NO154814B - Fremgangsmaate ved immunologisk bestemmelse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte

for bestemmelse av immunologisk aktive materialer.

I de siste årene er det utviklet mange analytiske systemer basert på kompetitiv protein-bindingsanalyse (også kalt metningsanalyse).

Uttrykkene "metningsanalyse" og "kompetitiv protein-bindingsanalyse", som er synonyme, refererer til analytiske systemer som anvendes for bestemmelse av immunologisk aktive materialer (ligander). Resultatene av disse bestemmelsene i biologiske væsker anvendes i medisinsk og veterinærmedisinsk diagnose. Diagnosen avhenger av om mengden av substansen som skal bestemmes er normal eller patologisk. Det analytiske prinsippet er f.eks. basert på konkurransen mellom en ligand og en markert ligand som et felles spesifikt bindingsmiddel (reseptor) som illustert i den følgende reaksjonsligningen:

Den primære reaksjonen er en kombinasjon av et molekyl av ligand med et molekyl av reseptor som danner et bi-molekylært ligand-reseptor-kompleks (1). En ytterligere reaksjon forårsakes ved addisjon av merket ligand som på lignende måte forbindes med reseptoren under dannelse av et merket ligand/reseptor-kompleks (2). I metningsanalyse er konsentrasjonene av reseptoren og den merkede liganden konstant. Reseptorkonsentrasjonen er begrenset slik at den merkede liganden er i overskudd i forhold til reseptoren. Under disse betingelser forårsaker addisjon av liganden konkurranse mellom ligand og markert ligand i binding til reseptoren.

Derfor senker en økning av ligand-konsentrasjonen mengden av merket ligand/reseptor-kompleks. Målingsprinsippet er basert på bestemmelse av andel av totalt merket ligand bundet til reseptoren. Denne andelen er omvendt proporsjonal med mengden av ligand som tilsettes reaksjonsblandingen fra prøven som skal måles eller fra standarden som brukes ved målingen. Reduksjonen i konsentrasjonen av merket ligand/reseptor-kompleks eller økningen i konsentrasjon av merket ligand i reaksjonsblandingen kan brukes for å bestemme ligandkonsentrasjonen.

Følsomheten til metningsanalysen avhenger av bruken av en reseptor som har en meget høy affinitet til liganden og merket ligand. Dertil avhenger følsomheten også av anvendelse av en markør som kan påvises i meget lav konsentrasjon.

Metningsanalysens spesifisitet avhenger av reseptor-kapasiteten til utelukkende å binde ligand og merket ligand i en kompleks blanding av forskjellige molekyler.

Metningsanalyse er blitt anvendt ved bruk av mange forskjellige typer teknikker, hvor forskjellen primært avhenger av typen merking som brukes. Generelt klassifiseres disse teknikkene ved å anvende omfattende titler angående "radioaktiv måling" eller "ikke-radioaktiv måling", og avhenger av om en radioaktiv tracer brukes som markør.

Radioaktiv måling har blitt anvendt i større utstrekning enn ikk-radioaktive målinger. Radioaktiv måling kan videre klassifiseres som radioaktiv-immuno-måling eller radioaktiv- reseptor-måling, avhengig av typen reseptor som benyttes i målingen. I radioaktiv-immuno-måling brukes et antistoff som spesifikt binder ligand og merket ligand. Alternativt vedrører radioaktiv-reseptor-analyse bruken

av hvilken som helst annen type biologisk reseptor som på lignende måte spesifikt vil binde liganden og den merkede liganden.

I alle radioaktive målingsteknikker er det vesentlig å adskille fysikalsk den bundne fraksjon (1 og 2 ifølge likningen som er angitt tidligere) fra den ikke-bundne fraksjon (3 og 4 i den tidligere angitte ligning) i reaksjonsblandingen. En indeks på ligandkonsentrasjonen kan deretter oppnås ved å telle disse fraksjoner i et radioaktivt telleverk og sammenligne tellingene som oppnås for de ukjente prøvene med dem som oppnås for egnede standard-ligand-prøver som underkastes den samme målingen. Mange forskjellige og avvikende metoder er blitt beskrevet for adskillelse av de bundne og frie fraksjonene i den radioaktive målingsreaksjonsblandingen, og disse benytter teknikker som gelfiltrering, absorpsjon-og ionebytterkromatografi, fraksjonert felling, fast fase eller elektroforese.

