CN101135683A - 联苯菊酯抗原、抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联苯菊酯抗原、抗体及其应用，属于免疫化学分析技术领域，专用于联苯菊酯特异性抗体的制备及酶联免疫检测方法。合成了半抗原2－甲基－3－苯基苄基丁二酸酯(简称LBc)和2－甲基－3－苯基苯甲酸(简称LBy)，再将LBc与蛋白质偶联制备人工免疫抗原，免疫兔子获得联苯菊酯的特异性多克隆抗体，然后将LBy与蛋白质偶联制备包被抗原，最后利用合成的包被抗原和特异性抗体建立酶联免疫分析方法，联苯菊酯检测限达0.016mg/L，线性范围为0.01～50mg/kg，对大部分拟除虫菊酯及其代谢产物无明显的交叉反应。

Description

联苯菊酯抗原、抗体及其应用

一、技术领域

本发明涉及一种联苯菊酯抗原、抗体及其应用，属于免疫化学分析技术领域，专用于联苯菊酯特异性抗体的制备及酶联免疫检测方法。

二、背景技术

联苯菊酯(bifenthrin)，商品名天王星，1978年美国富美实公司(FMC)发表了合成专利，1988年在中国登记，化学名称及结构见下图，纯品为类白色固体mp：68～70℃，水中的溶解度度为0.1mg/L(25℃)，在酸性条件下稳定。是拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，具有胃毒和触杀作用，持效期较长，可用于防治农作物害虫、家庭白蚁、羊毛虫等，是菊酯类农药中唯一能用于防治茶园害虫的药剂。

目前对联苯菊酯的残留分析主要是气相色谱法，该方法检测费用高，不适合进行批量样品的快速检测。而农药残留免疫分析技术是免疫分析应用于农药残留分析领域的一门新技术，以其简单、快速、廉价，特别适用大批量样品检测等优点得到了全面迅速发展，美国化学会(AOAC)已将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为农药残留检测的三大支柱技术。但到目前为止，联苯菊酯的免疫分析方法，国内外尚未见报道。

联苯菊酯的结构

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种联苯菊酯特异性抗体的制备及酶联免疫分析方法。

技术方案

联苯菊酯人工半抗原的分子结构式为：

2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯(LBc)              2-甲基-3-苯基苯甲酸(LBy)

人工半抗原2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯的制备方法步骤为：

1)取0.5～5g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入5～15mL无水吡啶，0.3～3g丁二酸酐，40～50℃避光磁力搅拌反应10～12h。

2)反应后的混合液在3.6％盐酸和乙酸乙酯间进行分配，取乙酸乙酯层。

3)乙酸乙酯层再用水洗，上层过无水Na₂SO₄，浓缩近干。

4)柱层析法纯化，石油醚湿法装柱，收集洗脱液为95∶5的氯仿：甲醇洗脱相，，浓缩近干得LBc白色晶体。

人工半抗原2-甲基-3-苯基苯甲酸的制备方法步骤为：

1)取0.2～2g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入0.5～1g18—冠醚—6，加入15～30mL丙酮溶解，在冰浴条件下，将2.8g高锰酸钾研细后的粉末分批加入，搅拌反应5h。

2)将反应后的混合物抽滤，用少量丙酮洗滤饼，滤饼风干后，放入研钵内，加入适量的饱和NaHCO₃，研磨，过滤除去MnO₂，

3)滤液用浓盐酸酸化，乙醚萃取，水洗，有机相过无水Na₂SO₄，浓缩近干。

4)柱层析法纯化，收集洗脱液为氯仿的洗脱相，浓缩得LBy白色晶体。

联苯菊酯人工抗原的分子结构式为：

免疫原LBc-BSA                        包被抗原LBy-OVA

人工抗原的合成

免疫原的合成采用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔的半抗原LBc溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环已基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液加入到10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

包被抗原的合成利用混合酸酐法。分别将0.25毫摩尔半抗原LBy溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

用上述联苯菊酯抗原制备获得联苯菊酯特异性抗体，联苯菊酯特异性抗体是能与联苯菊酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。它用于检测食品、农产品和环境样品(如土壤与水样)中联苯菊酯的残留量。

有益效果本发明通过设计合成联苯菊酯人工半抗原和人工抗原，经免疫动物产生特异性抗体，经纯化制成冻干粉后的效价为5.12×10⁵。以抗原抗体特异性免疫学反应为基础，并引入标记物来放大显示这一反应，则可用于样本测定。其选择性取决于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。

抗体对一些类似农药的交叉反应率：氟氯氰菊酯为1.6％，溴氰菊酯为1.5％，氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯均<1％。从而可知，所制备的抗体特异性较强，可快速准确地分析检测联苯菊酯在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。

该方法可用于环境样品中联苯菊酯的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量筛选。该方法联苯菊酯的回收率为82.6～104.4％，平均变异系数为4.30～7.35％，符合残留分析标准。

