CN103951630B - 一种直接检测呋喃它酮代谢物amoz的树状半抗原、树状抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原、树状抗原及其应用。树状半抗原是将AMOZ的乙醛酸衍生物偶联在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，基于该树状半抗原制备人工抗原，再以人工抗原制备抗体。通过本发明的人工抗原能够获得直接针对AMOZ的高质量抗体，抗体的效价为1:64000，基于该抗体所建立的化学发光酶联免疫分析方法（CLEIA）对AMOZ的最低检测限为0.112？ng/mL，半抑制浓度为15.26？ng/mL，可以直接用于AMOZ的检测，克服了传统方案的AMOZ半抗原、人工抗原制备出的抗体特异性差，不能直接识别AMOZ本身的缺点。本发明的树状半抗原、人工抗原及抗体在食品中AMOZ的残留检测上具有广泛的应用前景，同时该半抗原的制备思路可以为其他类似的小分子化合物的半抗原设计提供借鉴。
Description
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原、树状抗原及其应用。
背景技术
硝基呋喃类抗生素具有杀菌能力强、抗菌谱广、价格低廉等优点，被广泛应用于临床和动物养殖业。近年来研究表明硝基呋喃类药物及其代谢物对人类具有很大毒性，欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，又在1997年将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物，我国亦于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。由于硝基呋喃类药物代谢速度很快，在生物体内数小时便可降解，而代谢产物可与细胞膜蛋白结合形成稳定结合物，长期存在于生物体内，因而目前对硝基呋喃类药物残留的检测主要集中在对其代谢物含量的测定。3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮（AMOZ）是抗生素呋喃它酮的代谢产物，具有潜在致畸、致癌性，作为非法使用硝基呋喃类抗生素的一种指示物，建立其快速、简单、廉价、有效的检测方法十分必要。
目前国内外检测AMOZ的方法主要有色谱方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。前两种属于仪器分析检测技术，存在着周期长、专业性强、费用高等不足，难以适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析方法具有快速、灵敏、准确等优点，特别适用于现场进行高通量筛选实验。但是，大量实践证明：当化合物（半抗原）的分子量<300Da时，其高特异性高亲和力的抗体制备难度增大。AMOZ分子量很小（201.22Da），即使将其与载体蛋白偶联，其高特异性高亲和力抗体的制备难度也相对很大，因而，目前报道的免疫检测方法在检测之前大都需对AMOZ进行衍生化处理作间接检测，存在着前处理操作复杂繁琐、成本高及回收率偏低等不足，限制了其应用，并且，该类免疫检测方法大多停留在酶联免疫吸附分析（ELISA）上，灵敏度较低。
目前，研究报道的能够对AMOZ进行直接检测的免疫检测方法相对很少。2009年，Pimpitak等人报道了一种检测强化虾样品中AMOZ残留量的方法。他们将AMOZ与3-羧酸苯甲醛衍生化制备免疫半抗原CPAMOZ，通过抗原制备、动物免疫以及单克隆抗体制备获得单克隆抗体，该抗体虽然能够识别AMOZ，但是识别灵敏度低，比其对半抗原CPAMOZ的灵敏度低23倍。基于该抗体他们建立了间接检测AMOZ的免疫分析方法，即在检测前对其进行衍生化（将AMOZ与2-硝基苯甲醛衍生化为NPAMOZ），衍生化的时间需要十多个小时，十分费时。2012年，Yan等人报道了一种直接检测肉类中AMOZ残留量的免疫分析方法。他们将呋喃环上的硝基氨基化了的呋喃它酮作为免疫半抗原与载体蛋白通过戊二醛偶联制备免疫原，通过动物免疫获得了可以特异性识别AMOZ的多克隆抗体，基于该抗体建立了直接检测肉类中AMOZ残留量的ELISA方法，检测限为0.4ng/g，可用于AMOZ残留量的测定。但是，上述两种方案制备的抗体对AMOZ的父本呋喃它酮均存在严重的交叉现象，并且对呋喃它酮的特异性识别能力要远高于对AMOZ的识别（交叉反应率分别为338%和289%），易导致样品检测结果的假阳性。
在建立小分子化合物免疫分析方法的过程中，半抗原的设计合成是首要并且是关键步骤，半抗原的优劣直接影响到获得的抗体质量。目前采用常规的半抗原制备方案获得的AMOZ抗体均存在特异性差、亲和力低的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服传统的AMOZ免疫分析技术中均需对其进行衍生化处理的缺陷，提供一种可以用于对呋喃它酮代谢物AMOZ进行直接检测的树状半抗原、人工树状抗原。
本发明的第二个目的是提供所述AMOZ树状半抗原、人工树状抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种可以对AMOZ进行直接快速检测的免疫分析方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种AMOZ树状半抗原，是通过将AMOZ的乙醛酸衍生物偶联在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到的。所述AMOZ的乙醛酸衍生物具有式（Ⅰ）所示分子结构：
