CN105712970A - 一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，具体公开了一种互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述互隔交链孢酚半抗原具有如式（Ⅰ）所示的结构：其中，n=1，2。所述互隔交链孢酚人工抗原具有如式（Ⅲ）所示结构：其中，n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:128000，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建立互隔交链孢酚的酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中残留的互隔交链孢酚，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。
背景技术
互隔交链孢酚（(Altemariol,AOH)是一类具有诱变性、致癌性、基因毒性等多种毒性的小分子化合物，与互隔交链孢酚单甲醚（(Altemariolmethylether,AME）同属于二苯吡喃酮类衍生物，是链格孢霉次级代谢产物的毒素之一。K.Wollenhaupt等研究了AOH对猪子宫内膜细胞活性的影响，当AOH的添加量为12.5μmol/L时，子宫内膜细胞数量明显减少；当AOH的浓度为3.12μmol/L，细胞的代谢活性到显著影响；Pollock等研究了AOH及AME的亚急性毒性和致畸作用，当用200mg/kg的浓度注射怀孕8d的黄金仓鼠时，胎鼠平均体重下降，脏器严重坏死，且可观察到AOH与AME存在协同作用。Zhen等研究表明，AOH能够引起胚胎食道鳞状细胞癌变，从而引发食道癌。
链格孢霉广泛的存在自然界中，AOH和AME作为其分较广和产量较高的两种毒素，主要存在于霉变腐烂的谷物、水果及蔬菜中。据报道，在我国食道癌、大骨节病高发病区的粮食真菌调查中，互隔交链孢霉广泛的存在于病区的粮食中；StinsonEE，ScottPM，LauBPY等分别检测了苹果及其饮料制品中的AOH残留情况，其检出率分别为1/22，17/32，11/11，含量分别为160μg/kg，1.35～5.42μg/kg，0.04～2.40μg/kg；此外橘汁、葡萄汁、无花果干等水果制品中也被检测出互隔交链孢酚。因此，建立快速、简便、灵敏的互隔交链孢酚毒素检测方法尤为重要。
目前，国内外尚未制定互隔交链孢酚毒素在农作物及食品中的限量标准，其有关免疫检测方法的报道也鲜有见闻，而传统的检测方法如气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联和毛细管电泳等不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，亟需发明一种针对互隔交链孢酚毒素的快速、简便的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术中互隔交链孢酚检测的不足，提供了一种互隔交链孢酚的半抗原及其相应的人工抗原和抗体。
本发明的另一目的在于提供所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。
本发明的另一目的在于提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种互隔交链孢酚的半抗原，具有如式（Ⅰ）所示的结构：
式（Ⅰ）中n=1，2。
本发明最大限度的保留了互隔交链孢酚的空间结构，其半抗原只是在原有分子的基础上衍生出带2～3个C原子的羧酸分子手臂，与现有技术相比，本发明的抗原进行动物免疫后得到更优质、高效的抗体。
由于互隔交链孢酚本身的合成难度较大，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的互隔交链孢酚检测技术主要以仪器法为主，而仪器法操作复杂，前处理要求高，成本高。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达12.8k，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点。
优选地，式（Ⅰ）中所述n为1。
一种互隔交链孢酚的人工抗原，具有如式（Ⅲ）所示结构：
式（Ⅲ）中n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。
所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式（Ⅰ）所示分子结构的互隔交链孢酚半抗原：
。
优选地，所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：
S1.将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5溶于适量DMF中；
S2.加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3～5h；
S3.加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃取3次；
S4.将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38℃旋干，得到白色粉末状物质；
S5.上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1：1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于碱性条件下水解12h；
S6.用1M的盐酸终止反应，乙酸乙酯萃取，萃取液旋干后过硅胶柱，甲醇：氯仿：冰乙酸=1:30:0.01洗脱，最后蒸干的棕黄色粉末即为互隔交链孢酚半抗原。
所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将所述的互隔交链孢酚半抗原溶于DMF中，搅拌加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，然后再加入载体蛋白，4℃下搅拌反应过夜；偶联混合物于4℃下生理盐水透析2天得到目标产物；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为100～25:1。
