CN106317009B - 一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测技术领域，具体公开了一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用。所述呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原具有式（I）所示结构，将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与载体蛋白偶联即可得到呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，用上述人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抗体；所述抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯占吨醇衍生物—呫吨聚氨基甲酸乙酯，用于间接检测食品中氨基甲酸乙酯的含量。

Description

一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地，涉及一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)，又名尿烷或乌拉坦，分子式为C₃H₇NO₂，是一种无色、无味的粉末状晶体，不易挥发(沸点182-184℃)，易溶于水和乙醇，是发酵食品特别是酒精饮料中自然形成的一种化学污染物，对人类健康具有致癌的潜在威胁；自1943年Nettleship等发现EC可以导致小鼠细胞癌变和肿瘤的形成后，EC的致癌性在许多模式动物中(大鼠、小鼠、仓鼠和猴子等)都得到了证明。基于这些实验结果，1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现EC也可以直接诱发人的肝癌，因此，IARC在2007年将EC的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。随着检测技术的发展，众多酒精饮品中陆续检测出EC，越来越多的国家对酒精饮品中的EC残留都做出严格规定(表1)。目前，我国暂未正式公布EC限量标准，但食品安全部门已经在认真的考虑中，相信不久之后就会出台相关的EC限量条例。

表1 各国对酒精饮品中EC限量标准(μg/L)

目前国内外检测氨基甲酸乙酯的常用方法主要集中在色谱、质谱等物化手段定性定量，但这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原抗体特异性结合的的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。国际权威学术刊物将其列为近年来首位优先发展的新分析技术。但是，目前尚无可用于免疫检测的氨基甲酸乙酯半抗原、抗原和抗体的相关报道，使得氨基甲酸乙酯ELISA检测方法暂时还未建立。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原。

本发明的另一个目的是提供一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原。

本发明的另一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原在间接检测氨基甲酸乙酯中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种间接检测氨基甲酸乙酯的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。

一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原，其结构式如式(I)所示：

式(I)；

其中，n＝0～6。

由上述半抗原结构可以看出，本发明针对氨基甲酸乙酯的呫吨醇衍生物(呫吨聚氨基甲酸乙酯)设计和制备得到的半抗原在分子结构、立体化学和电子分布上与呫吨聚氨基甲酸乙酯相似，半抗原结构中的连接臂不易于诱导产生“臂抗体”，并且使用了一定长度的饱和碳链，使机体更易于识别。

一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，其结构式如式(Ⅱ)所示：

式(Ⅱ)；

其中，n＝0～6。

式(I)所示呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将氨基甲酸乙酯与式(Ⅲ)所示带羧基的呫吨醇衍生物在室温条件下于含醋酸的甲醇中进行亲核取代反应；

(2)蒸干甲醇，用稀盐酸洗涤得到的沉淀，烘干即得半抗原；

式(Ⅲ)；其中n＝0～6。

步骤(1)所述带羧基的呫吨醇衍生物优选为9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸或2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸。

式(Ⅱ)所示的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法，将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原，具体包括以下步骤：

(1)式(I)所示的将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)反应形成活泼酯；

(2)将活泼酯滴加入载体蛋白溶液中，反应过夜；

(3)偶联有氨基甲酸乙酯呫吨醇衍生物半抗原的蛋白经过3天的透析纯化得到目标人工抗原。

所述载体蛋白为免疫原载体蛋白或包被原载体蛋白。优选地，所述免疫原载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)，包被原载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。

本发明还提供了呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法，即用式(Ⅱ)所示的人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抗体，所述抗体是能与呫吨聚氨基甲酸乙酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。

作为优选实施方式，呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)将呫吨聚氨基甲酸乙酯抗原配合福式佐剂免疫实验动物；

(2)免疫4次后抽取血液，分离血清；

(3)血清经过抗体纯化步骤得到目标抗体。

本发明还提供了如上所述半抗原、人工抗原、抗体在间接检测氨基甲酸乙酯中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)引入3个芳香环结构使得氨基甲酸乙酯的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；(2)呫吨醇与氨基甲酸乙酯的氨基在室温条件下，快速、高效进行亲核取代反应，衍生效率高，时间短，重复性好；(3)本发明提供的氨基甲酸乙酯的快速检测方法最低检测限可达0.1ng/mL。