Etter utviklingen av radioaktive målingsteknikker i metningsanalysen, er metoder som anvender ikke-radioaktive markører blitt utviklet. Metoder som anvender enzymer som markører er blitt vist. Disse metodene kan ha den fordel at fysikalsk adskillelse av bundne (1 + 2) og frie (3+4) fraksjoner av merket ligand ikke er nødvendig i måleprosedyren.

Når antistoffer binder ligand som er merket med et enzym, modifiseres aktiviteten av enzymet. Modifikasjonsgraden til enzymaktiviteten indikerer konsentrasjonen av den merkede liganden i den bundne fraksjonen, og gir derfor en indeks på ligandkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen.

Den kjemiske strukturen til ligand-enzym-komplekset er ekstremt vanskelig å klarlegge, og dette er en vesentlig ulempe ved enzym-immuno-målingen. Dette skyldes utvilsomt det store antall aminosyrekjeder som foreligger på enzym-overflaten ved kompleksering med liganden. Dette forårsaker store vanskeligeheter ved reproduksjon av ligand-enzymet i forskjellige fremstillinger av komplekset.

Den generelle mangel på kontroll over komplekserings-reaksjonen resulterer i tilknytningen av mange ligandmolekyler til et enzym-molekyl, skjønt det er sannsynlig at binding av bare noen få av disse ligandmolekylene ved antistoffer inngår i inhiberingen av enzymaktiviteten. Derfor resulterer ikke alle antistoff/merket antigen-forbindelser i en modifisering av enzymaktiviteten, hvilket derved senker teknikkens sensibilitet.

Protein-protein-interaksjonen mellom forskjellige anti-stoffmolekyler og antistoff og enzym-molekyler er en annen følge av antallet ligandmolekyler på enzymover-flaten. Protein-protein-interaksjonen økes videre hvis liganden også er et polypeptid. Således induserer enzym-molekylet et lokalt mikromiljø med høy proteinkonsentra-sjon. I slike situasjoner er det vist at proteinfelling opptrer, og som derved forårsaker tap av en av hovedfordelene ved enzym-immunomåling ved at separasjon av antistoffbundne og frie fraksjoner blir nødvendige.

Det er beskrevet en modifikasjon av enzymatisk immuno-måling som delvis overvinner disse problemene ved at liganden merkes med et detektormolekyl som har en lav molekylvekt. I denne målingen hindres antistoff-bindingen av merket«ligand-binding av et detektor-molekyl ved et annet antistoff som er spesifikt for detektormolekylet. Indeksgraden bestemmes ved konkurranse av binding av det frie ligand-detektormolekyl og detektor-molekyl-merket-enzym med detektor-molekyl-antistoff. Modifikasjonsgraden av enzymaktivitet bestemmes i normal enzymatisk immuno-måling, og indikerer konsentrasjonen av fritt ligand-detektor-molekyl som likeledes er en indikasjon på ligand-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen. Fordelen ved denne teknikk er at et lite molekyl fremfor et enzym knyttes til liganden, hvilket derved muliggjør at den kjemiske strukturen til den merkede liganden kan bestemmes, og overvinner således mange av de ulemper som er knyttet til de tidligere beskrevne enzymatiske immuno-målinger. Imidlertid overvinner dette systemet bare ulemper ved den primære bindingsreaksjonen som innebefatter liganden og merket ligand, og overfører dem til detektorsystemet for -bestemmelse av graden av bundet antistoff og fritt antistoff fra fraksjoner i den merkede liganden.

