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图4所示。
百分吸光度值(%)=(B/B0) ×100%
2、样品中噻苯咪唑浓度的测定
用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中噻苯咪唑的残留量，最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样品中噻苯咪唑的浓度。
四、试剂盒检测效果评价
(一)准确度和精密度试验
向不含噻苯咪唑的牛奶样品中添加噻苯咪唑标准品，使噻苯咪唑标准品在样品中的终浓度分别为40、80、160μg/L；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。
从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所述，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。
表1准确度和精密度试验结果
批内变异系数：同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数：同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
结果表明：牛奶样品的平均添加回收率在86.9~97.3%，批内变异系数在6.4~13.6%，批间变异系数在9.8~10.1 %。
(二)试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2~8℃，经过15个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(0标准)，50%抑制浓度、噻苯咪唑添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻9天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少可以保存12个月以上。
(三)交叉反应率试验
选择与TBZ结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验，通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明噻苯咪唑酶联免疫检测试剂盒对噻苯咪唑的检测特异性越好。结果见表2。
表2 噻苯咪唑试剂盒交叉反应率
药物名称 交叉反应率（%）
噻苯咪唑 100.0
苯并咪唑 <1.0
奥芬达唑 <1.0
丙硫咪唑亚砜 <1.0
氟苯咪唑 <1.0
丙氧咪唑 <1.0
阿苯达唑 <1.0
芬苯达唑 <1.0
盐酸左旋咪唑 <1.0
试验结果表明，本发明试剂盒对苯并咪唑、奥芬达唑、丙硫咪唑亚砜、氟苯咪唑、丙氧咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑、盐酸左旋咪唑的交叉反应率均小于1%，所以试剂盒对噻苯咪唑的特异性好，即本发明试剂盒可以检测噻苯咪唑。

Claims (1)

1.一种检测噻苯咪唑酶联免疫试剂盒的制备方法，它包括制备：
（1）包被噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物的酶标板；
（2）酶标噻苯咪唑抗体工作液；
（3）噻苯咪唑标准品：浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L；
（4）底物显色液：由A液和B液组成，A液为2%过氧化脲的水溶液，B液为1%四甲基联苯胺的水溶液；
（5）终止液：0.2M硫酸水溶液；
（6）浓缩洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4；
（7）浓缩复溶液：0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液；
其特征在于，所述酶标噻苯咪唑抗体的制备方法包括：称取辣根过氧化物酶2mg溶解于0.5mL水中，加入0.5mL 0.06mol/L NaIO4溶液，4℃避光作用30min；加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30min；加入噻苯咪唑单克隆抗体2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；透析液吸至10mL的离心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混匀后置4℃ 2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后4℃下3000r/min离心25min，弃上清；将沉淀溶于1.5mL 0.02mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜，中途更换PBS 3次；将透析袋中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用；
所述噻苯咪唑单克隆抗体的制备方法包括：
（1）用噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物按100μg/只，以生理盐水溶解噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c 雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次；
（2）按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂PEG4000进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5% CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液；
（3）细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞，初选采用间接ELISA方法，以噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应，筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的噻苯咪唑等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中，同时用PBS取代噻苯咪唑作对照，其余步骤同上，若经噻苯咪唑阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化；
（4）将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用；
所述噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物和噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物的制备方法包括：取噻苯咪唑半抗原10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24h，即可得到反应液A；称取卵清蛋白或牛血清白蛋白50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用；
所述噻苯咪唑半抗原的制备方法包括如下步骤：取5-羟基噻苯咪唑220mg、邻苯二甲酸酐500mg和吡啶2mL在20mL二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯，其分子结构式为：
。
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