CN101870731A - 双甲胺草磷(h-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用，多克隆抗体是由半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得免疫抗原，免疫新西兰大白兔后获得，其特征在于：半抗原为设计合成的分子结构式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物，并引入羧基制备半抗原；其次，采用活性酯法将半抗原与载体蛋白偶联获得完全抗原；经动物免疫获得多克隆抗体，建立了ELISA检测方法，本发明可对水体样本中双甲胺草磷(H-9201)农药残留进行检测。其优点是：双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备可以用于水体中的双甲胺草磷(H-9201)农药残留进行快速，大量样本的筛查。

Description

双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种双甲胺草磷(H-9201)多克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术：

双甲胺草磷(H-9201)是由我国自主研发的，具有独立知识产权的一种新型农用除草剂，该化合物是利用活性与构效关系(QSAR)预测了其活性，并合成的新化合物，其化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-N-异丙基硫代磷酰胺酯，分子量为318.5，是一种硫化磷酰胺酯类化合物，商品名为双甲胺草磷。该化合物是一种内吸传导型选择性土壤处理水旱两用除草剂，可用于大豆、水稻、小麦、玉米、蔬菜等作物，防除多种一年生单、双子叶杂草，杀草谱广，且可与多种除草剂品种复配，田间药效试验未发现对后茬作物生长的影响，是一种具有广泛应用价值的新型除草剂品种。

目前对双甲胺草磷(H-9201)残留检测的研究报道仅见气相色谱法(参见张存政，张志勇，刘媛，王冬兰，刘贤进.新型除草剂双甲胺草磷(H-9201)在胡萝卜和土壤中的残留动态研究.分析科学学报，2007，23(3)：337-339.)，有关双甲胺草磷(H-9201)的抗体制备以及免疫分析法及其在残留检测中的应用，国内外均未见文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前双甲胺草磷(H-9201)抗体匮乏，提供一种半抗原为设计合成的结构为分子式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明的目的是这样实现的：一种双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，由半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得免疫抗原，免疫新西兰大白兔后获得，其特征在于：半抗原是由的双甲胺草磷过渡态类似化合物引入羧基制备，所述双甲胺草磷过渡态类似化合物为分子结构式(4)，

化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-氨基硫代磷酰胺酯，分子量为：276.249。

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体中，适合动物免疫的半抗原-载体蛋白偶联物的结构为分子式(1)，

其中，R为BSA或OVA。

它是以设计合成的双甲胺草磷过渡态类似化合物为半抗原，以琥珀酸酐为桥梁，使一个羧基与半抗原的氨基联结，继尔以活性酯法使之与载体蛋白偶联后获得的：

上述设计合成的双甲胺草磷过渡态类似化合物的合成具体步骤如下：

(1)分子结构式(6)的甲氧基硫代磷酰二氯的合成

三氯硫磷预冷后，缓慢滴加甲醇，溶液温度控制在-5℃以下，三氯硫磷∶甲醇的克分子比1∶5。甲醇滴加完毕后，持续搅拌15min。冰水洗涤溶液。分层后，取下层，获得甲氧基硫代磷酰二氯，-20℃保存，分子结构式(6)。

(2)分子结构式(5)化合物的合成

将30ml甲氧基硫代磷酰二氯、DMNT的丙酮混合液预冷至5～10℃，滴加三乙胺催化反应，监测pH约为6；将20％氢氧化钠水溶液，滴加到反应液当中，滴加完后pH约为12；反应体系中甲氧基硫代磷酰二氯∶DMNT∶NaOH的克分子比为1∶1∶1.1。反应溶液抽滤除去盐酸盐后保存滤液，获得含有结构为分子式(5)化合物的丙酮溶液。

(3)分子结构式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物的合成

将含有为分子结构式(5)化合物的丙酮溶液预冷至5～10℃，向其中滴加氨水。氨水滴加完后pH约为8，滴加40％的氢氧化钠水溶液至PH为10，脱去丙酮，加入30mL乙醚分两次萃取，水洗涤乙醚层，经无水硫酸镁干燥后，脱去乙醚。柱层析分离，取中间的组分，脱去溶剂，获得双甲胺草磷过渡态类似化合物，为分子结构式(4)。

