CN112939954A - 一种罗丹明b人工抗原和试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗丹明B人工抗原和试纸条及其制备方法与应用，涉及食品安全检测技术领域，本发明提供的罗丹明B半抗原完整的保留了原有结构中的羧基，与待测目标物的电子云密度保持高度一致，有效地提高了小分子半抗原的免疫原性。本发明中的罗丹明B人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为0.74μg/L。本发明中的罗丹明B人工抗原及单克隆抗体用于时间分辨荧光免疫层析试纸条，灵敏度可达0.5μg/L，并可快速、便捷地实现罗丹明B的定量检测，本发明中的时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，稳定性好。

Description

一种罗丹明B人工抗原和试纸条及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地说，它涉及一种罗丹明B人工抗原和试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
罗丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。由于其含有三苯甲烷类结构，具有潜在的致癌和致突变性，欧美等国家和地区从1993年起明令禁止其在食品加工中使用，我国卫生部也在2008年将其列入首批食品中可能违法添加的非食用物质名单之中。罗丹明B一般被用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色剂，不科学的使用会造成在食品中残留。
目前，国内外对食品中罗丹明B的常用检测方法有仪器法和免疫层析法。仪器法以高效液相色谱法(HPLC)、高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)为主。但由于仪器法的样品前处理复杂繁琐，需要精密昂贵的检测器和质谱等仪器设备，同时还要有专门的技术人员操作仪器，很难达到快速、便捷的现场检测要求，因此限制了其在许多检测机构尤其是基层检测部门的大规模推广使用。而免疫层析类产品多以胶体金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度差，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于罗丹明B及其抗原本身含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响；此外，现有罗丹明B人工抗原的合成均从其本身的羧基端作为活性手臂，偶联载体蛋白，使得制备的人工抗原无法完整的罗丹明B的结构，改变了目标物的电子云密度，降低了免疫原性。
因此，如何研究设计一种能避免颜色干扰、实现定量检测、提高人工抗原的免疫原性的罗丹明B人工抗原和试纸条及其制备方法与应用是我们目前急需解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种罗丹明B人工抗原和试纸条及其制备方法与应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
第一方面，提供了一种罗丹明B半抗原，所述半抗原的结构式如下：
Figure BDA0002921258520000021
第二方面，提供了一种罗丹明B人工抗原，所述人工抗原的结构式如下：
Figure BDA0002921258520000022
其中，protein为蛋白载体。
优选的，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
第三方面，提供了如第二方面所述的一种罗丹明B人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
S101：取如权利要求1所述的罗丹明B半抗原，溶解于二甲基甲酰胺DMF中，搅拌充分至完全溶解；
S102：称取蛋白载体后充分溶解在浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
S103：将步骤S102制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
S104：分装，于4℃保存备用。
第四方面，提供了一种罗丹明B单克隆抗体，所述单克隆抗体使用如第一方面所述的半抗原或如第二方面中任意一项所述的人工抗原制备得到。
第五方面，提供了如第二方面中任意一项所述的人工抗原与如第四方面中所述的单克隆抗体在ELISA检测中的应用。
第六方面，提供了如第二方面中任意一项所述的人工抗原与如第四方面中所述的单克隆抗体在时间分辨荧光免疫层析试纸条中的应用。
第七方面，提供了一种罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条，该试纸条中的反应膜包被有如第二方面中所述的人工抗原，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：
S201：制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：
将人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀后喷到反应膜的检测区，将兔IGg加到包被缓冲液中混合均匀后喷到反应膜的控制区，检测区和控制区相互分离，干燥处理后保存备用；
S202：样品垫的制备：
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
S203：时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：
在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜与吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免疫层析试纸条试纸条。
第八方面，提供了如第七方面中所述的一种罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条检测罗丹明B的方法，包括以下步骤：
S301：时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG的制备：
将时间分辨荧光微球活化后分别与如权利要求5所述的罗丹明B单克隆抗体、羊抗兔IgG偶联，离心除杂，加入荧光缓冲液重悬微球，得到时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG；
S302：时间分辨荧光检测液的制备：
将时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG稀释到同一荧光缓冲液，得到时间分辨荧光检测液；
S303：用PBS缓冲液配备系列浓度的罗丹明B标准溶液：
取时间分辨荧光检测液和标准溶液混匀后滴加到时间分辨荧光免疫层析试纸条的样品区，用时间分辨荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线，测定待测样品的T/C值，结合标准曲线实现罗丹明B的快速定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的罗丹明B半抗原完整的保留了待测目标物的羧基基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度几乎一致，有效的提高了小分子半抗原的免疫原性。
