CN106928166B - 一种呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呋虫胺半抗原、完全抗原、抗体的制备方法及应用，包括具有四氢‑3‑呋喃结构的新烟碱类农药呋虫胺的人工半抗原、完全抗原及抗体的制备及相应的检测方法的建立。本发明的检测方法克服了普通光度法灵敏度低，无法满足要求的问题，建立了一种灵敏度高、成本低、快速易掌握的免疫分析方法。它以1‑甲基‑2‑氨基‑3‑(四氢‑3‑呋喃甲基)胍为半抗原结构，偶联牛血清白蛋白为免疫原，偶联卵清蛋白为包被原。将免疫原经过免疫动物、从抗血清中提纯出抗体，使用该抗体建立的呋虫胺免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强的的优点，且半抗原合成方法简便，具有较好的应用前景。

Description

一种呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于小分子食品环境污染物的免疫化学和残留生物分析技术领域，具体涉及一种呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体及其制备方法与应用。
背景技术
呋虫胺是由日本三井化学株式会社研发的新一代烟碱类农药，是继吡虫啉等第一代、噻虫嗪等第二代烟碱农药后的又一类具有新结构的烟碱类农药。呋虫胺分子中具有的呋喃环和开环的胍基取代了前两类氯代吡啶基、氯代噻唑基或者闭环胍基，是烟碱类农药分子结构中唯一不含卤素原子和芳香环的种类，杀虫活性和安全性更高。呋虫胺也是一种烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂，具有较好的胃毒、触杀和根部内吸性，活性高、安全性高、持效期长，杀虫谱广等优点，广泛用于水稻、蔬菜、果树中的飞虱、椿象类、二化螟、蚜虫类、粉虱类、蛾类、蓟马类等的防治，对已经产生抗药性的很多害虫具有较好的防治效果，是烟碱类农药的最新品种。
即使呋虫胺的毒性较小，但是大量使用仍不免会在农产品和环境中造成残留，长期的低浓度的残留也会对人类健康和环境造成危害，特别是对家蚕、蜜蜂等生物还是具有一定的毒性，欧盟已经禁用了包括吡虫啉等在内的三种新烟碱类杀虫剂在很多种作物中的应用，在美国EPA要求在户外使用呋虫胺时一定要测定其对非靶标昆虫，比如传粉昆虫的影响。而且，很多国家都制定了越来越严格的残留限量标准。美国对呋虫胺的限量标准根据作物不同从0.05-50mg/kg，日本的肯定列表规定呋虫胺的限量标准为0.01-2mg/kg。农药残留现在主要是靠气相色谱、液相色谱及其与质谱联用技术，该类技术具有精密度高等优点，但是它们具有仪器设备昂贵、条件要求高、过程繁琐不易掌握、成本高昂等特点，特别对于农产品等附加值低、保鲜要求高的产品不适合，因此对于快速、成本低廉、灵敏度高的分析技术比较迫切。
其中，酶免疫反应是发展较早，较为成熟的一种快速分析方法。但是与大分析相比较而言，小分子不容易引起机体的免疫反应，即不具备免疫原性，被称为半抗原；但是具有特定结构的小分子可以与抗体产生反应，即小分子具有反应原性，因此如果将小分子连接到具有免疫原性的大分子上，做成人工抗原，就可以使机体产生免疫应答，产生针对小分子结构的抗体。但是不是任何小分子与大分子连接都会产生针对这个小分子的抗体，也不是产生的抗体都能针对此小分子产生特异性结合，因此在小分子半抗原结构的设计非常重要，首先要设计合理的半抗原结构既能容易实现反应又能够较恰当的模拟目标分析物的结构；其次，要选择合适的与大分子的结合位点、选择合适长度和合适结构的连接臂，凸显小分子的特征结构、易于产生免疫应答的结构能刺激机体产生反应；再次，考虑到还要分子的空间结构、电子云密度、构型构像等的诸多因素，都可能会对抗体的性质产生较大影响。
基于抗原抗体特异性结合的免疫反应的分析技术主要是ELISA和EIA，其中以ELISA应用更为广泛，ELISA技术发展自70年代，农药等小分子免疫检测技术发展自80年代，ELSIA以根据酶标的抗体分解底物显示颜色的深度或吸光度与待测物质含量之间的关系来进行测定。这一技术手段具有灵敏度高、分析速度快、抗基底干扰能力强等优点，得到了较快的发展。该技术最重要的在于小分子半抗原结构的设计、连接位点的选择、连接臂结构和长度的选择等等会影响抗体结构的重要方面，也是该技术的关键点和高质量抗体的保障。关于呋虫胺人工半抗原、人工抗原、抗体以及以此为基础的免疫分析方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体。
本发明的目的还在于提供上述呋虫胺半抗原、完全抗原和抗体的制备方法。
本发明的目的还在于提供上述半抗原、完全抗原和抗体在呋虫胺含量检测免疫分析方法的建立方面的应用。
一种呋虫胺半抗原，所述呋虫胺半抗原的分子结构如式I所示：
一种呋虫胺免疫原，是由上述的半抗原与牛血清半蛋白偶联而来，其分子结构如式II所示：
一种呋虫胺包被原，是由上述的半抗原与卵清蛋白偶联而来，其分子结构如式III所示：
一种呋虫胺抗体，是能与上述呋虫胺免疫原或呋虫胺包被原发生特异性反应的IgG抗体。
上述呋虫胺半抗原的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将呋虫胺2.00-2.50g溶于无水三口瓶中的20-30mL乙醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅拌步骤(1)制备的呋虫胺乙醇溶液，缓慢投入8.50-11.25g二水合氯化亚锡，至完全溶解，氮气保护回流反应4-6h；
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心，弃去沉淀，再重复离心3次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
上述呋虫胺免疫原的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝5.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.040-0.045g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，完全溶解后再搅拌15min，加0.020-0.025g N-N-羟基琥珀酰亚胺，溶解后搅拌40min；
(2)将权利要求1中所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0mL的DMF中，将步骤(1)制备的反应液的pH调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜；
(3)将步骤(2)制备的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心，然后进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存；