上述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备，其特征在于：用活性酯法使半抗原与牛血清白蛋白偶联，合成免疫抗原，再将免疫抗原用于免疫新西兰大白兔，获得双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体。

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备中：活性酯法合成免疫抗原的步骤是：

0.5mM的双甲胺草磷过渡态类似化合物与0.8mM的琥珀酸酐乙腈溶液共10ml充分混匀，滴加0.5mM DMAP乙腈溶液，50℃搅拌反应2小时；终止反应后加入50ml蒸馏水，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后，脱去有机溶剂，获得分子结构式(3)的化合物，形成半抗原；向0.3mM分子结构式(3)化合物的二氯甲烷溶液中加入DMF溶解的0.23mM的NHS，0.33mM的DCC，0.033mM的DMAP，0℃搅拌反应过夜；次日10000g离心10min，弃去沉淀，脱去溶剂，以DMF溶解所得活化酯，分子结构式(2)，将活化酯溶液缓慢加入到5mL预冷的含有40mg牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为9.0，4℃反应过夜；

将反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得适合动物免疫的免疫抗原，如分子结构式(1)，将它们分装-20℃保存中备用；

将免疫抗原用于免疫新西兰大白兔，获得双甲胺草磷的多克隆抗体。

上述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用，其特征在于：将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA法对水体中双甲胺草磷(H-9201)的残留进行检测，检测中使用的包被抗原为半抗原通过活性酯法与卵清蛋白OVA的偶联物。

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用中：活性酯法合成包被抗原的步骤同前述与免疫抗原的BSA的合成过程，其区别仅在于在磷酸盐缓冲液中用卵清蛋白OVA替代牛血清白蛋白BSA；

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用中：多克隆抗体采用间接竞争性ELISA法对水体中双甲胺草磷(H-9201)的残留进行检测是指：将被测样品提取、净化后制备得到ELISA待测液，然后利用间接竞争性ELISA法进行检测，最后通过标准曲线计算出待测样品中的双甲胺草磷(H-9201)含量。

本发明的优点在于：双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备方法简单，可以用于对样本中的双甲胺草磷(H-9201)农药残留进行快速检测，适合大量样品快速筛查检测。

附图说明

图1是双甲胺草磷过渡态类似化合物的核磁共振图(NMR)；

图2是图1的局部放大图；

图3是双甲胺草磷过渡态类似化合物的液相色谱-质谱图(LC/MS)，其中a是化合物总离子流图，b是该化合物的多级质谱图；

图4是分子结构式(3)的化合物的液相色谱/质谱图(LC/MS)；

图5是双甲胺草磷(H-9201)半抗原(hapten)、BSA及偶联物(hap-bsa)的紫外扫描图谱；

图6是双甲胺草磷(H-9201)半抗原(hapten)、OVA及偶联物(hap-ova)的紫外扫描图谱；

图7是间接竞争ELISA法建立的双甲胺草磷(H-9201)检测标准抑制曲线。

具体实施方式

通过下述实施实例结合附图有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1.双甲胺草磷过渡态类似化合物的制备

以三氯硫磷与甲醇为原料，溶液温度控制在-5℃以下进行反应，冰水洗涤溶液留取下层，得到甲氧基硫代磷酰二氯。

在5～10℃丙酮溶液温控条件下，以三乙胺为催化剂，甲氧基硫代磷酰)与2，4-二甲基-6-硝基苯酚(DMNT)，氢氧化钠(NaOH)反应获得含有分子结构式(5)化合物的丙酮溶液。

