CN103954749B

CN103954749B - 一种用于直接检测呋喃它酮代谢物amoz的快速免疫检测方法

Info

Publication number: CN103954749B
Application number: CN201410154389.5A
Authority: CN
Inventors: 孙远明; 刘凤银; 徐振林; 沈玉栋; 雷红涛; 王弘; 杨金易; 肖治理
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2034-04-17
Also published as: CN103954749A

Abstract

本发明公开了一种用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫检测方法，包括AMOZ半抗原、人工抗原、抗体等的制备及其应用。所述AMOZ半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构，所述AMOZ人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构。采用本发明抗原得到的抗体可以特异性识别AMOZ，抗体的效价为1:64000，最低检测限为0.852ng/mL，半抑制浓度为15.26ng/mL，可以直接用于AMOZ的检测，克服传统酶联免疫方法需要对AMOZ进行衍生化的特点，更简便、快速及低成本。本发明的抗原及抗体在食品中AMOZ的残留检测上具有广泛的应用前景。

Description

一种用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫检测方法

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫检测方法。

背景技术

AMOZ是硝基呋喃类抗生素呋喃它酮的代谢物，是非法使用硝基呋喃类抗生素的指示物，是一类具有潜在致畸、致癌和致突变的物质。欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，又在1997年将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物，我国亦于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。之后欧盟又于2003年通过了2003/181/EC委员会决议，建立了用于禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物代谢物的各种检测方法的最小要求性能限值为1μg/kg。现在，为保证食品安全，国内外的监管机构将注意力集中在了AMOZ的检测上，建立快速、简单、廉价、有效的AMOZ检测方法已刻不容缓。

目前国内外检测AMOZ的方法主要有色谱方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。前两种属于仪器分析检测技术，存在着周期长、专业性强、费用高等不足，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。而现在报道的基于抗原—抗体特异性结合检测AMOZ的免疫分析方法在检测之前均需对检测对象进行衍生化处理，存在着前处理操作复杂繁琐、成本高及回收率偏低等不足，限制了其应用。

基于抗原-抗体识别的免疫分析技术在小分子化学性污染物检测领域占有重要地位，已经成功应用于农药、兽药、生物毒素等的快速检测，为保障食品安全发挥了重要作用。但是，大量实践证明：当化合物（半抗原）的分子量<300Da时，其高特异性高亲和力的抗体制备难度增大。由于AMOZ分子量很小(201.22Da)，即使将其与载体蛋白偶联，其高特异性高亲和力抗体的制备难度也相对很大，因此，目前关于AMOZ免疫分析检测技术的报道大都是需对其进行衍生化的间接检测，而关于直接检测AMOZ的免疫分析检测技术则鲜有报道。

2009年，Pimpitak等人报道了一种检测强化虾样品中AMOZ残留量的方法。他们将AMOZ与3-羧酸苯甲醛衍生化制备免疫半抗原CPAMOZ，通过抗原制备、动物免疫以及单克隆抗体制备获得单克隆抗体，该抗体虽然能够识别AMOZ，但是识别灵敏度低，比其对半抗原CPAMOZ的灵敏度低23倍。基于该抗体他们建立了间接检测AMOZ的免疫分析方法，即在检测前对其进行衍生化（将AMOZ与2-硝基苯甲醛衍生化为NPAMOZ），衍生化的时间需要十多个小时，十分费时。

抗体是免疫分析的核心试剂，本课题组以一种新型的AMOZ半抗原，将其与载体蛋白偶联制备人工抗原，并进行抗体制备，获得了特异性识别AMOZ的抗体。同时为了提高对AMOZ分析的灵敏度，设计了一个与免疫半抗原不同结构的包被半抗原，基于此建立了一种异源免疫分析方法，该方法可以实现对AMOZ的直接检测，无需衍生化，同时只对AMOZ的原型呋喃它酮有交叉（CR=188.2%），与其它硝基呋喃类抗生素的原型及其衍生物无交叉现象，考虑到样品前处理采用水提的方式，呋喃它酮本身不能溶于水，对实际样品的检测影响不大，不会造成假阳性，可以用于实际样品的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统的AMOZ免疫分析技术中均需对其进行衍生化处理的缺陷，提供一种AMOZ半抗原、人工抗原和高特异性抗体。