附图说明

图1为半抗原B_Ⅰ(n＝0)及其免疫抗原、包被抗原紫外扫描图。

图2为半抗原B_Ⅰ(n＝1)及其免疫抗原、包被抗原紫外扫描图。

图3为以B_Ⅰ(n＝0)为半抗原所制备的抗体对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抑制曲线。

图4为以B_Ⅰ(n＝1)为半抗原所制备的抗体对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1氨基甲酸乙酯半抗原B_Ⅰ(n＝0)制备方法

178mg氨基甲酸乙酯溶于5mL 1M的乙酸；626mg 9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸溶于20mL甲醇；混合上述溶于，室温搅拌1小时。向混合液中加10mL蒸馏水，旋转蒸发除去反应混合液中的甲醇，过滤，沉淀用0.1M稀盐酸洗涤，蒸馏水洗涤，烘干得424mg灰色固体，即目标半抗原XEC-313-3，结构式如(Ⅳ)所示。

式(Ⅳ)。

ESI-MS分析(negative)m/z 312[M+H]^–；¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.21(d,J＝8.8Hz,1H),7.71(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.61(d,J＝1.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(d,J＝7.3Hz,1H),7.35(td,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.18(t,J＝7.4Hz,3H),5.99(d,J＝8.6Hz,1H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).

实施例2氨基甲酸乙酯半抗原B_Ⅰ(n＝1)的制备方法

178mg氨基甲酸乙酯溶于5mL 1M的乙酸；654mg 2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸溶于20mL甲醇；混合上述溶于，室温搅拌1小时。向混合液中加10mL蒸馏水，旋转蒸发除去反应混合液中的甲醇，过滤，沉淀用0.1M稀盐酸洗涤，蒸馏水洗涤，烘干得402mg灰色固体，即目标半抗原XEC-327-4，结构式如(Ⅴ)所示。

式(Ⅴ)。

ESI-MS分析(positive)m/z 350[M+Na]⁺；¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.09(d,J＝9.0Hz,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(t,J＝7.2Hz,1H),7.21(dd,J＝17.5,7.4Hz,2H),7.12(dd,J＝13.9,7.1Hz,2H),7.02(t,J＝7.5Hz,1H),5.92(d,J＝8.9Hz,1H),4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.52(dd,J＝39.5,15.3Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).

实施例3免疫原包被原的制备方法

免疫原与包被原的制备不同之处在于载体蛋白，所述免疫原载体蛋白采用牛血清蛋白(BSA)，所述包被原载体蛋白采用鸡卵清白蛋白(OVA)。以下所述以免疫原的制备方法为例。

活泼酯法：取半抗原B_Ⅰ(n＝0)31.3mg(0.1mmoL)或半抗原B_Ⅰ(n＝1)32.7mg(0.1mmoL)溶于0.5mL DMF中，搅拌加入25.6mg(0.1mmol)DCC和11.5mg(0.1mmoL)NHS，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液。称取BSA或OVA 20mg溶于2mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换4次透析液。得到的免疫原B_Ⅰ-0-BSA、B_Ⅰ-1-BSA和包被原B_Ⅰ-0-OVA、B_Ⅰ-1-OVA以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。

对载体蛋白，半抗原B_Ⅰ(n＝0)、半抗原B_Ⅰ(n＝1)及其相应的免疫原和包被原进行紫外扫描测定(200～400nm)，发现免疫原和包被原同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰(见图1和图2)，说明免疫抗原和包被抗原偶联成功。

实施例4抗体的制备及鉴定

将免疫原与等剂量的免疫佐剂(第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)用搅拌器乳化。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6只体重为2.5～3kg的健康新西兰大白兔。第一次免疫隔一个月后每两周加强免疫一次。第4次加强免疫后1周耳缘静脉采血，并利用间接ELISA测定血清效价。当效价不再上升时,采用耳缘静脉加强免疫。1周后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-20℃下保存备用。

间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，结果表明以半抗原B_Ⅰ(n＝0)对应的抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)效价为1:256000，以半抗原B_Ⅰ(n＝1)对应的抗血清(Ab-B_Ⅰ-1)效价为1:512000。