将含有分子结构式(5)的化合物溶液预冷至5～10℃，向其中滴加氨水。氨水滴加完后pH约为8，滴加40％的氢氧化钠水溶液至PH为10，脱去丙酮，加入30mL乙醚分两次萃取，水洗涤乙醚层，经无水硫酸镁干燥后，脱去乙醚。柱层析分离，取中间的组分，脱去溶剂，获得双甲胺草磷过渡态类似化合物；TLC监控反应出现新的产物斑点(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)；经NMR，LC/MS鉴定结构与分子量正确，产率为78％。见图1～图3。

产物的¹H NMR数据：2.77(t，J＝7.2，3H，OCH2CH3)，2.04(s，3H，COCH3)，2.34(s，3H，PhCH3)，2.44(s，3H，PhCH3)，3.70(bd，3H，NH2)，3.77，3.80(ss，3H，OCH3)，4.09(q，J＝7.1，2H，OCH2CH3)，7.27(s，1H，PhH)，7.51(s，1H，PhH)

实施例2.分子结构式(3)的化合物的制备

0.5mM的双甲胺草磷过渡态类似化合物与0.8mM的琥珀酸酐乙腈溶液共10ml充分混匀，滴加0.5mM DMAP乙腈溶液，50℃搅拌反应2小时；终止反应后加入50ml蒸馏水，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁除水后，脱去有机溶剂，获得分子结构式(3)的化合物。其液相色谱/质谱鉴定图(LC/MS)见图4。

实施例3.抗原的合成

向含有0.3mM分子结构式(3)化合物的二氯甲烷溶液中加入0.23mM的NHS，0.33mM的DCC，0.033mM的DMAP，0℃搅拌反应过夜；次日10000g离心10min，弃去沉淀，脱去溶剂，以DMF溶解所得活化酯，将活化酯溶液缓慢加入到5mL预冷的含有40mg牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为9.0，4℃反应过夜；

反应结束后，将反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得分子结构式(1)的免疫抗原，分装并保存于-20℃冰箱中备用。如图5图6所示的紫外扫描图谱可见，半抗原(hapten)、载体蛋白(BSA或OVA)的最大吸收峰分别为260nm和278nm，而偶联物(hap-bsa或hap-ova)的最大吸收峰介于260nm～278nm之间，初步证明偶联成功。在图5中，由上至下分别为半抗原，BSA，偶联物；在图6中，由从上至下分别为半抗原，偶联物，OVA。

实施例4.双甲胺草磷(H-9201)多克隆抗体的制备

用合成的偶联物作为免疫抗原Hapten-BSA，选取2只1.5～2.0kg的纯种新西兰大白兔作为试验动物，进行皮下多点注射免疫，试验前一周采集阴性血清。首次免疫采用1mg免疫原与弗氏完全佐剂等体积混和，背部皮下多点注射。三周后用同样剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂进行加强免疫，每两周加强1次，共加强4次。最后一次免疫用2mg免疫原与等体积的生理盐水混合，耳缘静脉注射。七天后心脏采血，血液4℃放置过夜，凝结后吸取清，40％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清，沉淀用PH7.4的磷酸缓冲液溶解，超滤管脱盐纯化血清后，即得多克隆抗体。

实施例5间接非竞争ELISA法测定抗体的滴度及工作浓度

(1)工作浓度的确定

方阵滴定法确定抗体及包被抗原的工作浓度。选择OD值为1.0时的抗原抗体稀释浓度作为包被抗原抗原、抗体工作浓度，最终选择的包被抗原稀释倍数为1/512(以蛋白计，包被抗原实际浓度为2.3μg/mL)，抗体的工作浓度为1/18,000。具体操作步骤如下：

①包被：CBS包被缓冲液将包被抗原倍比稀释2ⁿ(n＝7，8，9，10)4组，分别加于96孔酶标微孔板的A和B、C和D、E和F、G和H的四组八行中，100μL/孔，4℃过夜。

②封闭：每孔加1％OVA封闭液200μL，37℃孵育1h。

③加样：将倍比稀释的六组抗体分别加于酶标板的1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12的六组十二列孔中，100μL/孔，以阴性血清作对照，PBS溶液为空白，37℃孵育2h。