。
所述四分支聚酰胺-胺具有式（Ⅱ）所示分子结构：
。
所述AMOZ树状半抗原具有式（Ⅲ）所示分子结构：
。
本发明提供了所述AMOZ的乙醛酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：将AMOZ和乙醛酸分别溶于无水乙醇中，再在搅拌状态下将乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ中，室温搅拌过夜。AMOZ和乙醛酸的摩尔比为1:1.2。反应结束，真空抽滤，依次用乙醇和乙醚洗涤滤饼，得具有式（Ⅰ）所示分子结构的AMOZ的乙醛酸衍生物。
本发明提供了所述四分支聚酰胺-胺的制备方法，包括如下步骤：乙二胺与丙烯酸甲酯作为原料，反应遵循Michael加成和酰胺化缩合反应。以乙二胺为核，一端氨基用叔丁氧羰基（Boc）保护，与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得到Boc-Eddp-OCH3；将乙二胺的一端氨基用芴甲氧羰酰基（Fmoc）保护，将Boc-Eddp-OCH3与过量Fmoc保护的乙二胺进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2，去Boc保护得到H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2；将H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2进一步与Boc-Eddp-OCH3进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(Fmoc-Ethylenediamine)4，去Fmoc保护得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(Ethylenediamine)4，即左侧氨基用Boc保护了的式（Ⅱ）所示分子结构的四分支聚酰胺-胺。
本发明提供了所述AMOZ树状半抗原的制备方法，包括如下步骤：将Boc-Eddp-(Eddp)2-(Ethylenediamine)4与过量AMOZ的乙醛酸衍生物（Ⅰ）进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(AMOZ-2-iminoacetyl-Ethylenediamine)4，脱去Boc氨基保护基，得到Eddp-(Eddp)2-(AMOZ-2-iminoacetyl-Ethylenediamine)4，即式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ树状半抗原。
一种AMOZ人工树状抗原，所述AMOZ人工树状抗原具有式（Ⅴ）所示分子结构；
本发明所述人工树状抗原的制备技术方案：采用戊二醛偶联法将上述具有式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ树状半抗原与载体蛋白偶联制备如上所述具有式（Ⅴ）所示分子结构的AMOZ免疫原。
更优选地，所述人工树状抗原的制备方法为：将具有式(Ⅲ)所示分子结构的适量AMOZ树状半抗原溶于适量PBS缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中，与适量10mg/mL的载体蛋白PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量2.5%的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次。所述AMOZ树状半抗原与载体蛋白的摩尔比为60:1。
优选地，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。
本发明同时提供所述AMOZ特异性单克隆抗体和多克隆抗体，以及所述AMOZ人工抗原和特异性抗体在AMOZ免疫检测方面的应用。
一种AMOZ包被半抗原，所述AMOZ包被半抗原具有式（Ⅳ）所示分子结构：
本发明提供了所述AMOZ包被半抗原的制备方法，包括如下步骤：将AMOZ和顺丁烯二酸酐分别溶于无水乙醇中，再在搅拌状态下将顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ中，室温搅拌过夜。AMOZ和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：1.2。反应结束，真空抽滤，依次用乙醇和乙醚洗涤滤饼，得具有式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ包被半抗原。
一种AMOZ人工包被抗原，所述人工包被抗原具有式（Ⅵ）所示分子结构：
本发明所述人工包被抗原的制备技术方案：采用活泼酯偶联法将上述具有式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ包被半抗原与载体蛋白偶联制备得到如上所述具有式（Ⅵ）所示分子结构的AMOZ包被原。
更优选地，所述人工包被抗原的制备技术方案为：将具有式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ包被半抗原溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清；搅拌过程中，将上清液逐滴滴加到10mg/mL载体蛋白的PBS缓冲溶液中，4℃下磁力搅拌反应12h；离心后取上清。4℃下用生理盐水透析3天得目标产物，每天更换透析液2次。所述AMOZ包被半抗原与载体蛋白的摩尔比为60:1。
