CN103554056A - 一种吩噻嗪类药物的半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种吩噻嗪类药物的半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吩噻嗪类药物的半抗原、人工抗原和单克隆抗体及其制备方法与应用，该半抗原含有吩噻嗪类药物的共有结构部分，并且在所述吩噻嗪类药物人工抗原的制备过程中，利用了引入的羧基与载体蛋白连接，也就是使该共有结构部分远离载体蛋白，充分暴露给动物的免疫识别系统。因此，以该人工抗原作为免疫原免疫动物，可以获得能同时识别多种吩噻嗪类药物的广谱特异性抗体，用于快速免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。

Description

一种吩噻嗪类药物的半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种吩噻嗪类药物的族特异性半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
吩噻嗪类药物作为一类镇静剂主要用于缓解动物异常躁动，达到镇静、化学保定和配合麻醉等目的，此类药物的常见品种有氯丙嗪、异丙嗪、乙酰丙嗪、奋乃静、氟奋乃静、硫利达嗪。近些年，一些不法饲料商或养殖者为了追求饲料的高转化率和高额利润，在饲料中随意添加吩噻嗪类药物，以减少动物的活动量，从而起到催肥作用。在动物运输过程中使用，可降低动物的维持需要和减少途中失重、死亡率。但这类药物在动物体内代谢缓慢，在体内的残留时间可达2-3个月。它们在畜牧养殖业中的滥用, 不仅会引起动物的中毒，还会通过在动物性食品(肉、奶、蛋等)中的残留直接危害到消费者身体健康。所以，中国农业部规定此类药物不得以抗应激和促生长为目的在养殖业中使用，且在动物性产品中不得检出。因此，必须要对动物性食品中可能残留的吩噻嗪类药物进行监控，以保证动物性食品安全和消费者健康。
目前，对动物性食品中吩噻嗪类药物的残留检测主要采用高效液相色谱法、液-质联用法、气相色谱法等仪器检测方法。但是仪器分析法操作复杂，样品前处理过程繁琐，需要专业技术人员，耗费时间长，无法对大批次产品进行检测，且成本较高，不适宜进行推广普及。而免疫分析法，是现在兽药残留检测的重要方法，其方便，快捷，可应用于大批量样品的筛选，宜于推广普及。免疫分析法的核心试剂是抗体。到目前为止，国内外虽有针对此类药物的抗体制备研究，但结果均不能满足多残留检测的目的。1978年，Hubbard 等用不同的方法合成了吩噻嗪类药物中氯丙嗪的 3 种半抗原：（7-(3-羰基丙酰)氯丙嗪、N-(3-羰基丙酰) 氯丙嗪、N-( 2-羰基乙酯)去甲基氯丙嗪），制备的多克隆抗体与氯丙嗪有100%交叉反应率，但与其他吩噻嗪类药物没有交叉反应性。1979年，Midha等合成了氯丙嗪的半抗原 N-(2-羰基乙酯)去甲基氯丙嗪，制备的多克隆抗体与氯丙嗪交叉反应率为 100%，但与其他吩噻嗪类药物没有交叉反应性。2010年，Liu等以乙酰丙嗪为基础合成半抗原，制备了单克隆抗体，该抗体与氯丙嗪交叉反应率为 100%，但对其他吩噻嗪类药物的交叉反应率极低（≤1%）。2011，Shen等合成了氯丙嗪的半抗原7-氨基氯丙嗪，制备了针对氯丙嗪的多克隆抗体，该抗体与氯丙嗪交叉反应率为 100%，对其他吩噻嗪类药物没有交叉反应。因此，目前已有的各种抗体均是以氯丙嗪或乙酰丙嗪为模板合成半抗原，制备的抗体不能同时识别其他吩噻嗪类药物，当然也就不能用于多残留免疫检测多种吩噻嗪类药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种吩噻嗪类药物的半抗原及相应的人工抗原、抗体。
本发明的再一个目的是提供一种吩噻嗪类药物的半抗原及相应的人工抗原、抗体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种吩噻嗪类药物的族特异性半抗原及相应的人工抗原、抗体的应用。
 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：  一种吩噻嗪类药物的半抗原，其分子结构式如式1所示：
                                                            
Figure 188580DEST_PATH_IMAGE001
。
上述吩噻嗪类药物的半抗原的制备方法，包括如下步骤，以下按物质的量计：
（a）将1份2-氯吩噻嗪溶于四氢呋喃中，搅拌下加入1~5份的氢化钠，搅拌反应10~30分钟；
（b）向上述反应体系中加入1~2份的溴乙酸钠，加热至回流，反应6~12小时后停止加热并降至室温；
（c）向上述反应体系中加入5~10份的氢化钠，回流反应8~12小时后停止反应并降至室温；
（d）向上述反应体系中加入无水乙醇除去过量的氢化钠，减压抽滤，所得滤液在旋转蒸发器上蒸干，得固体，将所得固体在乙醇中酸化后采用柱层析法分离得式1所示化合物。
一种吩噻嗪类药物的人工抗原，由吩噻嗪类药物的半抗原与载体蛋白偶联而成，其分子结构式如式2所示：
Figure 168037DEST_PATH_IMAGE002
所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
上述吩噻嗪类药物的人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
（a）将0.1mmol的吩噻嗪类药物半抗原溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20μL三乙胺和0.1~0.5mmol氯甲酸异丁酯，4~10℃搅拌反应1~2小时，得A液；
（b）将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液；
（c）将A液滴加到B液中，4~10℃搅拌反应10~12小时，得到含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液；
（d）将上述含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液在4~20℃用PBS透析3~4天，然后将透析袋中的溶液在无菌条件下用滤径为0.2um的滤膜过滤，得到吩噻嗪类药物的人工抗原。
 一种吩噻嗪类药物的单克隆抗体，是能与权利要求3所述的吩噻嗪类药物的人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
上述吩噻嗪类药物的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体用于吩噻嗪类药物的免疫检测。
 所述免疫检测为间接竞争酶联免疫吸附法。
本发明的有益效果是：以含有吩噻嗪类药物共有结构母核吩噻嗪环的药物中间体2-氯吩噻嗪为模板合成了此类药物的族特异性半抗原，进而以该半抗原中的羧基为连接位点将半抗原与载体蛋白偶联制备了人工抗原，这样就将吩噻嗪类药物的共有结构母核暴露给动物免疫系统。因此，在此基础上所制得的单克隆抗体能同时识别含有这一共有结构母核的吩噻嗪类药物，如氯丙嗪、异丙嗪、乙酰丙嗪、奋乃静、氟奋乃静、硫利达嗪等。该单克隆抗体可用于研究开发吩噻嗪类药物的多残留免疫检测方法和产品，为实现吩噻嗪类药物残留的现场快速检测奠定了基础。
附图说明
图1中PZ为2-氯吩噻嗪的紫外吸收曲线，PZD为吩噻嗪类族特异性半抗原的紫外吸收曲线，BSA为牛血清白蛋白的紫外吸收曲线，PZD-BSA为吩噻嗪类族特异性人工抗原的紫外吸收曲线。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
 实施例1：式1结构的吩噻嗪类药物的族特异性半抗原的合成
实验1：
（a）在三口瓶中加入4mmol 2-氯吩噻嗪并溶于20 mL四氢呋喃中，搅拌下加入20mmol的氢化钠，搅拌反应10分钟；
（b）向上述三口瓶中加入4mmol溴乙酸钠，加热至回流，反应6小时后停止加热并降至室温；
（c）向上述三口瓶中加入40mmol氢化钠，回流反应8小时后停止反应并降至室温；
（d）向上述三口瓶中加入无水乙醇除去过量氢化钠，减压抽滤，所得滤液在旋转蒸发器上蒸干，得固体，将所得固体在乙醇中酸化后采用柱层析法分离得式1所示化合物。该化合物的表征数据：熔点99-100℃,1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 4.08 (s, 2H, CH2), 7.20~7.12 (m, 7H, ArH) , 10.10 (s, 1H, COOH). Anal. Calcd for C14H10ClNO2S: C, 57.63; H, 3.45; N, 4.80. Found: C, 57.62; H, 3.46; N, 4.82. 氢谱在Bruker AVANCE 600 (600 MHz)核磁共振仪上测得，元素分析数据在Exeter Analytical CE-440元素分析仪上测得。
实验2：
（a）在三口瓶中加入4mmol 2-氯吩噻嗪并溶于20 mL四氢呋喃中，搅拌下加入4mmol的氢化钠，搅拌反应30分钟；
（b）向上述三口瓶中加入8mmol溴乙酸钠，加热至回流，反应12小时后停止加热并降至室温；
（c）向上述三口瓶中加入20mmol氢化钠，回流反应12小时后停止反应并降至室温；
（d）向上述三口瓶中加入无水乙醇除去过量氢化钠，减压抽滤，所得滤液在旋转蒸发器上蒸干，得固体，将所得固体在乙醇中酸化后采用柱层析法分离得式1所示化合物。该化合物的表征数据：熔点99-100℃,1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 4.08 (s, 2H, CH2), 7.20~7.12 (m, 7H, ArH) , 10.10 (s, 1H, COOH). Anal. Calcd for C14H10ClNO2S: C, 57.63; H, 3.45; N, 4.80. Found: C, 57.62; H, 3.46; N, 4.82. 氢谱在Bruker AVANCE 600 (600 MHz)核磁共振仪上测得，元素分析数据在Exeter Analytical CE-440元素分析仪上测得。
实验3：
（a）在三口瓶中加入4mmol 2-氯吩噻嗪并溶于20 mL四氢呋喃中，搅拌下加入10mmol的氢化钠，搅拌反应20分钟；
（b）向上述三口瓶中加入6mmol溴乙酸钠，加热至回流，反应10小时后停止加热并降至室温；
（c）向上述三口瓶中加入30mmol氢化钠，回流反应10小时后停止反应并降至室温；
（d）向上述三口瓶中加入无水乙醇除去过量氢化钠，减压抽滤，所得滤液在旋转蒸发器上蒸干，得固体，将所得固体在乙醇中酸化后采用柱层析法分离得式1所示化合物。该化合物的表征数据：熔点99-100℃,1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 4.08 (s, 2H, CH2), 7.20~7.12 (m, 7H, ArH) , 10.10 (s, 1H, COOH). Anal. Calcd for C14H10ClNO2S: C, 57.63; H, 3.45; N, 4.80. Found: C, 57.62; H, 3.46; N, 4.82. 氢谱在Bruker AVANCE 600 (600 MHz)核磁共振仪上测得，元素分析数据在Exeter Analytical CE-440元素分析仪上测得。
实施例2：式2结构的吩噻嗪类药物的族特异性人工抗原合成
实验1：
（a）将0.1mmol的吩噻嗪类药物半抗原溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20μL三乙胺和0.1mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应2小时，得A液；
（b）将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液；
（c）将A液滴加到B液中，4℃搅拌反应12小时，得到含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液；
（d）将上述含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液在4℃用PBS透析3天，将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用虑径为0.2um的滤膜过滤，得到如式2所示吩噻嗪类药物的人工抗原，分装与安瓿瓶中，-20℃保存。该化合物的表征：吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白都有各自的特征紫外吸收图谱，通过对人工抗原进行紫外全波长扫描，发现其含有吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白的双重特征，通过紫外吸收光谱的叠加原理证明吩噻嗪类药物的人工抗原合成成功，参见附图1。
实验2：
（a）将0.1mmol的吩噻嗪类药物半抗原溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20μL三乙胺和0.5mmol氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应1小时，得A液；
（b）将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液；
（c）将A液滴加到B液中，10℃搅拌反应10小时，得到含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液；
（d）将上述含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液在20℃用PBS透析4天，将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用虑径为0.2um的滤膜过滤，得到如式2所示吩噻嗪类药物的人工抗原，分装与安瓿瓶中，-20℃保存。该化合物的表征：吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白都有各自的特征紫外吸收图谱，通过对人工抗原进行紫外全波长扫描，发现其含有吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白的双重特征，通过紫外吸收光谱的叠加原理证明吩噻嗪类药物的人工抗原合成成功，参见附图1。
实验3：
（a）将0.1mmol的吩噻嗪类药物半抗原溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20μL三乙胺和0.3mmol氯甲酸异丁酯，8℃搅拌反应1.5小时，得A液；
（b）将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液；
（c）将A液滴加到B液中，8℃搅拌反应11小时，得到含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液；
（d）将上述含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液在15℃用PBS透析3.5天，将所得透析袋中的溶液在无菌条件下用虑径为0.2um的滤膜过滤，得到如式2所示吩噻嗪类药物的人工抗原，分装与安瓿瓶中，-20℃保存。该化合物的表征：吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白都有各自的特征紫外吸收图谱，通过对人工抗原进行紫外全波长扫描，发现其含有吩噻嗪类药物半抗原和载体蛋白的双重特征，通过紫外吸收光谱的叠加原理证明吩噻嗪类药物的人工抗原合成成功，参见附图1。
 实施例3: 单克隆抗体的制备
（a）以上述实施例中制备的吩噻嗪类药物人工抗原作为免疫原，分别免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射。间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次；
（b）最后一次免疫后7天，选取上述步骤(a)每组中血清效价最高的小鼠脱颈椎处死。无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10：1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。用2-氯吩噻嗪为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞。然后采用有限稀释法获得分泌抗2-氯吩噻嗪单克隆抗体的单株杂交瘤细胞；
（c）将上述步骤（b）中获得的单株杂交瘤细胞扩大培养，注射到空白小鼠的腹腔中，每只小鼠1×106-2×106个杂交瘤细胞。两周后，采集小鼠的腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行提纯，获得针对2-氯吩噻嗪的单克隆抗体。
 实施例4：单克隆抗体的性能测定
（a）抗血清最低检测限（LOD值）和半数抑制量（IC50）的检测
利用方阵滴定法确定上述制备的吩噻嗪类药物人工抗原和单克隆抗体的工作浓度。采用不同浓度的2-氯吩噻嗪标准品做实验溶液，其浓度如下：0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20（单位：ng/mL），采用6组平行试验（n=6）
间接竞争ELISA方法：用上述制备的工作浓度的吩噻嗪类药物的偶联物包被酶标板，4℃过夜或者37℃ 2小时。然后，甩净拍干板内溶液，PBST洗涤3-5次，每次3min。加入封闭液37℃孵育30min。把板内液体甩净拍干，将实验溶液和抗体溶液同时加入酶标板孔中，同时设置空白（将抗体换位稀释液其他不变）和阴性对照孔（将实验溶液换为稀释液其他不变），37℃孵育1小时。然后将孔内液体甩净拍干，PBST洗涤3-5次每次3min。加入酶标二抗，37℃孵育1小时。甩净拍干，PBST洗涤3-5次，每次3min。加入显色液，37℃显色20min。然后加入终止液，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值为A。以吸光度A为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的Log值为纵坐标，绘制半对数标准曲线图，标准曲线的平行测定次数为6次，实验重复性好。
根据标准曲线得出10%抑制量(LOD)和半数抑制量（IC50），检测灵敏度。抑制率用以下式计算：
       抑制率（%）=[（ODmax-ODmin）-(ODx-ODmin)]/(ODmax-ODmin)
式中ODmax为不加标准品时的吸光值（阴性对照），ODx为标准品浓度x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
结果表明，所得单克隆抗体对2-氯吩噻嗪的半数抑制量（IC50）为3.5ng/mL，最低检测限（LOD）为0.2 ng/mL。
（b）抗体的特异性检测
抗体的特异性是指它同特异性抗原的结合能力，与该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价的标准。抗体对抗原类似物的交叉反应率大，说明该抗体适合作为多残留免疫检测试剂。
将6种吩噻嗪类药物（氯丙嗪、异丙嗪、乙酰丙嗪、奋乃静、氟奋乃静、硫利达嗪）分别进行系列稀释，然后分别与上述实施例制备的单克隆抗体进行反应，制作标准曲线。在曲线上分别找到这6种药物产生50%抑制时的半数抑制量（IC50），计算2-氯吩噻嗪单克隆抗体对这几种类似物的交叉反应率。交叉反应率（%）= （2-氯吩噻嗪的半数抑制量/其他类似物的半数抑制量）×100%。
实验设3次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明，2-氯吩噻嗪的单克隆抗体表现出广谱特异性，能同时识别氯丙嗪、奋乃静、异丙嗪、氟奋乃静、乙酰丙嗪、硫利达嗪，交叉反应率分别为94%、89%、64%、47%、38%、31%。由此可知，本发明提供的2-氯吩噻嗪单克隆抗体可以同时识别上述6种吩噻嗪类药物，能够用于建立针对吩噻嗪类药物的多残留免疫检测方法，或研制多残留免疫检测产品。

Claims (6)

1.一种吩噻嗪类药物的半抗原，其特征在于：其分子结构式如式1所示：
                                                           。
2.一种如权利要求1所述的吩噻嗪类药物的半抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，以下按物质的量计：
（a）将1份2-氯吩噻嗪溶于四氢呋喃中，搅拌下加入1~5份的氢化钠，搅拌反应10~30分钟；
（b）向上述反应体系中加入1~2份的溴乙酸钠，加热至回流，反应6~12小时后停止加热并降至室温；
（c）向上述反应体系中加入5~10份的氢化钠，回流反应8~12小时后停止反应并降至室温；
（d）向上述反应体系中加入无水乙醇除去过量的氢化钠，减压抽滤，所得滤液在旋转蒸发器上蒸干，得固体，将所得固体在乙醇中酸化后采用柱层析法分离得式1所示化合物。
3.一种吩噻嗪类药物的人工抗原，其特征在于：由权利要求1所述的吩噻嗪类药物的半抗原与载体蛋白偶联而成，其分子结构式如式2所示：
Figure 2013105136126100001DEST_PATH_IMAGE002
所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
4.如权利要求3所述的吩噻嗪类药物的人工抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（a）将0.1mmol的吩噻嗪类药物半抗原溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20μL三乙胺和0.1~0.5mmol氯甲酸异丁酯，4~10℃搅拌反应1~2小时，得A液；
（b）将0.02mmol的牛血清白蛋白溶解于2mL 1mol/L碳酸氢钠溶液中，得B液；
（c）将A液滴加到B液中，4~10℃搅拌反应10~12小时，得到含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液；
（d）将上述含吩噻嗪类药物人工抗原的反应液在4~20℃用PBS透析3~4天，然后将透析袋中的溶液在无菌条件下用滤径为0.2um的滤膜过滤，得到吩噻嗪类药物的人工抗原。
5. 一种吩噻嗪类药物的单克隆抗体，是能与权利要求3所述的吩噻嗪类药物的人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
6.如权利要求5所述的吩噻嗪类药物的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体用于吩噻嗪类药物的免疫检测。
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