上述呋虫胺免疫原的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝6.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.030-0.039g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，完全溶解后再搅拌15min，加0.010-0.030g N-N-羟基琥珀酰亚胺溶解后搅拌40min；
(2)将权利要求1所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0mL的DMF中，将步骤(1)制备的反应液的pH调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜；
(3)将步骤(2)制备的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心，然后进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
上述呋虫胺抗体的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)免疫：选用新西兰大白兔，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，具体做法是：
第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；
第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；
第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；
第二至第五次免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对权利要求3中所述的呋虫胺包被原效价达到1∶60000-1∶80000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法对抗血清进行纯化，制备得权利要求4中所述的IgG抗体。
上述呋虫胺包被原和呋虫胺抗体的应用，用于呋虫胺含量检测免疫分析方法的建立。
本发明的有益效果：本发明设计合成的半抗原能够很好的模拟呋虫胺分子结构特征，为呋虫胺特征结构的暴漏和高特异性抗体的产生做好基础；抗体具有高的特异性，检测限达到1.28μg/L；上述半抗原合成简单，收率高，反应易于控制；本发明合成的半抗原的方法简单，易于掌握，所建立的酶联免疫方法灵敏度和准确度高，操作简单，成本低，非常适合于现场检测。因此，本发明为高效，低廉、快速的免疫检测产品打下很好的基础，具有良好的应用前景和经济效益。
附图说明
图1为实施例2半抑制浓度即IC50的值测定曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
呋虫胺半抗原制备方法，步骤包括：
(1)将呋虫胺2.10g溶于无水三口瓶中的25mL乙醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅拌上述乙醇溶液，缓慢投入8.5g二水合氯化亚锡，至完全溶解，氮气保护回流反应4h；
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心10min，弃去沉淀，再重复离心3次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
免疫原的制备方法为活泼酯法，包括以下步骤：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝4.5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.045gEDC*HCl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐]，完全溶解后再搅拌15min，加0.021g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
包被原也采用活泼酯法进行制备，步骤如下：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝6.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.035gEDC*HCl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐]，完全溶解后再搅拌15min，加0.015g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.5，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.5的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
抗体的制备：
(1)免疫：选用新西兰大白兔选用新西兰大白兔(免疫前先采其血清作为阴性血清)，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；第二至加强(第五次)免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对呋虫胺包被原效价达到1∶60000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法粗体，葡聚糖凝胶纯化对抗血清进行制备，制得IgG抗体。
实施例2
呋虫胺半抗原制备方法，步骤包括：
(1)将呋虫胺2.40g溶于无水三口瓶中的25mL乙醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅拌上述乙醇溶液，缓慢投入10.00g二水合氯化亚锡，至完全溶解，氮气保护回流反应5h；
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心10min，弃去沉淀，再重复离心4次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
免疫原的制备方法为活泼酯法，包括以下步骤：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝5.5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.042gEDC*HCl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐]，完全溶解后再搅拌15min，加0.023g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.5，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