④加酶标二抗：用含1％OVA的PBS溶液稀释酶标二抗到工作浓度，100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h。

(以上每一步结束都用PBST洗涤液洗3次)

⑤显色：将底物溶液加到酶标板上，100μL/孔，37℃显色15min。

⑥终止反应：将2M H2SO4快速加到96孔中，50μL/孔，450nm读取光吸收值。

(2)效价的测定

用方阵滴定法确定的包被原工作浓度包被96孔酶标微孔板，将抗血清(阳性血清)和阴性血清进行倍比稀释，以PBS溶液作为空白对照，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，具体步骤按照以下步骤进行。以A阳/A阴＞2.1的最大稀释倍数作为抗体的最终效价。抗体计算获得的最终效价为1/102,400。具体操作步骤如下：

①包被：CBS包被缓冲液将2μg/ml包被原倍加入96孔酶标微孔板中，100μL/孔，4℃过夜。

②封闭：每孔加1％OVA封闭液200μL，37℃孵育1h。

③加样：将倍比稀释1000×2ⁿ(n＝7，8，9，10，11，12)的六组抗体分别加于酶标板的1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12的六组十二列孔中，100μL/孔，以阴性血清作对照，PBS溶液为空白，37℃孵育2h。

④加酶标二抗：用含1％OVA的PBS溶液稀释酶标二抗到工作浓度，100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h。

(以上每一步结束都用PBST洗涤液洗3次)

⑤显色：将底物溶液加到酶标板上，100μL/孔，37℃显色15min。

⑥终止反应：将2M H2SO4快速加到96孔中，50μL/孔，450nm读取光吸收值。

当光吸收值低于0.2时为阴性血清；当光吸收值高于0.2时为阳性血清。

实施例6.间接竞争ELISA(IC-ELISA)的建立

具体步骤如下：

(1)抗体与标样(待测样)预混：用含有10％(v/v)甲醇的PBS缓冲液配置不同浓度的双甲胺草磷(H-9201)标样，浓度分别为0.05μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml。用PBS将抗体稀释9000倍(两倍工作浓度)，再与等体积的标样(待测样品)室温预混进行前抑制，对照用PBS与抗体等体积预混，过夜。

(2)包被：CBS缓冲液将2ug/ml包被抗原，100μL/孔分别加入酶标板，4℃过夜。

(3)封闭：每孔加封闭液200μL，37℃温浴1h。

(4)加样品：将预混液加入酶标板，100μL/孔，以PBS为空白对照，37℃温浴2h。

(5)加酶标二抗：用含1％OVA的PBS将酶标二抗稀释到工作浓度加入酶标板，100μL/孔，37℃温浴1h。

(以上每一步结束都用洗涤液PBST洗3次)

(6)显色：将底物溶液加到酶标板上，100μL/孔，37℃显色15min。

(7)终止反应：50μL/孔2M H₂SO₄快速加到96孔酶标板中，于450nm读取光吸收值。

将不同浓度双甲胺草磷(H-9201)标样对应的吸光值(OD)结果，按照公式抑制率(I)＝100[(OD对照-OD标样)/OD对照]，计算抑制率(I)。以抑制率为纵坐标，标样浓度(C)为横坐标绘制标准抑制曲线。建立双甲胺草磷(H-9201)的标准抑制曲线(如图5所示)，并对线性范围进行回归分析。计算得到，双甲胺草磷(H-9201)对抗体的抑制中浓度(I₅₀)为1.554μg/mL，双甲胺草磷(H-9201)最低检测限I₁₀为0.0945μg/mL，线性检测范围在0.1524～12.4135μg/mL。见图8。

实施例7.本发明对水体中双甲胺草磷(H-9201)农药残留的检测

具体操作如下：

(1)样品提取：采集田间无污染的水沉淀杂质，过0.45um微孔滤膜后备用，分别取10ml水样，添加双甲胺草磷(H-9201)标样(用含有10％甲醇(v/v)的PBS溶液配置)，使得样品中双甲胺草磷(H-9201)的含量分别为1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg五个水平，第六组添加甲醇作为空白对照，每组重得4次，室温下放置2小时。水样中加入2g NaCL，3ml X 3正己烷提取，合并提取液后，氮气浓缩至干，用PBST缓冲液稀释至检测浓度范围，进行ELISA检测。