所述互隔交链孢酚人工抗原的制备方法为活泼酯法，优选地，包括如下步骤：S1.将5mg的互隔交链孢酚半抗原溶解于0.3mL二甲基亚砜（DMSO）；
S2.在S1得到的溶液中分别加入1.5倍于互隔交链孢酚半抗原摩尔质量的DCC（N，N-二环己基碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），室温避光反应过夜；
S3.将载体蛋白（12.3mgBSA、10mgOVA）分别溶于6mL的0.01MPBS的缓冲液中，再加入S1得到的溶液，并于4℃反应过夜；
S4.S3溶液反应完成后，用生理盐水透析，得到无色互隔交链孢酚人工抗原。
优选地，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～8.0。
优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵血清蛋白。
所述人工抗原制备得到的抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。
所述人工抗原或所述抗体在互隔交链孢酚免疫检测分析中的应用。
本发明还提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法，包括如下步骤：
S1.将所述的互隔交链孢酚人工抗原免疫动物制备互隔交链孢酚的多克隆抗体；
S2.将所述的互隔交链孢酚人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到互隔交链孢酚的多克隆抗体加入微孔板中；
S3.加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中互隔交链孢酚的含量。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:128000，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建立互隔交链孢酚的酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中残留的互隔交链孢酚，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1互隔交链孢酚半抗原H1（n=1）质谱鉴定图。
图2为互隔交链孢酚半抗原H1（n=1）及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。
图3为半抗原所制备抗体对互隔交链孢酚的抑制曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为市购。
实施例1半抗原H1（n=1）的制备方法
在25mL圆底烧瓶中将260mg（1mmol）互隔交链孢酚溶于3mL无水DMF中，磁力搅拌下加入170.6mg（1.2mmol）K2CO3，然后逐滴加入200.4mg(1.5mmol)溴乙酸乙酯，室温下反应4h后，加入1MHCl终止反应，反应混合物过硅胶柱纯化，用乙酸乙酯：正己烷=1：5洗脱后，旋干得到中间产物为白色粉末。再将其溶于体积比四氢呋喃：H2O=1:1的溶液中，加入100mgLiOH，水解12h，用1MHCl调pH=3～4，乙酸乙酯萃取5次，浓缩后硅胶过柱纯化，用甲醇：氯仿：冰乙酸=1：30：0.01洗脱，旋干洗脱液后得到棕黄色粉末，即为目标半抗原，见式（Ⅰ）。
，其中，n=1。
实施例2免疫原/包被原的制备
所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白主要采用牛血清蛋白（BSA），所述包被原载体蛋白主要采用蛋清蛋白（OVA），所用偶联方法为活泼酯法。以下所述免疫原的制备方法为例。
活泼酯法：取半抗原AOH-C5mg（0.015mol）溶于0.3mLDMSO中，加入4.78mgDCC（0.023mol）、2.65mgNHS（0.023mol），4℃搅拌过夜，此为A液；取12.3mg牛血清蛋白溶于6mL、pH=7.4的PBS缓冲液中，将A液逐滴加入其中，4℃反应过夜，离心取上清，生理盐水透析3d，每天更换4次透析液，得到互隔交链孢酚免疫原；另外以同样的方法制备得到互隔交链孢酚包被原。将免疫原或包被原稀释至1mg/mL，分装与离心管中，于-20℃保存，以供使用。免疫原具有如式（Ⅲ）所示结构：
式（Ⅲ）中n=1；载体蛋白为牛血清蛋白。
对载体蛋白、半抗原及其相应的免疫原进行紫外扫描测定（200～400nm），发现免疫原同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰（图1），说明免疫原偶联成功。
实施例3抗体制备及鉴定
将制备好的免疫原与等量的免疫佐剂（第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂）乳化均匀，免疫动物。将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加免一次。第四次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升是，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，与-20℃冻存备用。
间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血的测定值为准，结果表明半抗原H1（n=1）对应的抗血清（Ab-H1）效价为1:128000。
实施例4抗体的特异性及灵敏度
依据如上效果，使用抗血清（Ab-H1）绘制酶联免疫分析（ELISA）标准曲线；使用磷酸吐温缓冲液（PBST，0.1mol/L，pH=7.4）作为所有样品的稀释液，使用H1-OVA作为包被原：将50μL系列浓度的药物标准品和50μL适当稀释倍数的互隔交链孢酚多特异性抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值（OD）。以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin8.5软件四参数对函数进行曲线拟合：y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D