包被原也采用活泼酯法进行制备，步骤如下：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝5.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.034gEDC*HCl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐]，完全溶解后再搅拌15min，加0.014g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至9.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
抗体的制备：
(1)免疫：选用新西兰大白兔，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；第二至加强(第五次)免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对呋虫胺包被原效价达到1∶70000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法粗体，葡聚糖凝胶纯化对抗血清进行制备，制得IgG抗体。
呋虫胺抗体在检测呋虫胺含量的应用，包括如下步骤：
(1)包被：用包被缓冲液(pH＝9.6，0.1mol/L的碳酸盐溶液)稀释包被原(在7中已定容)到2μg/mL，100μL/孔，室温孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗涤孔3次；
(2)封闭：每孔加入200μl含有1％OVA，0.02％吐温20的pH＝7.4的磷酸盐封闭缓冲液封闭室温封闭40min，用洗板液洗涤孔3次；
(3)加样：将待测样品溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，每孔50μL(或每孔加入50μl梯度浓度的标样，包括0点，即只加入50μL空白磷酸盐缓冲液的空白孔)，同时设置完全相同的另一组加样组，测定阴性血清孔的值；
(4)竞争反应：将抗体溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μl抗体溶液，孵育80min后用洗板液洗涤三次；
(5)加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗：将二抗用pH7.4的磷酸缓冲液20000倍稀释，每孔加入100μL，室温孵育70分钟后，甩出反应液拍净酶标板洗孔3次；
(6)显色反应：底物反应液由A液(一水合柠檬酸0.49g，十二水合磷酸氢二钠1.94g，溶于100mL水)9.5mL，B液(过氧化氢脲75mg溶于10mL水，4℃避光保存)32μL，C液(四甲基联苯胺(TMB)50mg溶于无水乙醇25mL，4℃避光保存)0.5mL，混合而成，现用现配，显色时每孔加入50μL，20min后每孔加入50μL 2.5mol/L的硫酸终止反应后在自动酶标仪上读数。
根据颜色反应的吸光度值，根据公式抑制率I(％)＝[1-(A样品-A阴性)/(A空白-A阴性)]*100％，其中A样品是指加有待测样品或者标液孔的吸光度，A阴性是指相同条件下不加抗体血清而加入阴性血清的孔的吸光值，A空白是待测物浓度为0时的孔的吸光度，计算出不同呋虫胺浓度对抗体的抑制率，并做出抑制的标准曲线，横坐标为呋虫胺标准溶液浓度的对数值，纵坐标为抑制率，找出半抑制浓度即IC50的值，IC50越低说明抗体的灵敏度越高，如图1，IC50为0.0059μg/mL。
实施例3
呋虫胺半抗原制备方法，步骤包括：
(1)将呋虫胺2.10g溶于无水三口瓶中的30mL乙醇中醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅搅拌上述乙醇溶液，缓慢投入二水合8.5g氯化亚锡，至完全溶解，氮气保护回流反应6h；
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心10min，弃去沉淀，再重复离心3次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
免疫原的制备方法为活泼酯法，包括以下步骤：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝4.5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.045gEDC*HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，完全溶解后再搅拌15min，加0.021g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
包被原也采用活泼酯法进行制备，步骤如下：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝6.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.035gEDC*HCl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐]，完全溶解后再搅拌15min，加0.015g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.5，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.5的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
抗体的制备：
(1)免疫：选用新西兰大白兔(免疫前采其血清作为阴性对照)，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；第二至加强(第五次)免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对呋虫胺包被原效价达到1∶60000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法对抗血清进行纯化，制备得IgG抗体。
ELISA方法的建立
(1)棋盘法确定包被原浓度为2μg/mL，100μL/孔，抗体按照1∶3000稀释，酶标二抗按照1∶20000稀释，加入梯度浓度的呋虫胺，做出抑制的标准曲线，确定出其50％抑制浓度，即IC50(呋虫胺)；同时在另一些孔中将呋虫胺替代为与其结构类似的其他农药，也做梯度浓度，找出其半抑制浓度，即IC50(类似物)。抗体的交叉反应率：CR(％)＝IC50(呋虫胺)/IC50(类似物)，这一值表示了抗体的特异性，值越小，特异性越高，表1列出了该抗体对一些结构类似物的交叉反应率。