本发明的第二个目的是提供所述AMOZ半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种可以对AMOZ进行直接快速检测的免疫分析方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种AMOZ半抗原，所述AMOZ半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：

所述AMOZ半抗原的制备方法为：将AMOZ和乙醛酸或顺丁烯二酸酐分别溶于无水乙醇中，搅拌过程中将乙醛酸或顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，AMOZ和乙醛酸或顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：1.2；室温搅拌过夜，反应结束，真空抽滤，依次用乙醇和乙醚洗涤2次，取沉淀、干燥获得式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示AMOZ半抗原。

一种AMOZ人工抗原，所述AMOZ人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：

优选地，本发明所述人工抗原的制备方法为：采用活泼酯偶联法将如上具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构的AMOZ半抗原与载体蛋白偶联制备得到具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ人工抗原。

更优选地，本发明所述人工抗原的制备方法为：将具有式（Ⅰ）或（Ⅱ）所示分子结构的AMOZ半抗原溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清；搅拌条件下，将上清液逐滴滴加到载体蛋白的PBS（0.01M，pH7.4）缓冲溶液中，4℃下磁力搅拌反应12h；离心后取上清。4℃下用生理盐水透析3天得目标产物。所述AMOZ半抗原与载体蛋白的摩尔比为100:1。

优选地，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。

本发明同时提供所述AMOZ特异性单克隆抗体或多克隆抗体，以及所述AMOZ人工抗原和特异性抗体在AMOZ免疫检测方面的应用。

一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫分析方法，包括如下步骤：

S1.将权利要求3具有式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ人工抗原免疫动物制备AMOZ的多克隆抗体；

S2权利要求3具有式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到的AMOZ的多克隆抗体加入微孔板中；

S3.采用竞争ELISA测定待测样品中AMOZ的含量。

本发明建立了一种异源包被的酶联免疫检测方法，可直接用于AMOZ的检测，无需衍生化处理。

本发明的有益效果是：

本发明最大的创新点就是把两个半抗原进行了组合，建立异源包被（免疫半抗原用式（I）所示半抗原，包被半抗原用式（Ⅱ）所示半抗原，传统的方法是免疫半抗原和包被半抗原都采用式（I）所示半抗原或都采用式（Ⅱ）所示半抗原。而本发明发现只有将式（I）所示半抗原作为免疫半抗原、式（Ⅱ）所示半抗原作为包被半抗原这种组合才能用于直接检测AMOZ，其他组合均不行。

现有的AMOZ检测方法以仪器法居多，而仪器法周期长、专业性强、费用高操作繁复，前处理复杂，成本高。现有的免疫分析检测方法均需在检测前对AMOZ进行衍生化处理，存在前处理操作复杂繁琐、成本高及回收率偏低等不足。本发明提供了一种对AMOZ进行直接检测的快速免疫分析方法，阐述了AMOZ半抗原、人工抗原、特异性抗体的制备方法与应用。其思路是将AMOZ衍生化，获得具有双键刚性支撑手臂的衍生物。以该衍生物为半抗原，进而制备人工抗原，免疫动物获得特异性抗体。该抗体可以特异性识别AMOZ本身，进而对AMOZ进行直接检测，无需衍生化。该思路的有益效果体现在：（1）引入具有刚性支撑作用的双键手臂，使得AMOZ的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；（2）所使用的衍生剂可以与AMOZ的肼胺键发生快速、高效的酰胺化缩合，衍生条件简单、快速、重复性好；（3）本发明提供的AMOZ的快速检测方法最低检测限可达到0.852ng/mL。

附图说明

图1.AMOZ半抗原HⅠ及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图2.AMOZ半抗原HⅡ及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图3.以人工抗原Ⅲ为免疫原制备的抗体、人工抗原Ⅳ为包被原建立的对AMOZ的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本技术领域常规的试剂、方法和仪器。

实施例1半抗原HⅠ的制备：

取604mg（3mmol）AMOZ、266.5mg（3.6mmol）乙醛酸分别溶于2mL无水乙醇中，搅拌过程中将乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，室温搅拌反应过夜。反应结束，真空抽滤，依次用2mL乙醇和乙醚洗涤滤饼2次，取沉淀，得到白色固体目标物HⅠ540.2mg，产率为70%。ESI-MSanalysis（positive）m/z258.7[M+H]+；1HNMR(600MHz,d5-Pyridine,TMS):δ7.56(s,1H),4.99-4.97(m,1H),4.16(t,J=8.8Hz,1H),3.79(dd,J1=6.7,J2=8.8,1H),3.68-3.64(m,4H),2.66(dd,J1=6.1,J2=13.5,1H),2.62(dd,J1=5.5,J2=13.4,1H),2.51-2.46(m,4H)。

实施例2半抗原HⅡ的制备方法

取604mg（3mmol）AMOZ、353mg（3.6mmol）顺丁烯二酸酐分别溶于2mL无水乙醇中，搅拌过程中将顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，室温搅拌反应过夜。反应结束，真空抽滤，依次用2mL乙醇和乙醚洗涤滤饼2次，取沉淀，得到白色固体目标物HⅡ566mg，产率为63%。ESI-MSanalysis（negative）m/z298.6[M-H]-；1HNMR(500MHz,d6-DMSO,TMS):δ6.32(d,J=2.9Hz,2H),4.86–4.78(m,1H),3.74(t,J=8.1Hz,2H),3.58(s,J=4.6Hz,4H),3.43(t,J=7.7Hz,1H)。

实施例3免疫原/包被原的制备

免疫原与包被原的制备不同之处在于半抗原的结构和载体蛋白种类，所述免疫原采用半抗原HⅠ，载体蛋白采用牛血清蛋白（BSA）；所述包被原采用半抗原HⅡ，载体蛋白采用卵清蛋白（OVA）。

免疫原的制备方法。活泼酯法：取半抗原HⅠ10mg（0.04mmol），溶于500μL二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入20.6mg（0.1mmol）1，3-二环己基碳二亚胺（DCC）和11.5mg（0.1mmol）N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清为A液。称取20mg载体蛋白BSA溶于2mLPBS溶液（0.1mol/L，pH7.4）中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，吸取A液384μL逐滴滴加到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后，取上清液，4℃下PBS透析3d，每天早晚2次更换透析液。得到免疫原HⅠ—BSA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于—20℃冰箱中，备用。

包被原的制备方法。活泼酯法：半抗原HⅡ15mg（0.05mmol），溶于1.5mL二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入24.8mg（0.12mmol）1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和13.8mg（0.12mmol）N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清为A液。称取20mg载体蛋白OVA溶于5mLPBS溶液（0.1mol/L，pH7.4）中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，吸取A液1.329mL逐滴滴加到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后，取上清液，4℃下PBS透析3d，每天早晚2次更换透析液。得到免疫原HⅡ—OVA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。

对载体蛋白、半抗原HⅠ、半抗原HⅡ及其相应的免疫原和包被原进行紫外扫描鉴定（220nm~350nm），发现免疫原和包被原同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰（见图1和图2），说明免疫原和包被原偶联成功。

实施例4抗体的制备及鉴定

将免疫原与等剂量的免疫佐剂（第1次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂）混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6只体重为2.5~3kg的健康新西兰大白兔。第一次免疫间隔一个月后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用ic-ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5~1h，于4℃、12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存备用。

间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，结果表明半抗原HⅠ对应的抗血清（Ab-HⅠ）效价为1：64000。

实施例5抗体的特异性及灵敏度

依据如上效果，使用抗血清（Ab-HⅠ）建立ELISA标准曲线；使用磷酸盐吐温缓冲溶液PBST（0.01mol/L，Tween-200.0125%，pH5.4）作为所有样品的稀释液；使用HⅡ—OVA作为包被原；将50μL系列浓度的药物标准品和50μL适当稀释倍数的AMOZ特异性多克隆抗体加入到96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光度（OD）。以OD值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro7.5软件四参数对数函数进行曲线拟合：

y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D（1）

其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大时的吸光值；C为中点标准品浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为（A+D）/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC₅₀；B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC₁₀为检测限，以IC₂₀~IC₈₀为检测范围。以标准品AMOZ建立ELISA的标准曲线，结果如图3，相关标准曲线参数见表1。结合附图及附表可知，以AMOZ标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度较好，因此该方法可以用于直接检测食品中AMOZ的含量。

表1抗血清（Ab-HⅠ）对AMOZ的检测参数

免疫原	IC₅₀（ng/mL）	线性范围（ng/mL）	最低检测限（ng/mL）	相关系数R2
					HⅠ—BSA	15.26	2.47~94.21	0.852	0.997

表2抗血清（Ab-HⅠ）对AMOZ及其结构类似物的交叉反应率

竞争物	交叉反应率（%）
		AMOZ	100
AOZ	<0.1
		AHD	<0.1
SEM	<0.1
		盐酸呋喃它酮（原药）	188.2
呋喃唑酮	<0.1
		呋喃妥因	<0.1
呋喃西林	<0.1

实施例6

S1.免疫原与包被原的制备：所述免疫原采用半抗原HⅡ，载体蛋白采用牛血清蛋白（BSA）；所述包被原采用半抗原HⅠ，载体蛋白采用卵清蛋白（OVA）。免疫原与包被原的制备方法参照实施例3的步骤。

S2.抗体制备：以HⅡ-BSA作为免疫原免疫新西兰大白兔，制备AMOZ特异性多克隆抗体，抗体制备参照实施例4的步骤；

S3.以HⅠ-OVA作为包被原包被酶标板，将50μL系列浓度的药物标准品和50μL适当稀释倍数的AMOZ特异性多克隆抗体加入到96孔酶标板中，采用竞争ELISA测定待测样品中AMOZ的含量。具体步骤参照实施例5.

本实施例发现：以HⅡ-BSA作为免疫原，HⅠ-OVA作为包被原的组合不能用于直接检测AMOZ，检测效果不灵敏。

Claims

1.一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将具有式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ人工抗原作为免疫原免疫动物制备AMOZ的多克隆抗体；

S2将具有式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到的AMOZ的多克隆抗体加入微孔板中；

S3.采用竞争ELISA测定待测样品中AMOZ的含量；

。

2.根据权利要求1所述免疫检测方法，其特征在于，式（Ⅲ）所示分子结构的AMOZ人工抗原是由式（Ⅰ）所示分子结构的AMOZ半抗原与载体蛋白偶联得到，式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ人工抗原是由式（Ⅱ）所示分子结构的包被半抗原与载体蛋白偶联得到；。

3.根据权利要求2所述免疫检测方法，其特征在于，式（Ⅰ）所示分子结构的AMOZ半抗原的制备方法，包括如下步骤：将AMOZ和乙醛酸分别溶于无水乙醇中，搅拌过程中将乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，AMOZ和乙醛酸的摩尔比为1：1.2；室温搅拌过夜，反应结束，真空抽滤，先后用乙醇和乙醚洗涤，再按次序重复洗涤1次，取沉淀、干燥获得式（Ⅰ）所示AMOZ半抗原。

4.根据权利要求2所述免疫检测方法，其特征在于，式（Ⅱ）所示分子结构的包被半抗原的制备方法，包括如下步骤：将AMOZ和顺丁烯二酸酐分别溶于无水乙醇中，搅拌过程中将顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，AMOZ和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：1.2；室温搅拌过夜，反应结束，真空抽滤，先后用乙醇和乙醚洗涤，再按次序重复洗涤1次，取沉淀、干燥获得式（Ⅱ）所示包被半抗原。

5.根据权利要求2所述免疫检测方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。

6.根据权利要求1所述免疫检测方法，其特征在于，S1所述AMOZ的多克隆抗体的效价为1：64000，S1所述AMOZ的多克隆抗体针对AMOZ的最低检测限和半抑制浓度分别为0.852ng/mL，15.26ng/mL。