CN103288741B

CN103288741B - 一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103288741B
Application number: CN201310197597.9A
Authority: CN
Inventors: 徐振林; 孙远明; 罗林; 沈玉栋; 肖治理; 杨金易; 雷红涛; 王弘
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: CN103288741A

Abstract

本发明公开了一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述组胺半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：；其中，n=0～6，Y=COOH、NO₂。所述组胺人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：；其中，n=0～6。采用本发明抗原得到的抗血清的效价可达到1×10⁷，最低检测限为0.13ng/mL，半抑制浓度为7.6ng/mL，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高，本发明中组胺衍生物制备方法简单高效，重复性高，为建立快速、准确、灵敏的组胺免疫检测方法奠定了基础。

Description

一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。

背景技术

生物胺是一类含氮的低分子有机碱，主要由氨基酸脱羧作用形成，广泛存在于富含氨基酸、蛋白质的肉制品、水产品和发酵制品等。适量的生物胺是维持人体正常生理功能所必需的，过量则会引起过敏反应，严重的还会危及生命。此外，食品中生物胺含量与食品品质有一定的相关性。因此，加强食品中生物胺的监测对提高食品品质和安全性具有重要意义。生物胺中对人体健康影响最大的是组胺。摄入8~40 mg组胺会产生轻微的中毒症状，超过40 mg产生中等中毒症状，超过100 mg产生严重中毒症状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究，确定组胺的危害作用水平为500 mg/kg(食品)。生物胺中毒事件时有发生且多于组胺有关，近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。由于生物胺中毒都一般都与组胺有关，欧美及我国对部分食品中组胺含量做了限量要求。美国FDA要求进口水产品组胺不得超过50 mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100 mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000 mg/kg；其他海水鱼不得超过300 mg/kg。

目前国内外检测组胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料是决定整个方法性能的重要基础，而抗体的效果很大程度上取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。由于组胺分子质量非常小（111.14 Da），得到高特异性针对其的抗体一直是有关学者致力解决的难题。

1984年，Mital等人在《Agents and Actions》发表题为An attempt to produce an antibody of histamine and histamine derivatives的文章，他们首先尝试了用牛血清蛋白（BSA）-丁二酰组胺偶联物作为免疫原去免疫大白兔，得到的血清含有抗BSA的抗体，没检测到识别半抗原（组胺）的抗体；接着，他们又将BSA与对-[2-(N-三氟乙酰组胺)偶氮基]苯甲酸偶联免疫兔子，得到了对三氟乙酰组胺有一定识别的抗体，然而该抗体对含三氟乙酰基的化合物都有一定的识别，不适合用于建立免疫分析方法。1986年，Guesdon等人在《Journal of Immunological Methods》发表题为Monoclonal anti-histamine antibody: preparation,characterization and application to enzyme immunoassay of histamine的文章，他们选择通过对苯醌将组胺与BSA偶联免疫Balb/c小鼠得到一株分泌针对组胺与苯醌复合物的单克隆抗体的杂交瘤细胞；该抗体对组胺苯醌复合物的亲和力达到约1.3×10⁹ L/mol。但是，采用对苯醌与组胺衍生化副反应很多，反应过程不好控制，且产物稳定性不好，导致重复性差。1988年，Morel等人在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》发表题为“Immunoanalysis of histamine through a novel chemical derivatization”的文章，他们用琥珀酰甘氨酰亚胺作衍生试剂，衍生组胺，并制备了针对该衍生物的单克隆抗体，该抗体与衍生物的亲和力比组胺本身高5×10⁵倍，并与其他类似物不存在交叉反应，但是该衍生方法的步骤多，操作复杂，产物纯化难度很大。因此，可以看出：目前检测组胺的免疫检测方法都是通过测定组胺的衍生物来实现的，衍生剂主要选择对苯醌或琥珀酰甘氨酰亚胺，选择这两种衍生剂的主要问题在于衍生效率较低、副反应多、反应步骤多、产物难以纯化等，因此对于准确、快速检测食品中的组胺十分不利，急需解决其衍生剂的选择等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统组胺检测技术中抗体制备效价低、重复性差的缺陷，提供一种组胺半抗原、人工抗原和特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供所述组胺半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述组胺半抗原、人工抗原和特异性抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种组胺半抗原、人工抗原和特异性抗体，所述组胺半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：