2、本发明提供的罗丹明B人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为0.74μg/L。
3、本发明提供的罗丹明B人工抗原及单克隆抗体用于时间分辨荧光免疫层析技术，可快速、便捷地实现罗丹明B的检测，避免了因抗原颜色引起的误判，本发明中制备的时间争辩荧光免疫层析试纸条对罗丹明B检测灵敏度为0.5μg/L，另外该荧光定量免疫层析试纸条稳定性好，可在室温下稳定保存一年以上，可满足市场在保存和运输过程中的要求。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1是本发明实施例3中ELISA测试不同浓度的罗丹明B标准溶液的OD值曲线图；
图2是本发明实施例4中荧光定量免疫层析试纸条的定量标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例1-4和附图1-2，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：罗丹明B人工抗原及其制备方法，其结构式为：
Figure BDA0002921258520000041
其中，protein为载体蛋白，载体蛋白选自牛血清白蛋白、血蓝蛋白中的任意一种。
1、该人工抗原的合成线路为：
Figure BDA0002921258520000042
2、载体蛋白为牛血清白蛋白的罗丹明B人工抗原的合成方法如下：
(1)取5mg罗丹明B半抗原，溶解于0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分至完全溶解；
(2)称取25mg牛血清蛋白(BSA)，使其充分溶解在2.5mL的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
3、载体蛋白为血蓝蛋白的罗丹明B人工抗原的合成方法如下：
(1)取2mg罗丹明B半抗原，溶解于0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分至完全溶解；
(2)称取8mg血蓝蛋白(KLH)，使其充分溶解在2mL的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
(4)分装，于4℃保存备用。
实施例2：罗丹明B人工抗原在制备抗罗丹明B单克隆抗体中的应用。
抗罗丹明B单克隆抗体的制备方法如下：
以上述载体蛋白为血蓝蛋白的罗丹明B人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为50～100μg，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
实施例3：罗丹明B人工抗原及抗罗丹明B单克隆抗体在ELISA中的应用与效果评价。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将载体蛋白为牛血清白蛋白的罗丹明B人工抗原稀释至0.2μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存备用。
向包被有罗丹明B人工抗原的微孔酶标板中加入罗丹明B标准溶液50μL/孔，再相应加入罗丹明B单克隆抗体溶液50μL/孔，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液300μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，分别加入50μL/孔的显色液A和显色液B，37℃反应15min；加入2M硫酸50μL/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的OD值。结果如表1所示。
ELISA测试不同浓度的罗丹明B标准溶液的OD值
Figure BDA0002921258520000061
通过表中数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线，如图1所示，罗丹明B的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.999，A＝2.63640，B＝1.15050，C＝0.79646，D＝-0.11658，x表示待测物浓度，y表示OD值，通过计算得到IC50值为0.74μg/L，在0.3～4.8μg/L呈线性关系。
实施例4：罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备及性能评价。
时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免罗丹明B及其抗原本身的本底荧光信号，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。
1、时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法。
(1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将兔IGg用包被缓冲液也调节浓度至0.1～1mg/mL，按照0.8～1.2μL/cm的膜液量，将抗原和兔IGg喷到反应膜对应的检测区和控制区，检测区和控制区之间间隔为5mm，放置37℃烘箱处理24h以上，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有2％蔗糖、0.5％海藻糖、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(2)样品垫的制备：
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(3)时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：
在PVC板背衬中部叠置步骤(1)制得的反应膜，两端分别叠置步骤(2)制得的样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免疫层析试纸条。
2、时间分辨荧光免疫层析试纸条的性能评价。
(1)时间分辨荧光微球标记的抗罗丹明B单克隆抗体的制备：取500μL时间争辩荧光微球溶液(微球固含量1％，即含微球5mg)，并用超声波处理；搅拌下分别加入5mg NHS和4mg DEC，控制反应液的温度为4～10℃，并在此温度下活化2h；活化完后，反应液在12000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL超纯水，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入0.5mL 0.01M PBS缓冲液；超声重悬后，室温下加入0.25mg罗丹明B单克隆抗体，并在室温下搅拌4～6h；偶联完成后，在反应液中加入55μL含有10％BSA的水溶液封闭1h；封闭完后，反应液在12000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入0.5mL荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2～8℃冰箱保存备用，所用荧光缓冲液为含有0.5％海藻糖、2％蔗糖、0.1％吐温20，1％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
同样的方法标记兔IgG，制备时间分辨荧光微球标记兔IgG标记液。