(2)ELISA检测方法

用间接竞争性ELISA方法测定，将添加样品的提取液与等体积抗体预混两小时，根据实施例6的步骤进行间接竞争性ELISA测定，计算水体中双甲胺草磷(H-9201)的残留量及添加回收率及变异系数。

结果表明，当水体中双甲胺草磷(H-9201)浓度在1mg/kg-20mg/kg的范围内，添加回收率为72.5±5.5％～85.2±4.3％。

以上各实施例不是对本发明的具体限定。

Claims (7)

1.一种双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，由半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得免疫抗原，免疫新西兰大白兔后获得，其特征在于：半抗原是由的双甲胺草磷过渡态类似化合物引入羧基制备，所述双甲胺草磷过渡态类似化合物为分子结构式(4)，

其化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-氨基硫代磷酰胺酯，分子量为：276.249。

2.根据权利要求1所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，其特征在于：所述的双甲胺草磷过渡态类似化合物是这样合成的：

1)以三氯硫磷与甲醇为原料，溶液温度控制在-5℃以下进行反应，冰水洗涤溶液留取下层，得到甲氧基硫代磷酰二氯，为分子结构式(6)：

2)在5～10℃丙酮溶液温控条件下，以三乙胺为催化剂，甲氧基硫代磷酰二氯与2，4-二甲基-6-硝基苯酚(DMNT)，氢氧化钠(NaOH)反应获得含有分子结构式(5)化合物的丙酮溶液，

3)在5～10℃溶液温控条件下，向预冷的含有分子结构式(5)化合物的丙酮溶液中滴加氨水，以氢氧化钠调节溶液pH为10进行反应，得到双甲胺草磷过渡态类似化合物，分子结构式(4)。

3.根据权利要求1或2所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，其特征在于：适合动物免疫的半抗原-载体蛋白偶联物，如分子结构式(1)，

其中，R为BSA或OVA

4.一种如权利要求1所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：

a)以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，使所述分子结构式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物与琥珀酸酐(Succinic anhydride)在50℃温控乙腈溶液中反应，获得分子结构式(3)的化合物，形成半抗原，

b)在温控为0℃的除水的二氯甲烷溶液中，以DMAP为催化剂的条件下，分子结构式(3)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)反应过夜，获得溶有分子结构式(2)的化合物活化酯，

c)以pH为9的溶有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与溶有分子结构式(2)的化合物活化酯的DMF溶液在4℃温度条件下反应过夜，获得含有分子结构式(1)的半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液；

d)将含有半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得免疫抗原；

e)再将免疫抗原用于免疫新西兰大白兔，获得双甲胺草磷的多克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：免疫新西兰大白兔前，d步骤获得的免疫抗原应该分装保存于-20℃冰箱中备用。

6.一种如权利要求1所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用，其特征在于：将多克隆抗体建立的间接竞争性ELISA法对水样中双甲胺草磷(H-9201)农药的残留进行检测，检测中使用的包被抗原是这样获得的：

在权利要求4所述多克隆抗体的制备方法的a～b步骤的基础上，以pH为9的溶有卵清蛋白OVA的磷酸盐缓冲液，与溶有分子结构式(2)的化合物活化酯的DMF溶液在4℃温度条件下反应过夜，获得含有分子结构式(1)的半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液；

将含有半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得包被抗原。

7.根据权利要求6所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用，其特征在于：多克隆抗体采用间接竞争性ELISA法对水样中双甲胺草磷(H-9201)农药的残留进行检测是指：将被测水样经简单过滤净化处理、提取后制备得到ELISA待测液，然后利用间接竞争性ELISA法进行检测，计算得出待测样品中的双甲胺草磷(H-9201)含量。

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