；

其中，n=0～6，Y=COOH、NO₂。

所述组胺人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：

；；

其中，n=0～6。

本发明提供了所述组胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：将组胺二盐酸盐与具有式（Ⅴ）所示分子结构的苯甲酰氯衍生物经亲核取代后得具有式（Ⅰ）所示组胺半抗原；

其中，n=0～6，X=COOCH₃、NO₂；

或者将组胺与具有式（Ⅵ）所示分子结构的带羧基的苯甲醛衍生物缩合后得到具有式（Ⅱ）所示组胺半抗原，

其中，n=0～6。

上述方法具体通过以下步骤来实现：

将具有式（Ⅴ）所示分子结构的苯甲酰氯衍生物的甲苯溶液滴加到含组胺二盐酸盐的NaOH溶液，室温搅拌1h，过滤，沉淀用NaOH溶液洗涤；对于Y为NO₂的半抗原，沉淀即为对应的半抗原；对于Y为COOH的衍生物，将上述得到的沉淀溶于KOH的甲醇溶液，30℃下搅拌1h后，加适量蒸馏水淬灭反应，旋蒸除去其中的甲醇溶液，所得溶液用浓盐酸调pH至1～2即有沉淀生成，过滤，烘干沉淀即为Y为COOH的半抗原；所述组胺二盐酸盐与苯甲酰氯衍生物的质量比为1:1～2

其中，n=0～6；X=COOCH₃、NO₂；

或者将组胺慢慢加入到具有式（Ⅵ）所示分子结构的带羧基的苯甲醛衍生物的甲醇溶液，室温搅拌过夜，过滤，沉淀用甲醇洗两遍，烘干即为产物；所述组胺与苯甲醛衍生物的质量比为1:1.5～2

其中，n=0～6。

本发明所述组胺人工抗原的制备方案如下：采用活泼酯法将权利要求1具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构的组胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到。

具体实施步骤如下：

将具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构的组胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后得上清液；将上清液缓慢加入载体蛋白的PBS（pH8.0）缓冲溶液中，4 ℃下反应12 h；离心后，取上清夜，4 ℃下用生理盐水透析3天得到目的产物；所述组胺半抗原与载体蛋白的质量比为1~2:1；

优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。

本发明同时提供所述组胺特异性单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体，以及所述组胺人工抗原和特异性抗体在组胺免疫检测方面的应用。

本发明的有益效果是：

现有的组胺检测技术以仪器法居多，而仪器法操作繁复，前处理复杂，成本高，不适应用现场大批量样品的检测。现有的免疫检测方法分为：直接法，即检测组胺本身，间接法，即检测组胺的衍生物。直接法所采用的抗体是将以组胺自身为半抗原，与载体蛋白偶联后制备获得的抗体，存在效价低、特异性差及重复性差等不足。间接法，所用的抗体，特异性明显增强，但是存在衍生试剂与组胺反应得到的产物纯化困难，衍生试剂不易制备的问题。本发明提供了几种组胺半抗原、抗原及其制备方法与应用。其思路是将组胺与带苯环的化合物衍生，获得分子量增大且结构特征明显的衍生物，以该衍生物为半抗原，进而制备抗原，免疫动物获得特异性抗体。该抗体可以特异性识别组胺的衍生物，检测组胺之前可以先将组胺与带苯环的化合物衍生成半抗原，再利用其抗体检测半抗原浓度，进而推算出组胺的浓度。该思路的有益效果体现在：（1）引入苯环结构使得组胺的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；（2）所使用带苯甲酰氯结构的衍生试剂可以与组胺的氨基快速、亲核取代反应，衍生效率高，时间短，重复性好；（3）本发明提供的组胺的快速检测方法最低检测限可达0.65～4 ng/mL。

附图说明

图1.组胺半抗原BⅠA(n=0,Y=COOH)及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图2.组胺半抗原BⅠA(n=0,Y=COOH)及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图3.组胺半抗原BⅡ(n=0)及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图4.组胺半抗原BⅡ(n=0)及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图5.以BⅠ(n=0,Y=COOH)为半抗原所制备的抗体对半抗原BⅠ(n=0,Y=COOH)的抑制曲线。

图6.以BⅡ(n=0)为半抗原所制备的抗体对半抗原BⅡ(n=0)的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