一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫分析方法，包括如下步骤：
S1.将权利要求3具有式（Ⅴ）所示分子结构的AMOZ人工抗原免疫动物制备AMOZ的多克隆抗体；
S2将具有式（Ⅵ）所示分子结构人工包被抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到的AMOZ的多克隆抗体加入微孔板中；
S3.采用竞争ELISA测定待测样品中AMOZ的含量。
本发明的有益效果是：
基于传统方案的AMOZ半抗原、抗原制备获得的抗体均存在特异性差、亲和力低等不足，不能对AMOZ进行直接快速检测。本发明提供了一种新型AMOZ树状半抗原，以及基于该树状半抗原制备的一种人工抗原，阐述了两者的制备方法与应用。其思路是将AMOZ衍生化，获得具有活性基团和双键刚性支撑手臂的衍生物，同时为了增强半抗原的免疫原性制备出高质量的抗体，本发明将其偶联于四分支的聚酰胺-胺的活性氨基末端制备得到树状半抗原，将该树状半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，进而进行动物免疫获得特异性抗体。该抗体可以特异性识别AMOZ本身，进而对AMOZ进行直接检测，无需衍生化。该思路的有益效果体现在：（1）引入具有刚性支撑作用的双键手臂，使得AMOZ的结构特征明显增强，利于决定簇的良好呈现；（2）制备树状半抗原，增大了半抗原与载体蛋白的偶联比，使得小分子半抗原的免疫原性明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；（3）本发明提供的AMOZ的快速检测方法最低检测限可达到0.112ng/mL。
附图说明
图1.AMOZ树状半抗原HⅢESI-MS图谱。
图2.AMOZ树状半抗原HⅢUPLC图谱。
图2.AMOZ树状半抗原HⅢ及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图谱。
图3.AMOZ包被半抗原HⅣ及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图谱。
图4.以人工抗原Ⅴ为免疫原制备的抗体、人工抗原Ⅵ为包被原建立的对AMOZ的抑制曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本技术领域常规的试剂、方法和仪器。
实施例1AMOZ乙醛酸衍生物Ⅰ的制备：
取604mg（3mmol）AMOZ、266.5mg（3.6mmol）乙醛酸分别溶于2mL无水乙醇中，搅拌过程中将乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，室温搅拌反应过夜。反应结束，真空抽滤，依次用2mL乙醇和乙醚洗涤滤饼2次，取沉淀，得到白色固体目标物540.2mg，产率为70%。ESI-MSanalysis(positive)m/z258.7[M+H]+;1HNMR(600MHz,d5-Pyridine,TMS):δ7.56(s,1H),4.99-4.97(m,1H),4.16(t,J=8.8Hz,1H),3.79(dd,J1=6.7,J2=8.8,1H),3.68-3.64(m,4H),2.66(dd,J1=6.1,J2=13.5,1H),2.62(dd,J1=5.5,J2=13.4,1H),2.51-2.46(m,4H)。AMOZ乙醛酸衍生物Ⅰ的结构式如式（Ⅰ）所示。
实施例2四分支聚酰胺-胺Ⅱ的制备方法
乙二胺与丙烯酸甲酯作为原料，反应遵循Michael加成和酰胺化缩合反应。以乙二胺为核，一端氨基用叔丁氧羰基（Boc）保护，与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得到Boc-Eddp-OCH3；将乙二胺的一端氨基用芴甲氧羰酰基（Fmoc）保护，将Boc-Eddp-OCH3与过量Fmoc保护的乙二胺进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2，去Boc保护得到H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2；将H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2进一步与Boc-Eddp-OCH3进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(Fmoc-Ethylenediamine)4，去Fmoc保护得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(Ethylenediamine)4，即左侧氨基用Boc保护了的四分支聚酰胺-胺。四分支聚酰胺-胺Ⅱ的结构式如式（Ⅱ）所示。
实施例3AMOZ树状半抗原HⅢ的制备方法
将实施例2制备得到的四分支聚酰胺-胺与过量实施例1制备得到的AMOZ的乙醛酸衍生物进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(AMOZ-2-iminoacetyl-Ethylenediamine)4，脱去Boc氨基保护基，得到Eddp-(Eddp)2-(AMOZ-2-iminoacetyl-Ethylenediamine)4，即目标物AMOZ树状半抗原HⅢ。ESI-MS鉴定结构，HPLC判定纯度。AMOZ树状半抗原HⅢ的结构式如式（Ⅲ）所示。
实施例4AMOZ包被半抗原HⅣ的制备方法