表1抗体对一些结构类似物的交叉反应率
实施例4
呋虫胺半抗原制备方法，步骤包括：
(1)将呋虫胺2.40g溶于无水三口瓶中的30mL乙醇中醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅搅拌上述乙醇溶液，缓慢投入10.00g二水合氯化亚锡，至完全溶解，再加入菹草提取物0.05g或婆婆纳提取物0.1g，至完全溶解，氮气保护回流反应6h；所述菹草提取物或婆婆纳提取物的提取方法为：将菹草或婆婆纳新鲜的叶片放入烘箱在50-80℃条件下烘干，磨成粉末，加4-8倍重量份数的30％乙醇水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心10min，弃去沉淀，再重复离心4次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
免疫原的制备方法为活泼酯法，包括以下步骤：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝5.5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.042gEDC*HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，完全溶解后再搅拌15min，加0.023g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0mL的DMF中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆纳提取物0.1g(制备方法如上所述)，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.5，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
包被原也采用活泼酯法进行制备，步骤如下：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝5.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.034gEDC*HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，完全溶解后再搅拌15min，加0.014g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆纳提取物0.1g(制备方法如上所述)将上一步骤反应液的pH迅速调制至9.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
抗体的制备：
(1)免疫：选用新西兰大白兔，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；第二至加强(第五次)免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对呋虫胺包被原效价达到1∶70000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法粗体，葡聚糖凝胶纯化对抗血清进行制备，制得IgG抗体。
呋虫胺抗体在检测呋虫胺含量的应用，包括如下步骤：
(1)包被：用包被缓冲液(pH＝9.6，0.1mol/L的碳酸盐溶液)稀释包被原(在7中已定容)到2μg/mL，100μL/孔，室温孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗涤孔3次；
(2)封闭：每孔加入200μl含有1％OVA，0.02％吐温20的pH＝7.4的磷酸盐封闭缓冲液封闭室温封闭40min，用洗板液洗涤孔3次；
(3)加样：将待测样品溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，每孔50μL(或每孔加入50μl梯度浓度的标样，包括0点，即只加入50μL空白磷酸盐缓冲液的空白孔)，同时设置完全相同的另一组加样组，测定阴性血清孔的值；
(4)竞争反应：将抗体溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μl抗体溶液，孵育80min后用洗板液洗涤三次；
(5)加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗：将二抗用pH7.4的磷酸缓冲液20000倍稀释，每孔加入100μL，室温孵育70分钟后，甩出反应液拍净酶标板洗孔3次；
(6)显色反应：底物反应液由A液(一水合柠檬酸0.49g，十二水合磷酸氢二钠1.94g，溶于100mL水)9.5mL，B液(过氧化氢脲75mg溶于10mL水，4℃避光保存)32μL，C液(四甲基联苯胺(TMB)50mg溶于无水乙醇25mL，4℃避光保存)0.5mL，混合而成，现用现配，显色时每孔加入50μL，20min后每孔加入50μL 2.5mol/L的硫酸终止反应后在自动酶标仪上读数。
根据颜色反应的吸光度值，根据公式抑制率I(％)＝[1-(A样品-A阴性)/(A空白-A阴性)]*100％，其中A样品是指加有待测样品或者标液孔的吸光度，A阴性是指相同条件下不加抗体而加入阴性血清的孔的吸光值，A空白是待测物浓度为0时的孔的吸光度，计算出不同呋虫胺浓度对抗体的抑制率，并做出抑制的标准曲线，横坐标为呋虫胺标准溶液浓度的对数值，纵坐标为抑制率，找出半抑制浓度即IC50的值，IC50越低说明抗体的灵敏度越高，IC50为0.00032μg/mL。
实施例5
呋虫胺半抗原制备方法，步骤包括：
(1)将呋虫胺2.10g溶于无水三口瓶中25mL乙醇中醇中，连接冷凝装置，加热至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮气保护，磁力搅搅拌上述乙醇溶液，缓慢投入二水合8.5g氯化亚锡，至完全溶解，再加入青金石粉末1g或砗磲粉末2g，氮气保护回流反应6h；
(3)反应完成后往三口瓶中加蒸馏水，边加边搅拌，至不再生成浑浊物，将混合液12000rpm/min离心10min，弃去沉淀，再重复离心3次；
(4)将上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目标产物。
免疫原的制备方法为活泼酯法，包括以下步骤：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝4.5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.045gEDC*HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，完全溶解后再搅拌15min，加0.021g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0mL的DMF中，再加入青金石粉末1g或砗磲粉末2g，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