半抗原BⅠA(n=0，Y=COOH的制备方法

S1.取1.8 g（10 mmoL）对苯二甲酸单甲酯，放入到50 mL的圆底烧瓶，加入10 mL（135 mmoL）二氯亚砜，在70℃下回流1 h，常压蒸馏，除去过多的二氯亚砜，然向残留物中加10 ml 二氯甲烷，旋转蒸发，重复三次，除尽过多的二氯亚砜，得到1.7g白色固体，产率约85%；取组胺二盐酸盐1.38 g（7.5 mmoL）溶于10 mL15%的NaOH溶液，将上述得到的白色固体1.7 g（8.5 mmoL）溶于10 mL乙腈，并滴加到组胺二盐酸盐的NaOH溶液中（组胺二盐酸盐的NaOH溶液的配置方法为：称取0.92 g组胺二盐酸盐（5 mmoL）溶于10 mL 15%的NaOH溶液，室温搅拌1h，过滤沉淀用NaOH溶液洗涤，烘干得到1.64 g（6.6 mmoL）淡黄色固体，产率80%。

S2.取上述淡黄色固体1.5 g（7.5 mmoL）溶液10 mL的甲醇，加1.2 g（21 mmoL）KOH，室温（25~35℃）搅拌反应1 h后，加10 mL蒸馏水淬灭反应，旋蒸除去甲醇，所得溶液用浓盐酸调pH至1～2有白色沉淀析出，过滤，用0.1M HCl洗涤，烘干即得1.27 g 产物，产率为90%。ESI-MS analysis (negative) m/z 258[M-H]-; 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 8.54 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.12 – 8.05 (m, 2H), 7.90 – 7.82 (m, 2H), 7.27 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 3.72 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H).

半抗原BⅠB(n=0),Y=NO₂的制备

取组胺二盐酸盐0.92 g（5 mmoL）溶于10 mL15%的NaOH溶液，称1.84 g（10 mmoL）4-硝基苯甲酰氯(NBZ-Cl)溶于10 mL乙腈中，将其滴加到上述组胺二盐酸盐的NaOH溶液中室温搅拌1h，过滤，并用0.1M的NaOH溶液洗涤沉淀烘干，得到1.1 g黄色固体，即为产物，产率84%。ESI-MS analysis (negative) m/z 261[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 8.33 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 4.86 (s, 79H), 4.59 (s, 1H), 3.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 3.3, 1.7 Hz, 34H), 2.93 (t, J = 7.2 Hz, 2H).

实施例2 半抗原BⅡ(n=0)的制备方法

在50 mL的圆底烧瓶中加入对醛基苯甲酸0.9 g（6 mmoL），缓慢加入甲醇直至溶解，搅拌中加入0.55 g（5 mmoL）组胺，室温搅拌过夜，反应过滤，甲醇洗两遍，得到1.1 g目标产物，产率（89%）。ESI-MS analysis (positive) m/z 244[M+H]+; 1H NMR (600 MHz, ) δ 8.37 , 7.98 (d, J = 8.0 Hz), 7.80 (d, J = 8.0 Hz), 7.51 , 6.76 , 3.87–3.81 (m), 2.85 (t, J = 7.3 Hz).

实施例3 免疫原/包被原的制备

免疫原与包被原的制备不同之处在于载体蛋白，所述免疫原载体蛋白采用牛血清蛋白（BSA），所述包被原载体蛋白采用卵清白蛋白（OVA）。以下所述以免疫原的制备方法为例。

活泼酯法：取半抗原BⅠA(n=0，Y=COOH)或者BⅡ （n=0）0.1 mmoL溶于0.5 mL DMF中，搅拌加入0.0512 g (0.2 mmoL) DCC和0.023 g (0.2 mmoL) NHS，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液。称取BSA或OVA 0.02 g溶于2 mL浓度为0.1 mol/L的PBS (pH8.0)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4 ℃下反应12 h。离心后，取上清夜，4 ℃下用生理盐水透析3 d，每天更换4次透析液。得到的免疫原BⅠA-BSA、BⅡ-BSA或包被原BⅠA-OVA 、