实施例5抗体的特异性及灵敏度

依据如上效果，使用抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)和抗血清(Ab-B_Ⅰ-1)绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线；使用磷酸盐吐温缓冲液(PBST,100mmol/L,pH 7.4)作为所有样品的稀释液；分别使用B_Ⅰ-0-OVA和B_Ⅰ-1-OVA作为包被原；将50μL系列浓度的呫吨聚氨基甲酸乙酯标准品和50μL适当稀释倍数的呫吨聚氨基甲酸乙酯多克隆抗体(Ab-B_Ⅰ-0或Ab-B_Ⅰ-1)加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。以OD值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro 7.5软件四参数对数函数进行曲线拟合：

y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(1)

其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大时的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC₅₀，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC₁₀为检测限，以IC₂₀～IC₈₀为检测范围。以2种标准品B_Ⅰ(n＝0)、B_Ⅰ(n＝1)建立ELISA的标准曲线，结果如图3和图4，相关标准曲线参数见表1和表2。结合附图及附表可知，以呫吨聚氨酯为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度较好。由于样品中的氨基甲酸乙酯与呫吨醇可以快速、高效发生衍生反应，因此该方法可以用于间接检测食品中氨基甲酸乙酯的含量。

表1抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)对呫吨聚氨基甲酸乙酯的检测参数

免疫原	IC<sub>50</sub>(ng/mL)	线性范围(ng/mL)	最低检测限(ng/mL)	相关系数R<sup>2</sup>
					B<sub>Ⅰ</sub>-0-BSA	8.3	0.16～144.5	0.5	0.99962

表2抗血清(Ab-B_Ⅰ-1)对呫吨聚氨基甲酸乙酯的检测的检测参数

免疫原	IC<sub>50</sub>(ng/mL)	线性范围(ng/mL)	最低检测限(ng/mL)	相关系数R<sup>2</sup>
					B<sub>Ⅰ</sub>-1-BSA	5.4	0.89～32.4	0.7	0.99936

表3抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)对呫吨聚氨基甲酸乙酯及其结构类似的交叉反应率

竞争药物	交叉反应率
		呫吨聚氨基甲酸乙酯	100％
呫吨醇	<1％
		呫吨酮	<1％
呫吨聚尿素	<1％
		呫吨聚丙烯酰胺	1.2％
呫吨聚瓜氨酸	<1％

表4抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)对呫吨聚氨基甲酸乙酯及其结构类似的交叉反应率

另外，由表3和表4的抗血清(Ab-B_Ⅰ-0)和(Ab-B_Ⅰ-1)对呫吨聚氨基甲酸乙酯及其结构类似的交叉反应率可以看出，两种抗体的特异性也比较好。

Claims (8)

1.一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：

式(I)；

其中，n＝0～6。

2.一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示：

式(Ⅱ)；

其中，n＝0～6，载体蛋白为免疫原载体蛋白或包被原载体蛋白，免疫原载体蛋白为牛血清蛋白，包被原载 体蛋白为鸡卵清白蛋白。

3.权利要求1所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将氨基甲酸乙酯与式(Ⅲ)所示带羧基的呫吨醇衍生物在室温条件下于含醋酸的甲醇中进行亲核取代反应；

(2)蒸干甲醇，用稀盐酸洗涤得到的沉淀，烘干即得半抗原；

式(Ⅲ)；

其中n＝0～6。

4.根据权利要求3所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述带羧基的呫吨醇衍生物为9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸或2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸。

5.权利要求2所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1中的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应形成活泼酯；

(2)将活泼酯滴加入载体蛋白溶液中，反应过夜；

(3)偶联有氨基甲酸乙酯呫吨醇衍生物半抗原的蛋白经过3天的透析纯化得到人工抗原。

6.一种呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法，其特征在于，用权利要求2所述的人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抗体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原配合福式佐剂免疫实验动物；

(2)免疫4次后抽取血液，分离血清；

(3)血清经过抗体纯化得到目标抗体。

8.权利要求2所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原在间接检测聚氨基甲酸乙酯中的应用。