CN101671391A - 罗丹明b人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及罗丹明B人工抗原的制备方法及其应用。由于罗丹明B分子结构本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基团。本发明将罗丹明B分子直接以碳二亚胺为偶联剂，在N－羟基琥珀酰亚胺存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原。由于在最大程度上保持了其结构的稳定性，因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。
Description
一、技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及罗丹明B人工抗原的制备方法及其应用。
二、背景技术
罗丹明B(Rhodamine B)俗称玫瑰红，花粉红，是一种邻苯二酚类的碱性荧光染料，由于其具有很好的荧光性质，目前已广泛应用于环境监测、有色玻璃、特色烟花爆竹和生物学染色等领域。罗丹明B的结构如图一所示。
近些年来，实验研究表明：罗丹明B可以明显减少人纤维原细胞的数量，抑制其增殖；同时，它还可以抑制人血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。另外，经动物试验发现：罗丹明B能引起皮下组织生肉瘤，具有潜在的致癌和致突变能力。欧美等国家和地区从1993年起明令禁止其在食品加工中使用。我国卫生部也在2008年将其列入首批食品中可能违法添加的非食用物质名单之中。
但是由于其价廉易得、色泽鲜亮持久等特点，仍然有一些不法食品生产、加工商违规、违法使用罗丹明染料。这一方面给国家的食品安全带来了很大的隐患；另一方面，也给消费者的身心健康带来严重威胁。
目前，国内外对食品中罗丹明B的常用检测方法是高效液相色谱法(HPLC)、高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)。但是由于色谱法的样品前处理复杂繁琐，需要精密昂贵的检测器和质谱等仪器设备，同时还要有专门的技术人员操作仪器，很难达到快速、便捷的现场检测要求，因此限制了其在许多检测机构尤其是基层检测部门的大规模推广使用。
酶联免疫检测分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)由于具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近些年来备受人们的关注。免疫分析是以抗体作为生物检测器的分析技术，而罗丹明B作为小分子物质，分子量为479，是半抗原，本身不具有诱导产生抗体的能力，不能直接通过它免疫动物而得到检测所必须的抗体，因此，合成罗丹明B的人工抗原便成为建立其ELISA分析方法的首要步骤和关键所在。
从罗丹明B分子结构中可以看出：它本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基团。本发明将罗丹明B分子直接以碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原。
三、发明内容
本发明要解决的技术问题是：
本发明主要是利用罗丹明B分子结构本身含有的活性基团---羧基，为罗丹明B提供了一种人工抗原简单的制备方法。
本发明的技术方案是：
本发明所述的罗丹明B人工抗原为载体蛋白直接与罗丹明B分子中的羧基通过脱水缩合形成酰胺键而得，其结构如图1。将罗丹明B以碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原。
罗丹明B人工抗原的合成：
1、将罗丹明B(96mg，200uM)、DCC(41.2mg，200uM)、NHS(46mg，400uM)按1∶1∶2的摩尔比混合，溶解于400ul经无水处理的DMF中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液1000rpm，离心5分钟，后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃搅拌反应过夜；
3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4℃透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。
罗丹明B人工抗原作为免疫原来分别免疫雄性新西兰大白兔和雌性Balb/c小鼠，可分别制备出多克隆抗体和单克隆抗体，作为包被抗原可运用于免疫分析。
罗丹明B人工抗原的合成路线见图2。
本发明与已有技术相比其有益效果是：
目前所报道的罗丹明B人工抗原的制备方法中，主要是通过对罗丹明B的类似物---罗丹明123中的活性基团氨基进行修饰偶联而来。虽然罗丹明123与罗丹明B的结构相似，都具有苯环部分和羧基部分，但是与罗丹明B相比，罗丹明123结构中苯环上所连接的是氨基，而不是两个乙基，这样就导致了其空间结构在这一区域有着很大的不同；另一方面，由于罗丹明123结构中带有两个氨基而直接引起了两种物质带电情况具有很大的区别，这两方面的原因可能直接导致抗原决定簇的改变和抗原递呈细胞对罗丹明B的识别和递呈能力，最终导致产生的抗体具有很大的差异。本发明的优势在于我们根据罗丹明B自身带有活性基团这一特点，不改变它的结构，直接对其进行与载体的偶联反应，从而最大程度上保持了结构的稳定性，因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。
四、附图说明
图1罗丹明B结构式
图2罗丹明B人工抗原的合成路线图
图3A罗丹明B与载体蛋白BSA偶联物的紫外扫描图谱
图3B 罗丹明B与载体蛋白OVA偶联物的紫外扫描图谱
五、具体实施方式
实施例1罗丹明B---BSA偶联物
1、将罗丹明B 96mg，DCC 41.2mg，NHS 46mg按1∶1∶2的摩尔比混合，溶解于400ul经无水处理的DMF中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液1000rpm，离心5分钟，后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃搅拌反应过夜；
3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4℃透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。
实施例2罗丹明B---OVA偶联物