取604mg（3mmol）AMOZ、353mg（3.6mmol）顺丁烯二酸酐分别溶于2mL无水乙醇中，搅拌过程中将顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，室温搅拌反应过夜。反应结束，真空抽滤，依次用2mL乙醇和乙醚洗涤滤饼2次，取沉淀，得到白色固体目标物HⅣ566mg，产率为63%。ESI-MSanalysis(negative)m/z298.6[M-H]-;1HNMR(500MHz,d6-DMSO,TMS):δ6.32(d,J=2.9Hz,2H),4.86–4.78(m,1H),3.74(t,J=8.1Hz,2H),3.58(s,J=4.6Hz,4H),3.43(t,J=7.7Hz,1H)。AMOZ包被半抗原HⅣ具有式（Ⅳ）所示分子结构。
实施例5免疫原/包被原的制备
免疫原与包被原的制备不同之处在于半抗原的结构和载体蛋白种类，所述免疫原采用实施例3制备的树状半抗原HⅢ，载体蛋白采用牛血清蛋白（BSA）；所述包被原采用实施例4制备的AMOZ包被半抗原HⅣ，载体蛋白采用卵清蛋白（OVA）。
免疫原的制备方法。戊二醛偶联法：取树状半抗原HⅢ14.3mg（0.008mmol），溶于1mLPBS缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中，与1mL10mg/mL的载体蛋白PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入100μL2.5%的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次。得到免疫原HⅢ—BSA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
包被原的制备方法。活泼酯偶联法：AMOZ包被半抗原HⅣ15mg（0.05mmol），溶于1.5mL二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入24.8mg（0.12mmol）1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和13.8mg（0.12mmol）N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清为A液。称取载体蛋白OVA20mg溶于5mLPBS溶液（0.1mol/L，pH7.4）中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，吸取A液1.329mL逐滴滴加到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后，取上清液，4℃下PBS透析3d，每天早晚2次更换透析液。得到包被原HⅣ-OVA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
对载体蛋白、树状半抗原HⅢ、AMOZ包被半抗原HⅣ及其相应的免疫原HⅢ-BSA和包被原HⅣ-OVA进行紫外扫描鉴定（220nm~350nm），发现免疫原Ⅲ-BSA和包被原HⅣ-OVA同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰（见图2和图3），说明免疫原和包被原偶联成功。
实施例6抗体的制备及鉴定
将实施例5制备的免疫原Ⅲ—BSA与等剂量的免疫佐剂（第1次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂）混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6只体重为2.5~3kg的健康新西兰大白兔。第一次免疫间隔一个月后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争CLEIA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5~1h，于4℃、12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存备用。
间接竞争CLEIA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，结果表明式（Ⅲ）所示的树状半抗原HⅢ对应的抗血清（Ab-HⅢ）效价为1：64000。
实施例7抗体的特异性及灵敏度
依据如上效果，使用抗血清（Ab-HⅢ）建立CLEIA标准曲线；使用磷酸盐吐温缓冲溶液PBS（0.01mol/L，pH6.4）作为所有样品的稀释液；使用HⅣ—OVA作为包被原；将50μL系列浓度的药物标准品和50μL适当稀释倍数的AMOZ特异性多克隆抗体加入到96孔酶标板中，竞争反应后通过化学发光分析仪测定发光值（RLU）。以RLU值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro7.5软件四参数对数函数进行曲线拟合：
y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D（1）