包被原也采用活泼酯法进行制备，步骤如下：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝6.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.035gEDC*HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)，完全溶解后再搅拌15min，加0.015g NHS(N-N-羟基琥珀酰亚胺)溶解后搅拌40min。
(2)将半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，再加入青金石粉末1g或砗磲粉末2g，将上一步骤反应液的pH迅速调制至8.5，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.5的溶液中，搅拌反应过夜。
(3)将上一步骤中的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心10min，然后将上清进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
抗体的制备：
(1)免疫：选用新西兰大白兔(免疫前采其血清作为阴性对照)，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；第二至加强(第五次)免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对呋虫胺包被原效价达到1∶60000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法对抗血清进行纯化，制备得IgG抗体。
ELISA方法的建立
(1)棋盘法确定包被原浓度为2μg/mL，100μL/孔，抗体按照1∶3000稀释，酶标二抗按照1∶20000稀释，加入梯度浓度的呋虫胺，做出抑制的标准曲线，确定出其50％抑制浓度，即IC50(呋虫胺)；同时在另一些孔中将呋虫胺替代为与其结构类似的其他农药，也做梯度浓度，找出其半抑制浓度，即IC50(类似物)。抗体的交叉反应率：CR(％)＝IC50(呋虫胺)/IC50(类似物)，这一值表示了抗体的特异性，值越小，特异性越高，表1列出了该抗体对一些结构类似物的交叉反应率。
表1抗体对一些结构类似物的交叉反应率

Claims (7)

1.一种呋虫胺免疫原，其特征在于，是由呋虫胺半抗原与牛血清白蛋白偶联而来，其分子结构如式II所示：
所述呋虫胺半抗原的分子结构如式为：
2.一种呋虫胺包被原，其特征在于，是由呋虫胺半抗原与卵清蛋白偶联而来，其分子结构如式III所示：
所述呋虫胺半抗原的分子结构如式为：
3.一种呋虫胺抗体，其特征在于，是能与权利要求1所述免疫原或权利要求2所述包被原发生特异性反应的IgG抗体。
4.权利要求1所述呋虫胺免疫原的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将0.1g的BSA溶于5.0mL pH＝5.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.040-0.045g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，完全溶解后再搅拌15min，加0.020-0.025g N-N-羟基琥珀酰亚胺，溶解后搅拌40min；
(2)将呋虫胺半抗原0.020-0.031g溶解到1.0mL的DMF中，将步骤(1)制备的反应液的pH调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜；
(3)将步骤(2)制备的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心，然后进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
5.权利要求2所述呋虫胺包被原的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将0.1g的OVA溶于5.0mL pH＝6.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入0.030-0.039g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，完全溶解后再搅拌15min，加0.010-0.030g N-N-羟基琥珀酰亚胺溶解后搅拌40min；
(2)将呋虫胺半抗原0.020g溶解到1.0mL的DMF中，将步骤(1)制备的反应液的pH调制至8.0，将溶解有半抗原的DMF溶液加至此pH为8.0的溶液中，搅拌反应过夜；
(3)将步骤(2)制备的溶液在pH＝7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min离心，然后进行定容，计算完全抗原浓度，测定结合比，分装冻存。
6.权利要求3所述呋虫胺抗体的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)免疫：选用新西兰大白兔，采用皮下注射法进行免疫，一共进行五次免疫，具体做法是：
第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；
第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解冻，加生理盐水和等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，然后进行注射免疫；
第五次免疫为加强免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解冻，加生理盐水直接进行注射免疫；
第二至第五次免疫分别在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后进行，从第三次免疫后开始，每次免疫后7天从兔子耳缘静脉取血，测定血清效价；
(2)抗体纯化：当抗血清中的抗体对权利要求2中所述的呋虫胺包被原效价达到1∶60000-1∶80000时，兔颈部静脉取血，离心获得抗血清，使用辛酸-硫酸铵法对抗血清进行纯化，制备得权利要求3中所述的IgG抗体。
7.权利要求2所述呋虫胺包被原和权利要求3所述呋虫胺抗体的应用，其特征在于，用于呋虫胺含量检测免疫分析方法的建立。
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