四、具体实施方式

1联苯菊酯人工半抗原的合成

基于2-甲基-3-苯基苄基醇是联苯菊酯分子结构中的主要组成部分，并能使该结构特征充分暴露且含有能与蛋白质偶联的羧基，以2-甲基-3-苯基苄基醇、丁二酸酐和无水吡啶为原料，经一步反应合成了半抗原2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯(简称LBc)。为使能通过异源反应提高检测灵敏度，以2-甲基-3-苯基苄基醇、18—冠醚—6和高锰酸钾为原料，合成了半抗原2-甲基-3-苯基苯甲酸(简称LBy)。产物LBc和LBy纯化后分别经质谱(ESI)和核磁共振氢谱(¹H-NMR)鉴定，并与类似已知的化合物数据比较确证。

半抗原的结构如下：

2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯(LBc)               2-甲基-3-苯基苯甲酸(LBy)

半抗原LBc的合成

1)取0.5～5g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入5～15mL无水吡啶，0.3～3g丁二酸酐，40～50℃避光磁力搅拌反应10～12h。

2)反应后的混合液在3.6％盐酸和乙酸乙酯间进行分配，取乙酸乙酯层。

3)乙酸乙酯层再用水洗，上层过无水Na₂SO₄，浓缩近干。

4)柱层析法纯化，石油醚湿法装柱，收集洗脱液为95∶5的氯仿：甲醇洗脱相，浓缩得LBc白色晶体。

将纯化后的半抗原LBc分别经ESI-MS、¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)(Finnigan，LC-MS)测定，以鉴定其分子结构。半抗原LBc的ESI-MS准分子离子峰为321(M+23)。¹H-NMR，δ：7.15-7.39(m，-ArH)，5.15(s，CH₂O)，2.64(m，CH₂CH₂)，2.15(s，CH₃)。

从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。

半抗原LBy的合成：

1)取0.2～2g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入0.5～1g 18—冠醚—6，加入15～30mL丙酮溶解，在冰浴条件下，将2.8g高锰酸钾研细后的粉末分批加入，搅拌反应5h。

2)将反应后的混合物抽滤，用少量丙酮洗滤饼，滤饼风干后，放入研钵内，加入适量的饱和NaHCO₃，研磨，过滤除去MnO₂，

3)滤液用浓盐酸酸化，乙醚萃取，水洗，有机相过无水Na₂SO₄，浓缩近干。

4)柱层析法纯化，收集洗脱液为氯仿的洗脱相，浓缩得LBy白色晶体。

将纯化后的半抗原LBy分别经ESI-MS、¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)测定，以鉴定其分子结构。半抗原LBy的ESI-MS准分子离子峰为235(M+23)，¹HNMR，δ：7.25-7.62(m，-ArH)，2.49(s，CH₃)。

从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。

2.人工抗原的合成

人工抗原的结构式如下：

免疫原LBc-BSA                         包被抗原LBy-OVA

2.1免疫原的合成与纯化

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔半抗原LBc，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环已基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

2.2包被抗原的合成与纯化

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将0.25毫摩尔半抗原LBy分别溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

2.3人工抗原的鉴定

按照合成联苯菊酯免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。偶联物与半抗原LBc、LBy、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原LBc-BSA和LBy-OVA的合成是成功的。

经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：

LBc-BSA 10-40∶1        LBy-OVA 2～10∶1

3.抗体的制备

3.1免疫动物制备抗血清

实验选用半周岁左右，体重为2-3公斤，健康的雄性新西兰大白兔。免疫三只兔子(由江苏省农科院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1-3。

实验免疫剂量基础免疫为0.25～4.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释相应剂量免疫原复合物(LBc-BSA)，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。

本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后，然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离，放置于37℃温箱中半小时，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15分钟，分离出血清。

3.2抗体的纯化与鉴定

一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。

3.3抗体效价测定

免疫原复合物(LBc-BSA)按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，经纯化制成冻干粉后的效价为5.12×10⁵。

4联苯菊酯酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定

4.1联苯菊酯ELISA测定方法的原理

采用间接竞争酶联免疫分析方法。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体，固相抗原中的农药，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗原上的抗体就少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，显色反应就减弱，抑制率增高，反之，则显色反应增强，抑制率减低，因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。

4.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定

选择包被抗原LBy-OVA和抗体用方阵滴定法，同时稀释抗体和固相抗原包被液。

在同一包被液浓度下，随着抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。经试验，包被抗原浓度1.5μg.mL^-1，抗体浓度以50μg.mL^-1作为最适工作浓度

4.3标准曲线和检测灵敏度

4.3.1标准曲线的制备，其基本的操作步骤如下：

4.3.1.1包被

1)包被抗原溶液的配制

从低温冰箱中取出Q-OVA偶联复合物，使之完全解冻后，稀释成相应工作浓度。

2)微量反应板的包被

96孔聚苯乙烯微量反应板用PBST洗涤后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃温箱中温育2h，弃去孔内液体，用300ul PBST溶液洗涤5次，拍干。

4.3.1.2封闭

取出包被好的微量反应板，甩掉包被液，用PBST洗涤后，每孔加入1.0％的OVA200μL，于37℃温箱中温育0.5h，弃去孔内液体，用300ul PBST溶液洗涤5次，拍干。