其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大时的发光值；C为中点标准品浓度，当标准品浓度等于C时的RLU值为（A+D）/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50；B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC10为检测限，以IC20~IC80为检测范围。以标准品AMOZ建立CLEIA的标准曲线，结果如图3，相关标准曲线参数见表1。结合附图及附表可知，以AMOZ标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度较好，因此该方法可以用于直接检测食品中AMOZ的含量。
表1抗血清（Ab-HⅢ）对AMOZ的检测参数
| 免疫原 | IC50（ng/mL） | 线性范围（ng/mL） | 最低检测限（ng/mL） | 相关系数R2 |
| HⅢ-BSA | 15.26 | 2.47~94.21 | 0.112 | 0.997 |
表2抗血清（Ab-HⅢ）对AMOZ及其结构类似物的交叉反应率
| 竞争物 | 交叉反应率（%） |
| AMOZ | 100 |
| AOZ | <0.1 |
| AHD | <0.1 |
| SEM | <0.1 |
| 盐酸呋喃它酮(原药) | 165.3 |
| 呋喃唑酮 | <0.1 |
| 呋喃妥因 | <0.1 |
| 呋喃西林 | <0.1 |
Claims (7)
1.一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原，其特征在于，所述树状半抗原是将AMOZ的乙醛酸衍生物偶联在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，树状半抗原的结构如式（Ⅲ）所示：
。
2.权利要求1所述用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备AMOZ的乙醛酸衍生物：将AMOZ和乙醛酸分别溶于无水乙醇中，搅拌条件下将乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ乙醇溶液中，搅拌过夜；AMOZ和乙醛酸的摩尔比为1：1.2，反应结束，真空抽滤，依次用乙醇和乙醚洗涤，得具有式（Ⅰ）所示分子结构的AMOZ的乙醛酸衍生物；
；
S2.制备左侧氨基用Boc保护了的四分支聚酰胺-胺：乙二胺与丙烯酸甲酯作为原料，反应遵循Michael加成和酰胺化缩合反应，以乙二胺为核，一端氨基用叔丁氧羰基保护，与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得到Boc-Eddp-OCH3；将乙二胺的一端氨基用芴甲氧羰酰基保护，将Boc-Eddp-OCH3与过量Fmoc保护的乙二胺进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2，去Boc保护得到H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2；将H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine)2进一步与Boc-Eddp-OCH3进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(Fmoc-Ethylenediamine)4，去Fmoc保护得到左侧氨基用Boc保护了的四分支聚酰胺-胺；
S3.将左侧氨基用Boc保护了的四分支聚酰胺-胺与过量AMOZ的乙醛酸衍生物进行酰胺化缩合反应，得到Boc-Eddp-(Eddp)2-(AMOZ-2-iminoacetyl-Ethylenediamine)4，脱去Boc氨基保护基，得到式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ树状半抗原。
3.一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的人工树状抗原，其特征在于，具有式（Ⅴ）所示分子结构：
。
4.权利要求3所述用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的人工树状抗原的制备方法，其特征在于，采用戊二醛偶联法将权利要求1中所述具有式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ树状半抗原与载体蛋白偶联制备得到；具体包括如下步骤：将具有式(Ⅲ)所示分子结构的AMOZ树状半抗原溶于PBS缓冲溶液中，与含有10mg/mL载体蛋白的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量2.5%的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次；所述AMOZ树状半抗原与载体蛋白的摩尔比为60:1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清蛋白、匙孔血蓝蛋白或卵清蛋白。
6.权利要求3所述AMOZ的人工树状抗原在制备AMOZ抗体或在检测AMOZ中的应用。
7.一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将权利要求3具有式（Ⅴ）所示分子结构的AMOZ人工抗原免疫动物制备AMOZ的多克隆抗体；
S2将具有式（Ⅵ）所示分子结构人工包被抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到的AMOZ的多克隆抗体加入微孔板中；
S3.采用竞争CLEIA测定待测样品中AMOZ的含量。
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