(2)时间分辨荧光检测液的制备：分别将上述时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和兔IgG用同一荧光缓冲液稀释100～1000倍成时间分辨荧光检测液，荧光缓冲液为含有0.5％海藻糖、2％蔗糖、0.1％吐温20，1％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液，然后置于2～8℃冰箱保存备用。
(3)用0.01M PBS缓冲液配备一系列不同浓度的罗丹明B的标准溶液，然后取上述制备的时间分辨荧光检测液50μL和50μL配制好的系列标准品溶液混合3min后，取80μL滴加到本发明中的时间分辨荧光免疫层析试纸条的样品区，10min后，用时间分辨荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值，检测试验设置3组重复。再通过系列标品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
(4)测定结果如表2所示：
表2使用荧光定量免疫层析试纸条与对应的罗丹明B标准液的测定结果
Figure BDA0002921258520000071
Figure BDA0002921258520000081
通过对罗丹明B系列标准液的T/C值进行了测定，并计算了B/B0(不同浓度的标准品测试卡T/C值与含量为0的标准品测试卡T/C值的比值)，结果如表2所示。从表2中可看出，当罗丹明B的标准液含量为0.5μg/L时，其B/B0值为75.55％，说明此浓度下检测的T/C值与含0μg/L浓度的罗丹明B标准液的测试卡T/C值有明显差异，故本发明制备的荧光定量免疫层析试纸条对罗丹明B检测灵敏度为0.5μg/L。
通过上表数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制荧光定量免疫层析试纸条的定量标准曲线，如图2所示，所得曲线的线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.999，A＝6.43228，B＝1.41007，C＝1.05362，D＝0.08975，线性方程中x表示待测物浓度，y表示T/C值。在时间分辨荧光免疫层析分析仪的定量曲线设置界面当中，分别将A，B，C，D的值录入荧光免疫层析分析仪的标定软件，即可实现时间分辨荧光免疫层析试纸条在时间分辨荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
3、时间分辨荧光免疫层析试纸条和时间分辨荧光检测液的稳定性测试。
荧光定量免疫层析试纸条保存的条件为室温，为了确保试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，分别在室温、50℃条件下连续放置50天，并在第3天，第6天，第12天，第24天和第50天分别检测荧光信号值，结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002921258520000082
由表3可知，在常温和50℃下密封保存的时间分辨荧光免疫层析试纸条50天后，试纸条的T/C值均无明显变化，说明时间分辨荧光免疫层析试纸条在加速实验50℃下最少可稳定保存50天。因此，本发明制备的罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种罗丹明B半抗原，其特征是，所述半抗原的结构式如下：
Figure FDA0002921258510000011
2.一种罗丹明B人工抗原，其特征是，所述人工抗原的结构式如下：
Figure FDA0002921258510000012
其中，protein为蛋白载体。
3.根据权利要求2所述的一种罗丹明B人工抗原，其特征是，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
4.如权利要求2或3所述的一种罗丹明B人工抗原的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
S101：取如权利要求1所述的罗丹明B半抗原，溶解于二甲基甲酰胺DMF中，搅拌充分至完全溶解；
S102：称取蛋白载体后充分溶解在浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
S103：将步骤S102制得的溶液用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
S104：分装，于4℃保存备用。
5.一种罗丹明B单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体使用如权利要求1所述的半抗原或如权利要求2～3中任意一项所述的人工抗原制备得到。
6.如权利要求2～3中任意一项所述的人工抗原与如权利要求5所述的单克隆抗体在ELISA检测中的应用。
7.如权利要求2～3中任意一项所述的人工抗原与如权利要求5所述的单克隆抗体在时间分辨荧光免疫层析试纸条中的应用。
8.一种罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征是，该试纸条中的反应膜包被有如权利要求2或3所述的人工抗原，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：
S201：制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：
将人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀后喷到反应膜的检测区，将兔IGg加到包被缓冲液中混合均匀后喷到反应膜的控制区，检测区和控制区相互分离，干燥处理后保存备用；
S202：样品垫的制备：
将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；
S203：时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：
在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜与吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免疫层析试纸条试纸条。
9.如权利要求8所述的一种罗丹明B时间分辨荧光免疫层析试纸条检测罗丹明B的方法，其特征是，包括以下步骤：
S301：时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG的制备：
将时间分辨荧光微球活化后分别与如权利要求5所述的罗丹明B单克隆抗体、羊抗兔IgG偶联，离心除杂，加入荧光缓冲液重悬微球，得到时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG；
S302：时间分辨荧光检测液的制备：
将时间分辨荧光微球标记的罗丹明B单克隆抗体和羊抗兔IgG稀释到同一荧光缓冲液，得到时间分辨荧光检测液；
S303：用PBS缓冲液配备系列浓度的罗丹明B标准溶液：
取时间分辨荧光检测液和标准溶液混匀后滴加到时间分辨荧光免疫层析试纸条的样品区，用时间分辨荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线，测定待测样品的T/C值，结合标准曲线实现罗丹明B的快速定量检测。
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