CN101747436A - 一种抗农药亚胺硫磷的特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亚胺硫磷人工抗原的合成方法与抗体制备过程。本发明属于农药小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及有机合成，免疫化学，生物化学等。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂，成本较高，分析速度较慢的问题，提供了简洁，快速，灵敏，准确的免疫分析技术。设计和合成的半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸分别与血蓝蛋白载体蛋白，辣根过氧化物酶连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经过动物免疫，取血，提取抗血清，纯化制得抗体。该抗体由于稳定性好，特异性和灵敏度高，可用于农药有机磷的快速免疫检测，且有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和农药残留分析技术领域：涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试技术等，特别涉及半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的设计合成和特异性抗体的制备。
背景技术
亚胺硫磷是一种非内吸性广谱杀螨剂和杀虫剂。具有触杀，胃杀活性，适用于防治水稻，棉花，果树，蔬菜等多种作物害虫并兼治叶螨，残效期长，是代替敌百虫，久效磷，对硫磷，甲胺磷等高毒农药的理想药剂。但农药的不合理使用也导致了严重的农药残留超标问题，影响人们的身体健康和农产品出口贸易。我国对亚胺硫磷在农产品的残留量有着严格的检测标准：粮食≤1mg/kg，蔬菜≤1mg/kg，水果≤1mg/kg，茶叶≤1mg/kg。自90年代，基于抗原抗体免疫反应农药残留的酶联免疫吸附测定技术(ELISA)得到了全面迅速的发展。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。80年代以来发展起来的农药ELISA和简易酶免疫EIA技术，使农药残留分析在方法上获得很大的突破，对样品的快速分析起到了极大的推动作用。
小分子酶联免疫分析方法的开发，因为小分子本身不具有免疫原性，必须与大分子载体蛋白交联才能刺激动物产生免疫应答，产生针对小分子目标物的特异性抗体，为其免疫分析方法的建立提供必要条件，因此小分子免疫分析的半抗原合成和人工抗原合成是关键步骤。
发明内容
当前急需一种简易，快速，有效的检测亚胺硫磷方法。本发明的目的是通过设计合成针对有机磷亚胺硫磷的半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸，制得人工抗原，制备对亚胺硫磷有高度特异性的抗体。本发明的独特之处在于半抗原只具有邻苯二甲酰亚胺基半族的特异性结构，与亚胺硫磷的特异性结构非常相似，合成方法简单快速，所制得的抗体针对亚胺硫磷有着很高的特异性和灵敏度，并以此建立了ELISA在水果和果汁等样品快速免疫分析方法。
本发明设计合成了小分子目标分析物亚胺硫磷的半抗原，并与载体蛋白偶联，制备了有效的人工抗原，免疫动物制备对亚胺硫磷的特异性抗体，利用抗原抗体特异性免疫反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测超微量亚胺硫磷。
该技术研究的关键是半抗原的设计合成、人工抗原和抗体的制备。
亚胺硫磷结构如下：
亚胺硫磷的分子结构可以分为两个结构单元：一部分是磷酸酯部分，另一部分是邻苯二甲酰亚胺基部分。从免疫学的角度分析，邻苯二甲酰亚胺基部分的空间结构复杂，分子量较大，可以作为抗原决定簇，而磷酸酯部分可以在总体结构上视为一个线性长链分子，可以作为与载体蛋白连接的臂。因此在合成半抗原时，必须保留邻苯二甲酰亚胺基结构，而可以对邻苯二甲酰亚胺基的结构链进行适当的修饰，形成可以与载体蛋白连接的臂。因此，本发明在设计合成亚胺硫磷半抗原时，采用N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯与氨基己酸反应，引入结构不同的活性侧链的合成方法来合成亚胺硫磷半抗原，这样既保持了亚胺硫磷半抗原与亚胺硫磷在结构上的相似性，又使半抗原分子具有了与载体蛋白连接的合适结构。
半抗原的设计、合成是本方法成败的关键所在。为突出该类农药分子特异性抗原决定簇，本发明选择N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯与6-氨基己酸为原料合成半抗原，半抗原分子量MW为261
半抗原与血兰蛋白KLH连接合成人工抗原：
半抗原与HRP连接形成酶标抗原：
其中人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗全血清，纯化制得抗体。
农药亚胺硫磷半抗原的合成及抗体制备的方法：
(1)N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成：
准确称取0.1250g的氨基己酸，0.0960g的无水Na2CO3溶于5.0mL蒸馏水中，加入0.255gN-邻苯二甲酰亚胺基甲酯，室温搅拌至完全溶解，约1小时反应终止，过滤，滤液酸沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，无水Na2SO4干燥，制得半抗原。
(2)亚胺硫磷半抗原活化酯的合成：
称取0.5000g半抗原，0.2400gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3ml无水四氢呋喃中，N2保护下，滴加溶有0.4500g DCC的无水四氢呋喃溶液2ml，搅拌过夜。过滤除去白色沉淀，旋蒸除去有机溶剂，经硅胶柱纯化得到白色固体即为亚胺硫磷半抗原的活化酯。
(3)人工抗原和包被抗原的合成
用半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的活性酯，以酰胺基CONH为桥梁，通过活性酯法，分别连接到卵清蛋白(ovalbumin，OVA)合成包被抗原和血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)上合成人工抗原，具体做法是：
取所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A，KLH或OVA溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B。活化酯和蛋白的摩尔比13∶1～40∶1然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中。经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃，ph＝7.4的PBS溶液中透析三天。精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃下贮藏。
(4)酶标抗原的制备：
用半抗N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的活性酯与辣根过氧化物酶连接即制成酶标抗原，用于显色反应，具体做法是：
取所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A，HRP溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B。活化酯和蛋白的摩尔比10-13∶1，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中。经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃，ph＝7.4的PBS溶液中透析三天。精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃下贮藏。