Ulempene ved de tidligere kjente metoder overvinnes ved foreliggende oppfinnelse, hvor et enzym-modifiseringsmiddel brukes som markør.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale i en prøve, hvor prøven bringes i kontakt med en reseptor som spesifikt kan binde det immunologisk aktive materiale, og med det immunologisk aktive materiale merket med en substans som er i stand til å modifisere graden eller typen av enzymets aktivitet, og med et enzym eller et enzymsubstrat, og hvor graden eller typen av den resulterende enzymaktivitet måles og sammenlignes med resultatene erholdt fra en standard.

Uttrykkene "immunologisk aktivt materiale" eller "ligand"

i denne beskrivelsen refererer til enhver immunologisk aktiv substans eller del av denne som er i stand til å bestemmes immunologisk, f.eks. ved å bruke metningsanalyse-teknikker. Det viktigste kravet er at det er en reseptor

som spesifikt vil binde liganden. Når reseptoren er et antistoff, vil liganden være et hapten eller antigen,

slik at det spesifikke antistoff kan dannes. En ligand i denne sammenheng er et hapten når det bare vil gi antistoff-dannelse ved tilknytning til antigen. Alternativt er en ligand i denne forbindelse et antigen når det vil gi antistoffdannelse uten kjemisk modifisering. Liganden kan variere sterkt i molekylvekt, fra 100 - 1 000 000. Dette molekylvektsområdet er ikke begrensende i målingen såfremt reseptoren er i stand til spesifikt å binde liganden.

liganden kan enten ha polymer- eller ikke-polymer struktur. Ved polymer-struktur vil liganden normalt være av biologisk opprinnelse, og kan klassifiseres som en nuklein-syre-polysakkarid og/eller polypeptid. Alternativt vil liganden, når den ikke er polymer, generelt ha en molekylvekt mindre enn 2 00 0 og kan ha ganske forskjellige strukturer, funksjonelle grupper og fysiologiske egenskaper.

Ligander av særlig betydning som kan brukes i foreliggende oppfinnelse er aminer, aminosyrer, peptider, proteiner, lipoproteiner, glykoproteiner, steroler, steroider, lipoider, nukleinsyrer, mono- eller polysakkarider, alkaloider, vitaminer, droger, narkotika, antibiotika, metabolitter, pesticider, toksiner, industrielle bi-produkter, smaksmidler, hormoner, enzymer, koenzymer, cellulære eller ekstracellulære komponenter fra vev og isolerte antistoffer fra mennesker eller dyr. Målingen er imidlertid ikke begrenset til bare disse ligandene.

Komponenter som umiddelbart egner seg for analyse i systemet er hepatitt-B overflate-antigen, ferritin, tumor antigener som CEA, Æ-føto protein, rheumatiod faktor, C-reaktive proteiner, immunoglobulin klasser IgG, IgM eller IgA, myoglobin, tyroide hormoner inklusive T_ og T^, insulin, steroide hormoner innebefattende testosteron eller estradiol, misbrukte droger innebefattende narkot-iske sovemidler som morfin, barbiturater, stimulerende midler som amfetamin, droger for behandling av epilepsi innebefattende difenyl-hdrantion og fenobarbital, krets-løps glykocytter som digoksin, vitaminer som vitamin og folinsyre. Videre antistoffer som umiddelbart er egnet for analyse i systemet er slike som forekommer ved infek-sjon av syfilis, gonoré, brucellosis, rubella og rheumat-isme.

Uttrykket "merket immunologisk aktivt materiale" eller "merket reseptor" i denne beskrivelse refererer til en ligand, analog av en ligand eller en del av denne, eller til en reseptor som er merket med et enzym-modifiseringsmiddel. En, flere enn en, og generelt mindre enn 100 molekyler av markør kan knyttes til en ligand eller et reseptormolekyl. Likeledes kan et, fler enn et, og normalt mindre enn 5 ligander eller reseptormolekyler knyttes til et markørmolekyl. Tilknytning av ekstra markørmolekyler til en ligand eller et reseptormolekyl øker generelt målings-følsomheten, forutsatt at de ekstra markørene ikke påvirker bindingen.

