CN111646959B - 一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种呋虫胺半抗原以及呋虫胺胶体金检测装置及其制备方法。所述呋虫胺半抗原可应用于免疫层析方面的检测，为呋虫胺的快速检测提供了基础；所述呋虫胺胶体金检测装置，应用胶体金免疫层析原理，胶体金试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中的呋虫胺残留量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有呋虫胺，能够满足监管部门、检测机构对呋虫胺的现场快速检测需求，与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。

Description

一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫 胺胶体金检测装置
技术领域
本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置。
背景技术
呋虫胺(dinoterfuran)是一种新型烟碱类杀虫成分，具有高效、光谱、良好的根部内吸性等的特点，在水稻、小麦、蔬菜、果树、茶叶、棉花、烟草等作物上大量使用，主要用于防止害虫如蚜虫、烟粉虱、蓟马、叶蝉、斑潜蝇、叶蜂、蝼蛄、网蝽、谷象、甲虫、水蜡虫、蟑螂等，主要作用于昆虫神经系统，通过与乙酰胆碱受体结合使昆虫异常兴奋，最后全身痉挛、麻痹致死。
中国、美国、日本等多个国家对农产品中呋虫胺残留做了严格的限量规定，因此，提供一种快速检测呋虫胺残留的方法对保障食品安全、确保我国农产品顺利出口具有重要的意义。而目前，国内外呋虫胺的检测方法主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等，虽然能够得到较为准确的检测结果，但是上述方法所用的仪器设备操作复杂、成本较高、对操作人员的技术要求较高，且不能够立即显示结果，不适用于基层管理部门对怀疑对象进行快速的检测和监控。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种呋虫胺半抗原、胶体金标记呋虫胺单克隆抗体以及呋虫胺胶体金检测装置。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种呋虫胺半抗原，所述呋虫胺半抗原的结构如下所示：
Figure BDA0002492275820000021
所述呋虫胺半抗原的制备方法包括如下步骤：
1)将邻苯二甲酰亚胺在混合溶剂中反应，得到中间体1，所述混合溶剂中包括氢氧化钾和乙醇；
2)将中间体1溶于有机溶剂中，加入6-溴-1-己烯以及加入催化剂碘化钾反应，将得到的反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体2；
3)将中间体2置于混合溶剂体系中反应，将反应产物洗涤、酸化、过滤得到中间体3，所述混合溶剂中包括乙醇、水合肼和盐酸；
4)将中间体3溶解后，加入硝基胍反应，将反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体4；
5)将中间体4与甲胺、甲醛反应，将得到的反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体5；
6)将3-四氢呋喃甲醇与甲基磺酰氯反应得到中间体6，将中间体5与中间体6反应，将反应产物调节至弱酸性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体7；
7)将中间体7置于混合溶剂体系中继续反应，所述混合溶剂包括乙腈、水、高碘酸钠、三氯化钌以及四氯化碳，反应结束后除去溶剂、溶解过滤、纯化即得到最终产物呋虫胺半抗原。
本发明提供了一种胶体金标记呋虫胺单克隆抗体，所述胶体金标记呋虫胺单克隆抗体为胶体金与呋虫胺单克隆抗体偶联制得；
所述呋虫胺单克隆抗体由呋虫胺抗原通过动物免疫制得；
所述呋虫胺抗原由呋虫胺半抗原与载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)以及血蓝蛋白(KLH)的一种或以上。
本发明提供了一种呋虫胺胶体金检测装置，所述胶体金检测装置的组件包括试纸条以及反应杯，所述反应杯内包括胶体金标记抗体，胶体金标记呋虫胺单克隆抗体，所述胶体金标记呋虫胺单克隆抗体为胶体金与呋虫胺单克隆抗体偶联制得；
所述胶体金的制备包括如下步骤，将氯金酸加热，加入柠檬酸三钠，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终转为亮红色，颜色稳定后继续加热、之后冷却即得到胶体金溶液；
所述胶体金标记单克隆抗体的制备包括如下步骤：将胶体金溶液调节至弱碱性，加入呋虫胺的单克隆抗体，之后依次加入PEG以及BSA继续反应，即得到胶体金标记单克隆抗体沉淀，采用PBS重悬即得胶体金标记单克隆抗体；
所述试纸条的组件包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接；
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线为能与呋虫胺单克隆抗体结合的呋虫胺偶联抗原在硝酸纤维素膜上包被划线制得，所述质控线为能与呋虫胺单克隆抗体结合的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上包被划线制得；所述包被划线为采用BioDot划膜仪制成，具体参数为平台移动速度40mm/s，呋虫胺偶联抗原包被浓度为1.5mg/ml，单位划线量为1μL/cm；羊抗鼠抗体包被浓度为2mg/ml，单位划线量为1μL/cm；
所述试纸条的组装为将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接在底板上，样品垫和吸水垫分别压在硝酸纤维素膜上方1～2mm；