BⅡ-OVA以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中。冻存于-20 ℃冰箱中，供免疫用。

对载体蛋白，半抗原BⅠA(n=0，Y=COOH)、半抗原BⅡ(n=0)及其相应的免疫原和包被原进行紫外扫描测定（200～400 nm），发现免疫原和包被原同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰（图1和图2），说明免疫抗原和包被抗原偶联成功。

实施例4 抗体的制备及鉴定

将免疫原与等剂量的免疫佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂, 以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂）用搅拌器乳化。完全乳化后, 采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6 只体重为2.5～3 kg 的健康新西兰大白兔。第一次免疫隔一个月后每两周加强免疫一次。第4 次加强免疫后1 周耳缘静脉采血, 并利用间接ELISA 测定血清效价。当效价不再上升时, 采用耳缘静脉加强免疫。1 周后心脏采血, 室温静置0.5～1 h, 于4 ℃冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-20 ℃下保存备用。

间接竞争ELISA 测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，结果表明以半抗原BⅠA(n=0，Y=COOH)对应的抗血清（Ab-BⅠA）效价为1:128000，以半抗原BⅡ(n=0)对应的抗血清（Ab-BⅡ）效价为1:128000。

实施例5 抗体的特异性及灵敏度

依据如上效果，使用抗血清（Ab-BⅠA）和抗血清（Ab-BⅡ）绘制酶联免疫分析（ELISA）标准曲线；使用磷酸盐吐温缓冲液（PBST, 100 mmol/L, pH 7.4）作为所有样品的稀释液；使用BⅡ-OVA作为包被原；将50 μL 系列浓度的药物标准品和50 μL适当稀释倍数的组胺多特异性抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值（OD）。以OD值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro 7.5 软件四参数对数函数进行曲线拟合：

（1）

其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大时的吸光值（OD），C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为（A＋D）/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC₅₀，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC₁₀为检测限，以IC₂₀～IC₈₀为检测范围。以BⅠB(n=0、X=NO₂)为标准品，建立ELISA的标准曲线，结果如图5和图6，相关标准曲线参数见表1和表2。结合附图及附表可知，以BⅠB（n=0、X=NO₂）为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度较好。由于样品中的组胺与带硝基的苯甲酰氯衍生物可以快速、高效发生衍生反应，因此该方法可以用于间接检测食品中组胺的含量。

表1 抗血清（Ab-BⅠA）对半抗原BⅠA(n=0，Y=COOH)的检测参数

表2 抗血清（Ab- BⅡ）对半抗原BⅡ(n=0)的检测参数

表3 抗血清（Ab-BⅠA）对半抗原BⅠB(n=0, Y=NO₂)及其结构类似的交叉反应率

表4 抗血清（Ab- BⅡ）对半抗原BⅠB(n=0, Y=NO₂)及其结构类似的交叉反应率

注：NBZ-Cl代表4-硝基苯甲酰氯。

Claims

1.一种组胺半抗原，其特征在于，具有式（Ⅱ）所示分子结构：

其中，n=0。

2.一种权利要求1所述组胺半抗原的制备方法，其特征在于，将组胺与具有式（Ⅵ）所示分子结构的带羧基的苯甲醛衍生物缩合后得到具有式（Ⅱ）所示组胺半抗原，

其中，n=0。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将组胺加入到具有式（Ⅵ）所示分子结构的带羧基苯甲醛衍生物的甲醇溶液，室温搅拌过夜，过滤，用甲醇洗涤沉淀，烘干即得；所述组胺与苯甲醛衍生物的质量比为1:1.5～2

其中，n=0。

4.一种组胺人工抗原，其特征在于，具有式（Ⅳ）所示分子结构：

；

其中，n=0。

5.一种权利要求4所述组胺人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将权利要求1具有式（Ⅱ）所示分子结构的组胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将具有式（Ⅱ）所示分子结构的组胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后得上清液；将上清液缓慢加入载体蛋白的PBS，pH8.0缓冲溶液中，4 ℃下反应12 h；离心后，取上清液，4 ℃下用生理盐水透析3天得到目的产物；所述组胺半抗原与载体蛋白的质量比为1~2:1。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。

8.一种权利要求4所述人工抗原在制备组胺抗体或在检测组胺中的应用。

9.一种采用权利要求4 所述人工抗原制备得到的组胺单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

10.一种权利要求9所述抗体在检测组胺中的应用。