Tilknytning av et modifiseringsmolekyl til en ligand eller reseptormolekyl innebefatter dannelsen av inter-molekylære bindinger som i de fleste tilfeller, men ikke nødvendigvis, er av kovalent natur. Bindingen kan i noen tilfeller utføres i nærvær av et koplingsmiddel ved inn-føring av en bindingsgruppe mellom markøren og liganden eller reseptoren.

Det modifiserende molekyl kan knyttes direkte til liganden eller reseptormolekylet. Imidlertid kan det være ønskelig å innføre kjemiske broer av forskjellige lengder mellom modifiseringsmolekylet og liganden eller reseptormolekylene, avhengig av den spesifikke målingen som skal utføres. I noen tilfeller kan det også være en fordel å knytte modifiseringsmolekylet og liganden eller reseptormolekylene separat til det samme bæremolekylet, f.eks. et makromolekyl som et polypeptid eller et poly-sakkarid .

Uttrykket "reseptor" i denne beskrivelsen refererer seg til enhver substans som spesifikt kan binde liganden og merket ligand eller en del av denne. Generelt er den anvendte reseptor i målingen et spesifikt antistoff for liganden som dannes i blodet hos hvirveldyr etter injek-sjon av riktig hapten eller antigen. Alternativt kan reseptorer som opptrer i naturen også brukes i målingen. Denne siste gruppen innebefatter, men er ikke begrenset til dette, proteiner, nukleinsyrer og cellulære membraner. Slike reseptorer er blitt brukt i radioaktive måleteknikker for tyroksin, insulin, angiotensin og forskjellige s teroidhormoner.

I tilfelle liganden er et antistoff, kan reseptoren være antigenet som brukes for å indusere dette antistoffet i et vertsdyr. I en annen utførelsesform kan reseptoren være et antistoff mot antistoffet som skal bestemmes.

Det er ikke mulig å fastlegge med sikkerhet reseptorens virkemåte, som ved binding av den merkede liganden reduserer virkningen mellom enzym og modifiseringsmiddel. Den sannsynligste forklaringen er at enzymets affinitet til modifiseringsmiddelet nedsettes som følge av en størrelsesforandring og netto ladning hos reseptor/ligand-modifiseringskomplekset sammenlignet med den for ligand-modifiseringen alene.

Uttrykket "modifiseringsmiddel" i denne beskrivelsen refererer til enhver substans som er i stand til å inn-virke på et enzym slik at graden eller typen av enzymaktivitet modifiseres. Denne modifiseringen kan resultere i en inhibering, aktivering eller spesifisitetsforandring eller enhver annen egenskapsforandring hos enzymet som er påviselig enten direkte eller indirekte ved en forandring i enzymaktiviteten eller i måten av aktivitet, f.eks. en forandring i reaksjonsbetingelser som ko-faktor-behov eller pH-optimum, i kinetiske egenskaper eller i aktiverings-energi. Modifiseringsmiddelet kan variere i størrelse fra et lite molekyl til et makromolekyl, og dets innvirkning på et enzymmolekyl kan enten være reversibelt eller ir-reversibelt avhengig av om den inter-molekylære assosiasjon er av ionisk eller kovalent natur.

Målingsømfintligheten er bl.a. avhengig av reseptorens affinitet overfor liganden og modifiseringsmiddelets evne til å fremkalle en forandring i grad eller type av enzymaktivitet. Fortrinnsvis er modifikasjonen av graden eller typen av enzymaktivitet oppnåelig med en minimal konsentrasjon av modifiseringsmiddelet. Jo nærmere denne konsentrasjonen ligger enzymets på molekylær basis, desto større vil måieømfintligheten være.