所述呋虫胺胶体金检测装置的检测原理为，采用竞争法免疫层析技术，使待测样品中的呋虫胺以及检测线上包被的呋虫胺抗原与胶体金标记的呋虫胺单抗发生竞争形式的结合，若待测样品中含有呋虫胺，待测样品中的呋虫胺与胶体金标记的呋虫胺单克隆抗体结合，从而抑制了金标呋虫胺单抗与检测线上包被的呋虫胺抗原的结合，通过检测线和质控线颜色深浅的比对得到检测结果。
本发明的有益效果如下：
本发明的呋虫胺半抗原，可应用于免疫层析方面的检测，为呋虫胺的快速检测提供了基础；
本发明的呋虫胺胶体金检测装置，应用胶体金免疫层析原理，胶体金试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中的呋虫胺残留量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有呋虫胺，能够满足监管部门、检测机构对呋虫胺的现场快速检测需求，与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
附图说明
图1为呋虫胺半抗原的制备流程图；
图2为呋虫胺胶体金检测装置的结构示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种呋虫胺半抗原的制备：
1)将5.55g邻苯二甲酰亚胺在混合溶剂(2.1g氢氧化钾溶于30ml乙醇)中反应，在55℃下搅拌反应3h，反应结束后旋干溶剂得到中间体1；
2)将中间体1溶于40mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入5.08g 6-溴-1-己烯，搅拌均匀后再加入22mg催化剂碘化钾反应，于70℃下搅拌反应1.5h，将得到的反应产物加适量水以及少量6M HCl调节至中性并用乙酸乙酯萃取2～3遍、合并有机相、蒸干后过柱纯化得到中间体2；
3)将中间体2置于混合溶剂体系中(30mL乙醇、1.56g水合肼)于80℃搅拌反应30min，反应结束后，冷却至室温后将生成的固体捣碎后加入50mL二氯甲烷，搅拌体系30min，将抽滤并用二氯甲烷洗涤。浓盐酸用甲醇稀释为1mol/L后酸化滤液，将析出的固体滤除，并用少量甲醇洗涤滤饼，滤液旋干后得到白色潮湿固体中间体3；
4)将中间体3溶于9mL水中，加入1.25g氢氧化钠，混合均匀后加入1.62g硝基胍反应，再加10mL甲醇，于室温搅拌反应43h，反应结束后，将反应产物加少量6mol/L HCl调节至中性并用乙酸乙酯萃取2-3遍、合并有机相、蒸干后过柱纯化得到中间体4；
5)将2.77g中间体4溶于6mL乙醇中，与1.54g 33％甲胺的甲醇溶液、36％的甲醛溶液于50℃下搅拌反应4h，将得到的反应产物调节至中性并乙酸乙酯萃取2-3遍、合并有机相、蒸干后过柱纯化得到白色固体中间体5；
6)将1.7g 3-四氢呋喃甲醇溶于25mL绝干THF，降温至0℃后滴入甲基磺酰氯1.94g，然后滴入三乙胺1.72g。待反应稳定后升温至室温反应3.5h，反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入适量水，用二氯甲烷萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到无色液体中间体6，中间体6的极性于原料非常接近稍小于原料；
将2.37g中间体5溶于24mLN,N-二甲基甲酰胺，然后加入甲醇钠0.9g，搅拌均匀后与2.3g中间体6于70℃搅拌反应过夜，反应结束后，加少量6mol/L HCl将反应产物调节至弱酸性，旋蒸除去DMF后加水并用二氯甲烷萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到无色油状液体中间体7；
7)将1.92g中间体7置于250mL单口烧瓶中，加入乙腈20mL、水30mL，然后加入高碘酸钠5.32g，再加入三氯化钌295mg，最后加入四氯化碳20mL。将混合体系加热60℃回流2h。反应完成后旋蒸除去所有溶剂，然后将所得固体刮散加入甲醇搅拌，使可溶物尽量溶解。过滤除去滤渣，滤液蒸干后过柱纯化得到橙黄油状液体呋虫胺半抗原。
以上呋虫胺半抗原的制备工艺流程如图1所示。
实施例2
一种胶体金标记呋虫胺单克隆抗体：
1)呋虫胺抗原的制备：将0.1mmol呋虫胺半抗原溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌加入0.2mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液，称取牛血清白蛋白(BSA)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH＝8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的呋虫胺抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存于-20℃的冰箱中；
以上述的制备方法以人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)以及血蓝蛋白(KLH)的一种或以上为载体蛋白制备呋虫胺抗原，在此不作重复叙述。
2)呋虫胺抗体的制备：
2a)动物免疫
将呋虫胺抗原免疫4只6周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为200μg/只，加强免疫三次后，使其产生抗血清；
2b)细胞融合和克隆化
在无菌条件下，取免疫BALB/C小鼠脾脏制备脾细胞，数量配比按脾细胞：骨髓瘤细胞(SP2/0)＝9﹕1进行融合，经3次以上的克隆培养和检测，筛选得到稳定分泌抗呋虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
2c)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时从液氮灌中取出冻存管，快速放入37℃温水浴中，并轻轻摇动使其尽快融化，离心去除冻存液后，移入细胞培养瓶内培养；
2d)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存；