4.3.1.3点板

1)配制联苯菊酯的标准溶液

取联苯菊酯标样配制100ppm的标准溶液，用PBS稀释成若干(5～8)个浓度，使每个浓度溶液中含有30％的甲醇。

2)联苯菊酯抗体稀释液的配制

从冰箱中取出抗体，用PBS稀释成工作浓度。

3)点板

取出经封闭的板，经200ul PBST洗涤5次后，每孔加入系列浓度的联苯菊酯标准液50μL，再加入抗体稀释液50μL，对照孔加入含30％甲醇的PBS50μL和抗体稀释液50μL。放入37℃温箱中温育1h，弃去孔内液体，用300ul PBST溶液洗涤5次，拍干。

4.3.1.4加酶标二抗

每孔加入经1∶2000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBS溶液100μL，放入37℃温箱中1h，弃去孔内液体，用200ul PBST溶液洗涤5次，拍干。

4.3.1.5显色

每孔加入底物OPD-过氧化氢溶液100μL，37℃温箱中温育15min，用50μL 2MH₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：

式中：OD_max为不加药时的吸光值，OD_x为农药x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得联苯菊酯各浓度的抑制率，以联苯菊酯浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图。联苯菊酯在0.01ppm～50ppm范围内，抑制率与联苯菊酯浓度呈线性关系，相关系数为r＝0.9936。联苯菊酯的抑制中浓度为2.16mg/L，最低检测限为0.016mg/L，

4.4抗体的特异性

抗血清的特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性则越好。

将联苯菊酯及其类似物做系列稀释，分别与同一种抗体竞争反应，按制4.3的方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量，然后计算出各类似物的交叉反应率。

抗体对一些类似农药的交叉反应率：氟氯氰菊酯为1.6％，溴氰菊酯为1.5％，氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯均<1％。

从而可知，所制备的抗体特异性较强。

5环境样品快速测定

5.1提取方法

5.1.1水样

水样(或经过滤)可直接检测

5.1.2土壤或植物样品

(1)称取土壤或植物样品10g，装入三角瓶中。

(2)配制三个不同水平的联苯菊酯甲醇溶液。药液浓度为10ppm、0.2ppm，分别从中取1mL加入到每类样品中，重复3次，余下的作对照。

(3)一定时间后，在样品中加入10mL水和50mL乙腈振荡提取1小时。

(4)振荡完毕后，提取液用布氏漏斗抽滤，将滤液倒入盛有5g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡，使乙腈与水分层，静置10min，取10mL至平底烧瓶。

(5)用旋转蒸发器浓缩近干，用含30％甲醇的PBS定容至2mL。

5.2样品的ELISA法测定

方法同标准曲线的操作。已封闭好的板每孔加入系列已知添加浓度的样品液50μL，再加入抗体稀释液50μL，对照孔加入含30％甲醇的PBS50μL和抗体稀释液50μL。37℃温育1小时，余后步骤同4.3.1。经分析可知，该方法的联苯菊酯回收率为82.6～104.4％，平均变异系数为4.30～7.35％，符合残留分析标准。该方法可用于环境样品中联苯菊酯的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量筛选。

Claims (5)

1.联苯菊酯人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为：

或

2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯LBc       2-甲基-3-苯基苯甲酸LBy。

2.权利要求1所述联苯菊酯人工半抗原的制备方法，其特征在于，

人工半抗原2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯LBc的制备步骤如下：

1)取0.5～5g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入5～15mL无水吡啶，0.3～3g丁二酸酐，40～50℃避光磁力搅拌反应10～12h；

2)反应后的混合液在3.6％盐酸和乙酸乙酯间进行分配，取乙酸乙酯层；

3)乙酸乙酯层再用水洗，上层过无水Na₂SO₄，浓缩近干；

4)柱层析法纯化，石油醚湿法装柱，收集洗脱液为95∶5的氯仿∶甲醇洗脱相，浓缩近干得LBc白色晶体；

人工半抗原2-甲基-3-苯基苯甲酸LBy的制备步骤如下：

1)取0.2～2g联苯醇于100mL三口烧瓶中，加入0.5～1g 18-冠醚-6，加入15～30mL丙酮溶解，在冰浴条件下，将2.8g高锰酸钾研细后的粉末分批加入，搅拌反应5h，

2)将反应后的混合物抽滤，用少量丙酮洗滤饼，滤饼风干后，放入研钵内，加入适量的饱和NaHCO₃，研磨，过滤除去MnO₂，

3)滤液用浓盐酸酸化，乙醚萃取，水洗，有机相过无水Na₂SO₄，浓缩近干，

4)柱层析法纯化，收集洗脱液为氯仿的洗脱相，浓缩得LBy白色晶体。

3.一种联苯菊酯抗原，其特征在于，分别由权利要求1或2所述的半抗原2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯LBc与蛋白质偶联、2-甲基-3-苯基苯甲酸Lby与蛋白质偶联而成，其分子结构式为：

免疫原LBc-BSA                               包被抗原LBy-OVA

4.用权利要求3所述联苯菊酯抗原制备的联苯菊酯特异性抗体。

5.权利要求4所述联苯菊酯特异性抗体在检测食品、农产品和环境样品中联苯菊酯的残留量中的应用。