Fortrinnsvis vil modifiseringsmiddelet være en enzyminhibitor som ved innvirkning på et enzym vil inhibere dets aktivitet. Virkningsmåten av inhibitoren kan være kompetitiv, non-kompetitiv, ikke-kompetitiv, allosterisk eller en kombinasjon av to eller flere av disse måtene. Fortrinnsvis bør inhibitoren ha en inhiberingskonstant (nødvendig inhibitor-konsentrasjon for 50% inhibering av

_ 3

enzymsystemet) under 10 mol pr. liter, avhengig av den foreliggende måling. Særlig foretrukket er inhiberings--15 -5

konstanten mellom 10 og 10

Ethvert enzym kan brukes i målingen, forutsatt at det eksisterer et modifiseringsmiddel som spesifikt vil modifisere enzymaktiviteten på den overfor beskrevne måte. Aktuelle enzymer er stabile, lett tilgjengelige ved lave omkostninger og har et høyt o<y>erføringstall og et enkelt utført målesystem. Fortrinnsvis er overførings-tallet (molekylprodukt som dannes pr. enzymmolekyl pr. minutt) over 100, avhengig av det spesifikke forsøk som utføres. Fortrinnsvis er overføringstallet så høyt som mulig, og minst 20 0.

Enzymmodifiseringssystemet som er spesielt egnet for den foreliggende oppfinnelse er dihydrofolat reduktase/metotreksat, dihydrofolat reduktase/4-aminopterin, dihydrofolat reduktase/andre spesifikke inhibitorer for dette enzymet, j3 -glukoronidase/4-deoksy-5-amino-glutarsyre eller derivater derav, biotin inneholdende enzymer/avidin

som karboksylase/avidin, chymotrypsin/TPCK (TPCK har formel:

X -cystationase/proparylglysin, alanin racemase/trifluoralanin, tryptofanase/trifluoralanin, tryptofan syntetase/ trifluoralanin, p> -cystationase/trifluoralanin, pyruvat-glutamat transaminase/trifluoralanin, melkesyre oksydase/ 2-hydroksy-3-butynsyre, monoamin oksydase/N,N-dimetyl propargylamin og diaminoksydase/H2N-CH2-C=C-CH2-NH2.

Bestemmelse av enzymaktivitet kan utføres ved å regulere direkte eller indirekte substratforbruket eller produk-sjonen av produktet ved passende pH og temperatur ved anvendelse av påvisningssystemer som innebefatter kolori-metri, spektrofotometri, fluorospektrofotometri, gasio-metri, termometri (varmeutvikling) eller scintillasjons-telling.

For å øke systemets ømfintlighet er det mulig å bruke bioluminescens og enzymcykliseringsteknikker, f.eks. de teknikker som er beskrevet av J.Lee et al i "Liquid Scintillation Counting: Recent Developments", Stanley

P.E. and Scoggins, B.A., Academic Press, New York, p.403

og Lowry O.H. et al i J. Biol. Chem. 236, p. 2746-2755.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan en merket ligand

brukes for bestemmelse av tilstedeværelsen av en ligand i en ukjent prøve ved den stimulante eller etterfølgende tilsitning av merket ligand og den ukjente prøven til et vandig medium ved egnet pH som inneholder en spesifikk reseptor for liganden og den merkede liganden. Etter en passende inkuberingstid bestemmes fordelingen av reseptoren bundet til ligand og merket ligand ved tilsetning av enzym og substrater. Reseptoren som er spesifikk for liganden, binder også den merkede liganden, og reduserer derved innvirkningen mellom modifiseringsmidlet og enzymet, og nedsetter derved modifiseringen av enzymaktiviteten. Tilsetning av ligand til prøven resulterer i konkurranse med den merkede ligand i binding til reseptor, og øker derved konsentrasjonen av fri merket ligand i målingen. Innvirkningen mellom ligandmodifiserings-middel og enzym økes, og enzymaktiviteten blir igjen påvirket. Modifiseringen av enzymaktiviteten er derfor en funksjon av ligandkonsentrasjonen i målingen, og bevirkes av ubundet merket ligand. Følgelig er forskjellen mellom den resulterende enzymaktivitet og den som beholdes uten ligand, et mål for konsentrasjonen av ligand i den ukjente prøven.

En av hovedfordelene ved denne metoden er at adskillelsen

av bundne og frie fraksjoner er unødvendige i fremgangs-

måten.