其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值（OD），C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为（A+D）/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。以互隔交链孢酚为标准品建立ELISA的标准曲线，结果如图3，相关标准曲线参数见表1。结合附图及附表可知，以互隔交链孢酚为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好。由于该特异性抗体能直接识别互隔交链孢酚，因此该方法可以直接测食品中的互隔交链孢酚的含量。
表1抗血清（Ab-H1）对互隔交链孢酚的检测参数
表2抗血清Ab-H1对半抗原H1及其结构类似物的交叉反应率
对比例
1溴代丁酸乙酯与互隔交链孢酚AOH缩合、水解后获得带羧基的半抗原，并偶联蛋白，获得免疫原H2-BSA，其结构如下所示：
，即n=3。
其中，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
2N，N-二羰基咪唑直接将AOH与蛋白直接偶联获得免疫原H3-BSA，其结构如下所示：
，即n=0。
其中，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
其制备的抗体效果如下表所示：
由上表可知：免疫原H2和H3免疫动物后，制备的抗体虽有效价，单不具备特异识别性，效果差。这可能是由于AOH在立体构象上是平面结构，而H2的手臂过长，在偶联蛋白后，手臂发生折叠，整个分子被包埋在蛋白中，导致小分子抗原决定簇在载体上不能充暴露而不能产生免疫应答；利用羟基直接偶联蛋白所获得的免疫原H3，则可能是因为手臂太短，偶联蛋白后不能暴露出苯环等特征结构，也可能因为在偶联蛋白时，AOH的3个羟基都与蛋白结合，而导致整个分子轨道、电荷分布发生显著变化，制备出的抗体也不具有特异性。
Claims (9)
1.一种互隔交链孢酚半抗原，其特征在于，具有如式（Ⅰ）所示的结构：
式（Ⅰ）中n=1，2。
2.基于权利要求1的一种互隔交链孢酚人工抗原，其特征在于，具有如式（Ⅲ）所示结构：
式（Ⅲ）中n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。
3.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式（Ⅰ）所示分子结构的互隔交链孢酚半抗原：
。
4.根据权利要求3所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5于适量DMF中；
S2.加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3～5h；
S3.加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃取3次；
S4.将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38℃旋干，得到白色粉末状物质；
S5.上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1：1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于碱性条件下水解12h；
S6.用1M的盐酸终止反应，乙酸乙酯萃取，萃取液旋干后过硅胶柱，甲醇：氯仿：冰乙酸=1:30:0.01洗脱，最后蒸干的棕黄色粉末即为互隔交链孢酚半抗原。
5.权利要求2所述人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的互隔交链孢酚半抗原溶于DMF中，搅拌加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，然后再加入载体蛋白，4℃下搅拌反应过夜；偶联混合物于4℃下生理盐水透析2天得到目标产物；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为100～25:1。
6.根据权利要求5所述人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将5mg的互隔交链孢酚半抗原溶解于0.3mL二甲基亚砜；
S2.在S1得到的溶液中分别加入1.5倍于互隔交链孢酚半抗原摩尔质量的N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光反应过夜；
S3.将载体蛋白溶于6mL的0.01MPBS的缓冲液中，上述溶液于4℃离心，取上清逐滴加载体蛋白溶液中，并于4℃反应过夜；
S4.S3溶液反应完成后，用生理盐水透析，得到无色互隔交链孢酚人工抗原。
7.权利要求2所述人工抗原制备得到的抗体，其特征在于，包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。
8.权利要求2所述人工抗原或权利要求7所述抗体在互隔交链孢酚免疫检测分析中的应用。
9.一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将权利要求2所述的人工抗原免疫动物制备互隔交链孢酚的多克隆抗体；
S2.将具权利要求2所述的人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到互隔交链孢酚的多克隆抗体加入微孔板中；
S3.加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中互隔交链孢酚的含量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |