CN103288697B - 一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述丙烯酰胺半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：；；其中，n=0～6。所述丙烯酰胺人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：；；其中，n=0～6。采用本发明抗原得到的抗血清的效价可达到1:1024000，最低检测限为1~3ng/mL，半抑制浓度为8.7ng/mL，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高，本发明的抗原及抗体在食品中丙烯酰胺的残留检测上具有广泛的应用前景。

Description

一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。

背景技术

丙烯酰胺是一种高水溶性的不饱和酰胺类小分子化合物，对人体有一定毒性，长期接触丙烯酰胺会毒害人和动物的中枢或其它周围神经，导致细胞DNA的损伤且有生殖毒性。1994年，国际肿瘤机构（IARC）已把丙烯酰胺归为2A级致癌物质；2002年4月，瑞典学者首次报道了丙烯酰胺广泛存在于热加工食品中。2010年，欧洲化学品管理局（ECHA）将丙烯酰胺加入到了高度关注物质清单。WHO规定饮水中丙烯酰胺限量为1 μg/L，欧盟规定饮水中限量为1 μg/L，美国环境保护局规定的限量为0.5 μg/L，国内外的监管机构将注意力集中在了食品中丙烯酰胺的检测上，对于快速、简单、廉价、有效的检测丙烯酰胺已刻不容缓。

    目前国内外检测丙烯酰胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。

    基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体是决定整个方法性能的重要基础，而抗体的效果很大程度上取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。由于丙烯酰胺分子质量非常小（71.08 Da），即使将其与载体蛋白偶联，也难以制备可以特异性识别丙烯酰胺的抗体。因此，目前关于丙烯酰胺免疫检测技术的报道聊聊无几。

    2008年，赵美萍等申请了题为“丙烯酰胺全抗原的制备及其酶联免疫定量检测方法”的专利（申请号200710090394.4）。他们选择了N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（NAS）为半抗原，采用胺解偶联反应将半抗原与载体蛋白偶联制备获得抗原，免疫动物得到抗体，效价为1:8000，可以特异性识别丙烯酰胺，并基于该抗体建立了检测丙烯酰胺的酶联免疫分析方法，最低检测限为0.03 μg/mL。2009年，张红星等在《中国农学通报》发表了题为“丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备”的文章，他们采用戊二醛法直接将丙烯酰胺与载体蛋白偶联制备抗原，免疫动物得到抗体，效价为1:8100，但是该文章未有利用丙烯酰胺对抗体进行抑制实验，即无法判断该抗体是否可以特异性识别丙烯酰胺。2011年，付云洁等在《中国酿造》发表了题为“ELISA法测定热加工食品中的丙烯酰胺”的文章，他们参考了张红星等人的方法，同样采用戊二醛法直接将丙烯酰胺与载体蛋白偶联制备抗原，免疫动物得到抗体，效价1:16000，基于该抗体建立的ELISA方法对丙烯酰胺的测定最低检测限为50 μg/L。

    然而，在小分子免疫检测领域中已经基本形成一个共识：当化合物（半抗原）的分子量< 300 Da时，其特异性的高亲和力抗体制备难度增大；而当半抗原分子量< 150 Da时，其高特异性高亲和力的抗体几乎无法获得（Chappey et al. J. Immunol. Methods 1994, 172, 219–225）。本课题组采用上述两个方案（即NAS作为半抗原或以丙烯酰胺本身作为半抗原）进行抗体制备，所获得的抗体均无法特异性识别丙烯酰胺。王宵雪等（现代食品科技，2012, 28, 405-440）以丙烯酰胺和4-丙烯酰胺基丁酸作为半抗原偶联载体蛋白，所制备的抗体同样也无法特异性识别丙烯酰胺。Preston等（Anal. Chim. Acta, 2008, 608, 178–185）也尝试了一些丙烯酰胺半抗原如乙酰胺、6-丙烯酰胺基己酸，并将其偶联至载体蛋白进行动物免疫，结果同样发现所获得的抗体均无法识别游离丙烯酰胺，因而无法建立免疫分析方法。因此，以上采用丙烯酰胺本身直接作为半抗原进行抗体制备的方案存在重复性差的特点，而且所获得的抗体效价明显偏低，容易在现实应用中造成假阴性或假阳性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统丙烯酰胺检测技术中抗体制备效价低、重复性差的缺陷，提供一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原和特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供所述丙烯酰胺半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述丙烯酰胺半抗原、人工抗原和特异性抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

    提供一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原和特异性抗体，所述丙烯酰胺半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：

；

    其中，n=0～6。

    所述丙烯酰胺人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：

；

其中，n=0～6。

    本发明提供了所述丙烯酰胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅴ）所示分子结构的带羧基苯硫酚衍生物溶于甲醇溶液，再将带羧基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，避光搅拌，反应结束，真空抽滤，洗涤，取沉淀，干燥获得具有式（Ⅰ）所示丙烯酰胺半抗原；

其中，n=0～6；

或者将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅵ）所示分子结构的带氨基苯硫酚衍生物溶于甲醇溶液，将带氨基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，避光搅拌，反应结束，调节混合液pH值，用乙酸乙酯萃取后混合液倾入饱和氯化钠，析出沉淀即得具有式（Ⅱ）所示丙烯酰胺半抗原，

其中，n=0～6。

上述方法具体通过以下步骤来实现：

将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅴ）所示分子结构的带羧基苯硫酚衍生物,溶于无水甲醇溶液，再将带羧基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，丙烯酰胺和带羧基苯硫酚衍生物的质量比为2~3:1，37℃下避光搅拌1h，反应结束，采用真空抽滤法，加蒸馏水洗涤，取沉淀，并在37℃下真空干燥获得具有式（Ⅰ）所示丙烯酰胺半抗原；

其中，n=0～6；

或者将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅵ）所示分子结构的带氨基苯硫酚衍生物溶于无水甲醇溶液，再将带氨基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，丙烯酰胺和带氨基苯硫酚衍生物的质量比为2~3:1，37℃下避光搅拌1h，反应结束，混合液用4M盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取，取水层用4M碳酸钠调pH至9.6，用乙酸乙酯萃取，混合液倾入饱和氯化钠，析出沉淀即具有式（Ⅱ）所示丙烯酰胺半抗原，

其中，n=0～6。

本发明所述丙烯酰胺人工抗原的制备有如下两种技术方案：采用活泼酯法将如上所述具有式（Ⅰ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到如上所述具有式（Ⅲ）所示分子结构的丙烯酰胺人工抗原；或者采用重氮法将如上所述具有式（Ⅱ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到如上所述具有式（Ⅳ）所示分子结构的丙烯酰胺人工抗原。

以上两种技术方案的具体实施步骤如下：

    将具有式（Ⅰ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后得上清液；将上清液缓慢加入载体蛋白的PBS（pH8.0）缓冲溶液中，4 ℃下反应12 h；离心后，取上清夜，4 ℃下用生理盐水透析3天得到目的产物；所述丙烯酰胺半抗原与载体蛋白的质量比为1~2:1；

    或者将具有式（Ⅱ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原溶于1 mL 1 mol/L盐酸溶液中，逐滴加入1.1 mL 1 mol/L 的亚硝酸钠溶液，重氮化反应后逐滴加入到载体蛋白的PBS 溶液中，调节溶液pH 值至7.5，4 ℃下用生理盐水透析3 天得到目的产物；所述丙烯酰胺半抗原与载体蛋白的质量比为3:2~1。

    优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白、匙孔血蓝蛋白或卵清蛋白。

    本发明同时提供所述丙烯酰胺特异性单克隆抗体和多克隆抗体，以及所述丙烯酰胺人工抗原和特异性抗体在丙烯酰胺免疫检测方面的应用。

    本发明的有益效果是：

    现有的丙烯酰胺检测技术以仪器法居多，而仪器法操作繁复，前处理复杂，成本高。现有的免疫检测方法所采用的抗体均是将以丙烯酰胺自身为半抗原，与载体蛋白偶联后制备获得的抗体，存在效价低、特异性差及重复性差等不足。本发明提供了丙烯酰胺半抗原、人工抗原、特异性抗体及其制备方法与应用。其思路是将丙烯酰胺与带苯环的化合物衍生，获得分子量增大且结构特征明显的衍生物，以该衍生物为半抗原，进而制备人工抗原，免疫动物获得特异性抗体。该抗体可以特异性识别丙烯酰胺的衍生物，检测丙烯酰胺之前可以先将丙烯酰胺与带苯环的化合物衍生成半抗原，再利用其抗体检测半抗原浓度，进而推算出丙烯酰胺的浓度。该思路的有益效果体现在：（1）引入苯环结构使得丙烯酰胺的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；（2）所使用的带羧基或氨基的苯磺酸的巯基可以与丙烯酰胺的氨基快速、高效发生迈克尔加成反应，衍生效率高，时间短，重复性好；（3）本发明提供的丙烯酰胺的快速检测方法最低检测限可达1~3 ng/mL。

附图说明

图1.丙烯酰胺半抗原BⅠ(n=1)及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图2.丙烯酰胺半抗原BⅠ(n=1)及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图3.丙烯酰胺半抗原BⅡ(n=0)及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图4.丙烯酰胺半抗原BⅡ(n=0)及其包被抗原、载体蛋白紫外扫描图。

图5.以BⅠ(n=1)为半抗原所制备的抗体对半抗原BⅠ(n=1)的抑制曲线。

图6.以BⅡ(n=0)为半抗原所制备的抗体对半抗原BⅡ(n=0)的抑制曲线。

具体实施方式

    下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本技术领域常规的试剂、方法和仪器。

实施例1半抗原BⅠ(n=1)的制备：

    取0.212 g（2.9 mmoL）丙烯酰胺溶于400 μL pH为9.6的碳酸盐缓冲液中，取0.1 g（0.5 mmoL）对巯基苯乙酸溶于800 μL无水甲醇中。将上述对巯基苯乙酸的无水甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲液中，37 ℃下避光搅拌1  h。反应结束，采用真空抽滤法，加2mL一级水水洗，取沉淀，并在37℃下真空干燥，得到白色固体4-（3-氨基-3-氧代丁基硫代）苯乙酸256 mg，产率为 82.05%。ESI-MS analysis (negative) m/z 239 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) d 7.206-7.221 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.670-6.685 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.942-2.966 (m, 2H), 2.406-2.431 (m, 2H)。

实施例2  半抗原BⅡ(n=0)的制备方法

取0.284 g（3.99 mmoL）丙烯酰胺溶于400 μL 0.1 mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液中，取0.1g(0.79 mmoL)对氨基苯硫酚溶于800 μL无水乙醇中。将上述对氨基苯硫酚的无水甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲液中，37 ℃下避光搅拌1 h。反应结束，混合液用4 M盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取，取水层用4 M碳酸钠调pH至9.6，用乙酸乙酯萃取，混合液倾入饱和氯化钠，析出棕红色油状液体4-（3-氨基-3-氧代丙基硫代）苯胺297 mg，产率为77.34%。ESI-MS analysis (negative) m/z 196 [M-H]-; ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) d 7.335-7.349 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 7.233-7.247 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.579 (s, 2H), 3.144-3.168 (m,2H), 2.488-2.513 (m, 2H)。

实施例3  免疫原/包被原的制备

免疫原与包被原的制备不同之处在于载体蛋白，所述免疫原载体蛋白采用钥孔血蓝蛋白（KLH），所述包被原载体蛋白采用卵清白蛋白（OVA）。以下所述以免疫原的制备方法为例。

活泼酯法：取半抗原BⅠ(n=1) 0.0239 g (0.1 mmoL)溶于0.5 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌加入0.0512 g (0.2 mmol) 1,3-二环己基碳二亚胺（ DCC）和0.023 g (0.2 mmoL) NHS，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液。称取0.02 g载体蛋白KLH或OVA 溶于2 mL浓度为0.1 mol/L的PBS (pH8.0)溶液中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4 ℃下反应12 h。离心后，取上清夜，4 ℃下用生理盐水透析3 d，每天更换4次透析液。得到的免疫原BⅠ-KLH或包被原BⅠ-OVA。以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中。冻存于-20 ℃冰箱中，供免疫用。

重氮法：取半抗原BⅡ(n=0)0.03 g(0.15 mmoL)溶于3 mL 1 moL/L盐酸溶液中，加入800 μL 1 mol/L的亚硝酸钠溶液，4 ℃反应30 min；将0.02 g KLH或OVA溶于2 mL浓度为0.1 mol/L的PBS(pH8.0)中，搅拌反应1 h。4 ℃下用生理盐水透析3 d，每天更换4次透析液。得到的免疫原BⅡ-KLH或包被原BⅡ-OVA。以1 mg/mL的浓度分装于0.5 ml离心管中。冻存于-20 ℃冰箱中，供免疫用。

对载体蛋白，半抗原BⅠ(n=1)、半抗原BⅡ(n=0)及其相应的免疫原和包被原进行紫外扫描测定（200～400 nm），发现免疫原和包被原同时具备半抗原和载体蛋白的特征吸收峰（见图1、图2、图3和图4），说明免疫抗原和包被抗原偶联成功。

实施例4  抗体的制备及鉴定

将免疫原与等剂量的免疫佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂, 以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂）用搅拌器乳化。完全乳化后, 采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫6 只体重为2.5～3 kg 的健康新西兰大白兔。第一次免疫隔一个月后每两周加强免疫一次。第4 次加强免疫后1 周耳缘静脉采血, 并利用间接ELISA 测定血清效价。当效价不再上升时, 采用耳缘静脉加强免疫。1 周后心脏采血, 室温静置0.5～1 h, 于4 ℃冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-20 ℃下保存备用。

间接竞争ELISA 测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，结果表明以半抗原BⅠ(n=1)对应的抗血清（Ab-BⅠ）效价为1:128000，以半抗原BⅡ(n=0)对应的抗血清（Ab-BⅡ）效价为1:128000。

实施例5  抗体的特异性及灵敏度

依据如上效果，使用抗血清（Ab-BⅠ）和抗血清（Ab-BⅡ）绘制酶联免疫分析（ELISA）标准曲线；使用磷酸盐吐温缓冲液（PBST, 100 mmol/L, pH 7.4）作为所有样品的稀释液；使用BⅠ-OVA作为包被原；将50 μL 系列浓度的药物标准品和50 μL适当稀释倍数的丙烯酰胺多特异性抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值（OD）。以OD值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，应用originPro 7.5 软件四参数对数函数进行曲线拟合：

       （1）

其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大时的吸光值（OD），C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为（A＋D）/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC₅₀，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC₁₀为检测限，以IC₂₀～IC₈₀为检测范围。以2种标准品BⅠ(n=1)、BⅡ(n=0)建立ELISA的标准曲线，结果如图5和图6，相关标准曲线参数见表1和表2。结合附图及附表可知，以BⅠ为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度较好。由于样品中的丙烯酰胺与带羧基/氨基的苯硫酚衍生物可以快速、高效发生衍生反应，因此该方法可以用于间接检测食品中丙烯酰胺的含量。

表1 抗血清（Ab-BⅠ）对半抗原BⅠ(n=1)的检测参数

表2 抗血清（Ab- BⅡ）对半抗原BⅡ(n=0)的检测参数

表3 抗血清（Ab-BⅠ）对半抗原BⅠ(n=1)及其结构类似的交叉反应率

表4 抗血清（Ab- BⅡ）对半抗原BⅡ(n=0)及其结构类似的交叉反应率

Claims (10)

1.一种丙烯酰胺半抗原，其特征在于，具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：

；

其中，式（I）中n=1；式（II）中n=0。

2.一种权利要求1所述丙烯酰胺半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅴ）所示分子结构的带羧基苯硫酚衍生物溶于甲醇溶液，再将带羧基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，避光搅拌，反应结束，真空抽滤，洗涤，取沉淀，干燥获得具有式（Ⅰ）所示丙烯酰胺半抗原；

其中，n=1；

或者将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅵ）所示分子结构的带氨基苯硫酚衍生物溶于甲醇溶液，将带氨基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，避光搅拌，反应结束，调节混合液pH值，用乙酸乙酯萃取后混合液倾入饱和氯化钠，析出沉淀即得具有式（Ⅱ）所示丙烯酰胺半抗原，

其中，n=0。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅴ）所示分子结构的带羧基苯硫酚衍生物,溶于无水甲醇溶液，再将带羧基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，丙烯酰胺和带羧基苯硫酚衍生物的质量比为2~3:1，37℃下避光搅拌1h，反应结束，采用真空抽滤法，加蒸馏水洗涤，取沉淀，并在37℃下真空干燥获得具有式（Ⅰ）所示丙烯酰胺半抗原；

其中，n=1；

或者将丙烯酰胺溶于碳酸盐缓冲溶液，将具有式（Ⅵ）所示分子结构的带氨基苯硫酚衍生物溶于无水甲醇溶液，再将带氨基苯硫酚衍生物的甲醇溶液缓慢滴加到丙烯酰胺的碳酸盐缓冲溶液中，丙烯酰胺和带氨基苯硫酚衍生物的质量比为2~3:1，37℃下避光搅拌1h，反应结束，混合液用4M盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取，取水层用4M碳酸钠调pH至9.6，用乙酸乙酯萃取，混合液倾入饱和氯化钠，析出沉淀即具有式（Ⅱ）所示丙烯酰胺半抗原，

其中，n=0。

4.一种权利要求1所述半抗原获得的丙烯酰胺人工抗原，其特征在于，具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：

；

其中，式（III）中n=1；式（IV）中n=0。

5.一种权利要求4所述丙烯酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将权利要求1具有式（Ⅰ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到权利要求4具有式（Ⅲ）所示分子结构的丙烯酰胺人工抗原；或者采用重氮法将权利要求1具有式（Ⅱ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原与载体蛋白偶联制备得到权利要求4具有式（Ⅳ）所示分子结构的丙烯酰胺人工抗原。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

    将具有式（Ⅰ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，搅拌加入1,3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后得上清液；将上清液缓慢加入载体蛋白的pH8.0的PBS缓冲溶液中，4 ℃下反应12 h；离心后，取上清夜，4 ℃下用生理盐水透析3天得到目的产物；所述丙烯酰胺半抗原与载体蛋白的质量比为1~2:1；

    或者将具有式（Ⅱ）所示分子结构的丙烯酰胺半抗原溶于1 mL 1 mol/L盐酸溶液中，逐滴加入1.1 mL 1 mol/L 的亚硝酸钠溶液，重氮化反应后逐滴加入到载体蛋白的PBS 溶液中，调节溶液pH 值至7.5，4 ℃下用生理盐水透析3 天得到目的产物；所述丙烯酰胺半抗原与载体蛋白的质量比为3:2~1。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清蛋白、匙孔血蓝蛋白或卵清蛋白。

8.一种权利要求4所述人工抗原在制备丙烯酰胺抗体或在检测丙烯酰胺中的应用。

9.一种采用权利要求4 所述人工抗原制备得到的丙烯酰胺单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

10.一种权利要求9所述抗体在检测丙烯酰胺中的应用。