Denne målingen er selvfølgelig ikke begrenset til bestemmelse av haptener og antigener som liganden, men kan også tilpasses for identifisering og måling av antistoffer som liganden. Dette kan f.eks. utføres ved å merke antistoffet med et enzymmodifiseringsmiddel, og måle graden av enzymaktivitetsmodifisering etter inkubering av merket antistoff og prøve-antistoff med en begrensende konsentrasjon av antigen eller hapten. Modifiseringen av enzymaktivitet vedrører prøve-antistoff-konsentrasjonen.

Reagenser til bruk ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, også beskrevet i utlegningsskrift nr. 152.955, fremstilles på følgende måte:

Fremstilling av " amino- digoksin".

En suspensjon av 156 mg (0,2 mmol) digoksin i 5 ml absolutt etanol ble tilsatt 10 ml 0,2 M natriummeta-periodat under røring. Blandingen ble homogen etter 10 minutter, og så ble fellingen langsomt dannet. Etter 2 timer ble 5 ml vann pluss 5 ml etanol tilsatt. 122 ul (2,2 mmol) etylenglykol ble tilsatt etter ytterligere 30 minutter, og et tett nytt presipitat begynte straks å dannes. Etter 80 minutters røring ble 133 ul (2,0 mmol) etylendiamin tilsatt, og den resulterende pH på 11,0 ble justert til 9,5 med 0,1 M HC1, og reaksjonsblandingen fikk stå ved en romtemperatur i 18 timer. pH forandret seg ikke i dette tidsrommet.

151,4 mg (4,0 mmol) natriumborhydrid ble så tilsatt, og blandingen rørt i 3 1/2 time. pH ble så justert fra 10,5 til 6,5 med 1 M maursyre (ca. 3 ml) og TLC av denne blandingen viste en enkel hovedflekk med en Rf lik 0,15 (kiselgel på aluminium utviklet i butanol:iseddik:vann/ 4:1:1). Digoksin hadde en Rf på 0,7 ved utvikling i

samme system.

Løsningsmidlene ble avdampet nesten til tørrhet på en rotasjonsfordamper under vakuum ved anvendelse av et vann-bad på 60°C. De siste få ml vann ble fjernet ved tilsetning av 95% etanol (3 x 20 ml) og gjentagelse av inndampningen som ovenfor.

Det resulterende blekgule, faste stoff ble ekstrahert tre ganger med absolutt etanol, og disse kombinerte ekstraktene konsentrert i ca 4 ml og sentrifugert for å adskille en liten mengde salt, som ble kastet. Den blekgule supernatantløsningen ble inndampet til tørrhet under en strøm av tørt nitrogen, og ga en gul olje som viste samme Rf på TLC som reaksjonsblandingen som er beskrevet ovenfor. Produktet ble vist å inneholde en ■ fri aminogruppe ved å omsette den med "Fluram" (4-fenyl-spiro(fluran-2(3H),1<1->ftalan)-3,3<1->dion) under dannelse av en sterkt fluoriserende forbindelse.

Produktet hadde et spektrum i konsentrert svoverlsyre i likhet med oligoksinets med absorpsjonstopper ved 385 og 495 mu. Produktet hadde også en sterk affinitet for spesifikke antisera (kanin) for digoksin. Den sannsynligste struktur for det isolerte produkt er den følgende:

Fremstilling av metotreksat- aminodigoksin- konjugat.

11 mg metotreksat ble oppløst i 5 ml I^o og justert til pH 6,5. 10 mg "aminodigoksin" ble oppløst i denne løsningen, og volumet justert til 20 ml med vann. pH

ble justert til 6,5 og 484 mg N-etyl,N'1 -(3-dimetylamino)-propyl-karbodiimid-hydroklorid oppløst i 5 ml vann ble satt til reaksjonsblandingen. pH ble holdt på 6,2 i 24 timer ved romtemperatur. Konjugatet ble renset på kisel-gelkolonne ved anvendelse av 3% ammoniusitrat som løsningsmiddel. Fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen og vist å ha samme dobbelte evne til å binde sterke antisera (kanin) spesifikke for digoksin, og inhiberte også sterkt enzymet dihydrofolatreduktase (kyllinglever). Den sannsynligste struktur for metotreksat-aminodigoksin-konjugatet er den følgende:

Fremstilling av metotreksat- humant serumalbumin- kojugat.