该细胞培养基为向RPMI 1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.6。
3)胶体金标记呋虫胺单克隆抗体的制备：
3a)取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积；
3b)调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入呋虫胺的单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的PEG，充分反应30min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30min。在10000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加1×PBS重悬备用。
实施例3
一种呋虫胺胶体金检测装置的制备：
试纸条：在底板上，沿同一方向依次将样品垫、喷涂有呋虫胺-BSA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；
所述硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，所述检测线为能与呋虫胺单克隆抗体结合的呋虫胺偶联抗原在硝酸纤维素膜上包被划线制得，所述质控线为能与呋虫胺单克隆抗体结合的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上包被划线制得；所述包被划线为采用BioDot划膜仪制成，具体参数为平台移动速度40mm/s，呋虫胺偶联抗原包被浓度为1.5mg/ml，单位划线量为1μL/cm；羊抗鼠抗体包被浓度为2mg/ml，单位划线量为1μL/cm；
所述试纸条的组装为将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接在底板上，样品垫和吸水垫分别压在硝酸纤维素膜上方1～2mm；
反应杯：反应杯内加入胶体金标记呋虫胺单克隆抗体，冻干；
如图2为呋虫胺胶体金检测装置的结构图示意图。
1.将上述制备的呋虫胺胶体金用于呋虫胺检测：
1)样品的预处理：取2g±0.1g剪碎后的样品加入到15mL或50mL离心管中，加入6mL含有10％乙醇的pH值为7.2的PBS缓冲液的提取液，充分震荡混匀后即为待测液；
2)检测：吸取上述待测液200μL(9-10滴)于反应杯中，并上下抽吸10次混匀；20～40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，20～40℃下开始第二步反应，并计时3分钟；从微孔中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；
3)结果判读
Figure BDA0002492275820000101
4)与验证方法结果对比
检测方法 测定结果
呋虫胺胶体金 阳性
液相色谱-质谱/质谱法 呋虫胺0.5mg/kg
其表明采用呋虫胺胶体金的检测方法与实验室验证方法结果一致，而呋虫胺胶体金更加快捷方便，且可见采用呋虫胺胶体金检测的灵敏度可达到呋虫胺0.5mg/kg。
2.呋虫胺胶体金检测装置的特异性实验
在阴性样品中，分别加入呋虫胺0.5mg/kg、吡虫啉10mg/kg、啶虫脒10mg/kg、噻虫啉10mg/kg。实验结果发现，只有加入呋虫胺的样品能够检出，而加入吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉的样品无法检出，说明本检测装置对呋虫胺的特异性较好。
3.呋虫胺胶体金检测装置的保质期实验
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性和0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg加标实验，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间，阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。

Claims (1)

1.一种呋虫胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述呋虫胺半抗原的制备包括如下步骤：
1）将邻苯二甲酰亚胺在混合溶剂中反应，得到中间体1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，所述混合溶剂 中包括氢氧化钾和乙醇；
2）将中间体1溶于有机溶剂中，加入6-溴-1-己烯以及加入催化剂碘化钾反应，将得到 的反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
3）将中间体2置于混合溶剂体系中反应，将反应产物洗涤、酸化、过滤得到中间体3
Figure DEST_PATH_IMAGE005
，所述混合溶剂中包括乙醇、水合肼；
4）将中间体3溶解后，加入硝基胍反应，将反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯 化得到中间体4
Figure DEST_PATH_IMAGE007
；
5）将中间体4与甲胺、甲醛反应，将得到的反应产物调节至中性并萃取、合并有机相、纯 化得到中间体5
Figure DEST_PATH_IMAGE009
；
6）将3-四氢呋喃甲醇与甲基磺酰氯反应得到中间体6
Figure DEST_PATH_IMAGE011
，将中 间体5与中间体6反应，将反应产物调节至弱酸性并萃取、合并有机相、纯化得到中间体7
Figure DEST_PATH_IMAGE013
；
7）将中间体7置于混合溶剂体系中继续反应，所述混合溶剂包括乙腈、水、高碘酸钠、三 氯化钌以及四氯化碳，反应结束后除去溶剂、溶解过滤、纯化即得到最终产物呋虫胺半抗原
Figure DEST_PATH_IMAGE015
。
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