(5)免疫和制备特异性抗体
免疫：免疫动物选用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，第五次免疫完后9天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；具体做法是：
初次免疫：取1mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备亚胺硫磷抗体。
有益效果
与其他同类方法相比，本发明具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。该设计、合成的半抗原与目标待测物相似程度高，对待测物的特征结构保留特异性较强部分，为制备特异性良好的抗体奠定了基础。其抗体具有良好的特异性和灵敏度，检测极限达到0.6ng/ml，而且酶标抗原的稀释度可达到1×106。
经试验验证，上述半抗原，其合成方法简便，且所用主要原料如N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯、6-氨基己酸价格较为低廉、容易获得，在一般化学试剂公司都可购买。由于合成效率高、反应步骤少，半抗原只需一步反应既可合成，从而提高了反应的可控性，反应产率分别达到了90％以上。另外，合成产物的提取、纯化方法简便，只需要对合成产物进行重结晶，即可获得高纯度的目的产物。因此，本发明合成半抗原的方法与其他方法相比较，更加易于推广普及。
具体实施方式
半抗原的合成与抗体的制备
(1)N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸的合成：
准确称取0.1250g的氨基己酸，0.0960g的无水Na2CO3溶于5.0mL蒸馏水中，加入0.255gN-邻苯二甲酰亚胺基甲酯，室温搅拌至完全溶解，约1小时反应终止。过滤，滤液酸沉至沉淀完全，乙酸乙酯提取，无水Na2SO4干燥，蒸发溶剂即可得到白色固体，其总产率为90％。；
(2)亚胺硫磷半抗原活化酯的合成：
称取0.5000g半抗原，0.2400g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3ml无水四氢呋喃中，N2保护下，滴加溶有0.4500g DCC的无水四氢呋喃溶液2ml，搅拌过夜。过滤除去白色沉淀，旋蒸除去有机溶剂，经硅胶柱纯化得到白色固体即为亚胺硫磷半抗原的活化酯，其总产率为93％。
(3)人工抗原的合成
取半抗原的活化酯0.1000g溶于DMF2ml配成溶液A，0.1000gKLH溶于2ml磷酸缓冲溶液中配成溶液B。活化酯和蛋白的摩尔比13∶1，即在2mlB液中加入0.128ml的A液，加入时在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中。经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃，ph＝7.4的PBS溶液中透析三天。精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃下贮藏。
(4)酶标抗原的制备
取半抗原的活化酯0.1000g溶于DMF2ml配成溶液A，HRP0.0300g溶于2ml磷酸缓冲溶液中配成溶液B。活化酯和HRP的摩尔比11∶1，即在2mlB液中加入0.332ml的A液，加入时在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃，ph＝7.4的PBS溶液中透析三天。精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃下贮藏。
(5)免疫和制备特异性抗体
免疫：免疫动物选用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，第五次免疫完后9天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；具体做法是：
初次免疫：取1mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备亚胺硫磷抗体。
Claims (6)
1.抗农药亚胺硫磷的抗体其特征在于使用N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸作为半抗原与血蓝蛋白KLH连接合成人工抗原，免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得。
2.权利要求1所述的农药亚胺硫磷半抗原其特征在于使用N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯和6-氨基己酸为原料合成分子式为
的化合物作为半抗原。
3.权利要求1所述的农药亚胺硫磷的人工抗原其特征在于使用半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸与血兰蛋白合成。
4.权利要求1所述的农药亚胺硫磷半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸其特征在于是用下述步骤制得：准确称取0.1250g的氨基己酸，0.0960g的无水Na2CO3溶于5.0mL蒸馏水中，加入0.2550g N-邻苯二甲酰亚胺基甲酯，室温搅拌至完全溶解，约1小时终止反应，反应液过滤后用乙酸乙酯提取，提取液用无水Na2SO4干燥，制得半抗原。
5.权利要求1所述的免疫动物制备特异性抗体的方法如下：
免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，9天后由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：
初次免疫：取1mg按照权利要求3所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备获得抗农药亚胺硫磷的特异性抗体。
6.用权利要求1所述的农药亚胺硫磷半抗原N-邻苯二甲酰亚胺基-6-氨基己酸分别与卵清蛋白OVA和辣根过氧化物酶HRP连接，合成包被抗原和酶标抗原用于建立亚胺硫磷的酶联免疫检测方法。
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|---|---|---|---|---|
| CN103558373A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-02-05 | 天津九鼎医学生物工程有限公司 | 定量检测食品及中药中亚胺硫磷含量的试剂盒及应用方法 |
| CN104031142A (zh) * | 2014-06-10 | 2014-09-10 | 江南大学 | 一种高特异性的叶酸完全抗原合成方法及其应用 |
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2008
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Wang Junping Document name: Notification of Publication of the Application for Invention |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100623 |