45 mg metotreksat ble oppløst i 1,0 ml N,N-dimetyl-formamid og 25 mg N-hydroksysuccinimid ble tilsatt. 41 mg N,N-dicykloheksyl-karbodiimid ble oppløst, og blandingen holdt ved romtemperatur i 13 timer. Det uløselige urea-biproduktet ble fjernet ved filtrering,

og 100 ul av filtratet ble satt til en løsning som inneholdt 5 mg humant serum albumin i 80 0 pl 0,1 M natriumfosfatbuffer ved pH 7,5 pluss 100 pl dioksan.

Denne reaksjonsblandingen ble holdt ved romtemperatur

i 30 minutter, og satt på en "Sephadex G-25" kolonne som var ekvilibrert med 0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,5. Kolonnen ble utviklet med denne bufferen, og to eluerings-topper som inneholdt metotreksat ble erholdt, hvorav den første inneholdt metotreksat-humant serum albumin-konjugat.

Syntese av metotreksat- aminoetylmorfin- konjugat.

a) Syntese av O 3-aminoetylmorfin.

I 10 ml tetrahydrofuran (THF) nettopp destillert over

litiumaluminiumhydrid (LAH) ble 400 mg LAH oppslemmet under nitrogen. En løsning av 400 mg morfin og 400 mg kloracetonitril i 4 ml friskt destillert THF ble tilsatt i løpet av 5 minutter, etterfulgt av tilbakeløpskoking i 1 time. Blandingen fikk kjøles, og 0,6 ml vann ble tilsatt etterfulgt av 0,6 ml 10 vekt% natriumhydroksyd og 2 ml vann. Etter filtrering av blandingen ble saltene vasket med THF, THF-fraksjonene slått sammen, tørket over magnesiumsulfat under nitrogen, filtrert, og filtratet inndampet, hvilket ga 380 mg O 3-aminoetylmorfin.

b) Syntese av N-t-butoksykarboksyl- jf - (O 3-aminoetylmorf in) -

glutaminsyre--benzylester.

En blanding av O 3-aminoetylmorfin (50 mg fremstilt som ovenfor), N-t-BOC-glutaminsyre-cC-benzyl-ester (34 mg)

og dicykloheksylkarbodiimid (2 5 mg) i diklormetan (5 ml) ble rørt 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet med etylacetat og vasket med fortynnet natriun-karbonatoppløsning. Etylacetatløsningen ble så ekstrahert to ganger med 0,1 N saltsyre, og de kombinerte sure ekstraktene ble behandlet med tilstrekkelig 10 vekt% natriunhydroksyd-løsning til å justere pH til 8,0. Løsningen ble ekstrahert to ganger med etylacetat, og

det kombinerte etylacetat ble vasket med koksaltløsning, tørket (tørt natriumfosfat) og inndampet til det ga en fargeløs olje (36 mg). c) Syntese av glutaminsyre- «C - (O 3-amidoetylmorf in) - cf - benzylester-trifluoreddiksyresalt.

En løsning av N-t-BOC-glutaminsyre-morfinderivat (36 mg, fremstilt som ovenfor) i diklormetan (3 ml) ble rørt ved romtemperatur, og trifluoreddiksyre (1 ml) ble tilsatt. Blandingen ble rørt 15 minutter, og så inndampet til tørr-het. Resten var et fargeløst glass (40 mg). d) Syntese av metotreksat-$ -(0 3-aminoetylmorfin)- <£ - benzylester.