1、将罗丹明B 96mg，DCC 41.2mg，NHS 46mg按1∶1∶2的摩尔比混合，溶解于400ul经无水处理的DMF中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液1000rpm，离心5分钟，后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到已经冰浴的10uM的OVA溶液中，4℃搅拌反应过夜；
3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4℃透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。
实施例3罗丹明B---BSA和罗丹明B---OVA偶联物的鉴定
首先，采用紫外分光光度扫描的方法分别对罗丹明B--BSA和罗丹明B--OVA偶联物进行鉴定，根据其特征吸收峰的变化及其峰形鉴定是否偶联成功。罗丹明B标准品在560nm处有一强的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶联物在这两个波长下均有吸收，这是由于两种物质偶联后而引起的吸收峰叠加，表明两者偶联成功，进一步的使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术得出偶联比约为1∶6。
实施例4罗丹明---BSA偶联物免疫动物制备抗体
罗丹明B---BSA偶联物作为人工抗原首次使用弗氏完全佐剂，而后使用不完全佐剂来与其等量混合，乳浊液分别免疫3月龄，体重2.5kg左右的雄性新西兰大白兔和7到10周龄，体重18g左右的雌性Balb/c小鼠，可分别制备出高质量的多克隆抗体和单克隆抗体。
实施例5罗丹明B---OVA偶联物作为包被原用于ELISA的免疫分析
罗丹明B--OVA偶联物可以作为ELISA时的包被原来进行罗丹明B的免疫学检测，测定抗体效价和最佳免疫原包被浓度的步骤为：
1、照板：将聚苯乙烯微孔板置于紫外灯下照射6小时左右；
2、抗原包被：抗原浓度按1∶200，1∶400，1∶600，1∶800，1∶1000的梯度稀释(不同浓度可根据具体情况而定)，100ul/孔，4℃过夜；
3、洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
4、封闭：1％明胶封闭，200ul/孔，37℃放置2小时；
5、洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
6、样品检测：加入血清，稀释度一般为1∶1000，1∶10000，1∶20000，1∶50000，1∶100000(不同浓度可根据具体情况而定)，100μl/孔，同时做阴阳性对照，37℃放置2小时；
7、洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
8、二抗：二抗用PBST稀释，稀释度为1∶10000，100μl/孔，37℃放置1小时；
9、洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
10、显色：加入可溶性TMD底物，100μl/孔，37℃放置25分钟；
11、终止：加入2mol/L硫酸终止反应，50μl/孔；
12、读数：在测定波长为450nm，参比波长为650nm条件下测定吸光值。
判定滴度的方法：OD值≥1.0的最高稀释度即为该血清的滴度或OD值为阴性对照OD值的4倍的最高稀释度即为该血清的滴度。
抗体滴度对应的最高的抗原稀释倍数即为最佳抗原包被浓度。
Claims (6)
1、一种罗丹明B的人工抗原，其特征在于结构为：
其中，载体蛋白直接与罗丹明B分子中的羧基通过脱水缩合形成酰胺键而共价偶联。
2、根据权利要求1所述罗丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步骤为：
(1)将罗丹明B96mg、DCC 41.2mg、NHS 46mg按1∶1∶2的摩尔比混合，溶解于400ul经无水处理的DMF中，室温密封搅拌过夜；
(2)将混合液1000rpm，离心5分钟，后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃搅拌反应过夜；
(3)将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4℃透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
(4)透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。
3、根据权利要求2所述罗丹明B人工抗原合成方法，其特征是偶联剂为N，N-二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)。
4、根据权利要求2所述一种罗丹明B人工抗原合成方法，其特征在于载体蛋白可以为牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白或人血清白蛋白或兔血清白蛋白。
5、根据权利要求1所述罗丹明B人工抗原，其特征在于作为免疫原来分别免疫雄性新西兰大白兔和雌性Balb/c小鼠，可分别制备出多克隆抗体和单克隆抗体。
6、根据权利要求1所述一种罗丹明B人工抗原，其特征在于可作为包被原用于ELISA的免疫分析，步骤为：
(1)照板：将聚苯乙烯微孔板置于紫外灯下照射6小时左右；
(2)抗原包被：抗原浓度按1∶200，1∶400，1∶600，1∶800，1∶1000的梯度稀释，不同浓度可根据具体情况而定，100ul/孔，4℃过夜；
(3)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
(4)封闭：1％明胶封闭，200ul/孔，37℃放置2小时；
(5)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
(6)样品检测：加入血清，稀释度一般为1∶1000，1∶10000，1∶20000，1∶50000，1∶100000，不同浓度可根据具体情况而定，100μl/孔，同时做阳性对照，37℃放置2小时；
(7)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
(8)二抗：二抗用PBST稀释，稀释度为1∶10000，100μl/孔，37℃放置1小时；
(9)洗板：PBST洗涤，2分钟/次，洗5次；
(10)显色：加入可溶性TMD底物，100μl/孔，37℃放置25分钟；
(11)终止：加入2mol/L硫酸终止反应，50μl/well；
(12)读数：在测定波长为450nm，参比波长为650nm条件下测定吸光值。
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