En løsning av 4-amino-4-deoksy-N"'"^-metylpteronsyre (37 mg) i 3 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) ble under røring ved romtemperatur behandlet med trietylamin (28 ul) og i-butyl-klorformat (25 ul), og blandingen ble rørt i 30 minutter. Den ble så satt til en blanding av morfin-derivatet (75 mg fremstilt som beskrevet under c) og trietylamin (28 ul) i DMSO (2 ml), og blandingen ble rørt ved 60°C i en time. Den avkjølte blandingen ble fortynnet med vann og ekstrahert to ganger med etylacetat. De kombinerte etylacetat-ekstrakter ble vasket med vann og så ekstrahert to ganger med 0,1 N saltsyre. De samlede sure ekstraktene ble behandlet med tilstrekkelig 10 vekt% natriumhydroksyd til å heve pH til 8,0. Blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat og

de samlede ekstraktene vasket med koksaltløsning, tørket (tørt natriumsulfat) og inndampet, hvilket ga en gul olje (15 mg). Denne ble renset ved preparativ tynnsjikt-kromatografi (TLC) på kiselgel med systemet kloroform/ metanol, 4:1. Den ønskede forbindelsen erholdtes som et gult, fast stoff ( 4 mg). e) Syntese av metotreksat- jf - ( O 3-amidoetylmorf in) .

Produktet fremstilt i d (4 mg) ble blandet med 0,1 N

natriumhydroksyd-løsning (5 ml), og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 8 timer, hvilket resulterte i en klar gul løsning.

Denne ble tilsatt o,1 N saltsyre (5 ml) og blandingen ble fylt opp til 25 ml med natriumortofosfat-buffer (0,05 M, pH 7,4), hvilket ga en løsning av den ønskede forbindelse som var egnet for bruk i enzymmålingen.

Syntese av ferritin- metotreksat- konjugat.

En løsning av humant leverferritin (1,3 mg) i natriumfosfatbuffer (0,05 M, pH 8,0, 5 ml) og 1 ml dimetyl-formamid (DMF) ble rørt ved romtemperatur, og 100 ul av en løsning oppnådd ved å behandle metotreksat (2 3 mg) i DMF (2 ml) med trietylamin (21 ul) og i-butylklorformat (15 ul) ved romtemperatur i 30 minutter ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer, og så dialysert mot 2x2 liter natriumortofosfatbuffer (0,05 M, pH 7,4 inneholdende natriumklorid 0,1 M og natriumazid 0,05 vekt%) i 24 timer. Løsningen ble så sendt gjennom en kolonne av "Sephadex G-25" innstilt med den samme buffer, og de ferritinholdige fraksjoner ble slått sammen og fyllt opp til 10 ml med buffer.

Den resulterende løsning er egnet for bruk i en enzym-immuno-måling for bestemmelsen av ferritin.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

EKSEMPEL 1.

Enzyminhibitor- immunomåling for digoksin.

100 ul ble inkubert ved 30°C i 15 minutter med 100 ul antidigoksin antistoffløsning, 100 pl NADPH-løsning,

100 pl 2-merkaptoetanol-løsning og 550 pl natriumfosfat-buf fer pH 7,5. 100 pl metotreksat-digoksin-konjugat fra tilsvarende fremstillingseksempel i beskrivelsen (70 ug pr. ml) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i 15 minutter, hvorpå 100 pl dihydrofolatreduktase-oppløsning ble tilsatt. Dihydrofolatreduktase-fremstillingen som ble anvendt ble isolert fra kylling-lever ved metoden til Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, Vol. 211, p. 1319 (1966). Blandingen ble inkubert ytterligere 3 minutter, og enzymaktiviteten bestemt ved tilsetning ~ av 100 ul dihydrofolatløsning og målt ved 340 nm i et variant spektrofotometer. Resultatene er vist i tabellen.

Reaktantene ble tilsatt i den ovenfor beskrevne rekkefolge. OD = optisk densitet.

Det fremgår av de ovenstående resultater at noen få ng digoksin i serum kan bestemmes i det beskrevne systemet.

EKSEMPEL 2

Enzyminhibitor- immunomåling for humant serum albumin.

100 ul fortynnet seum ble inkubert ved 30°C i 15 minutter med 100 ul antihuman serumalbumin-antistoff (kanin)-opp-løsning, 100 pl NADPH-oppløsning, 100 pl 2-merkaptoetanol-oppløsning og 550 pl natriumfosfatbuffer pH 7,5. 100 pl metotreksat/humant serumalbumin-konjugat (8 pg/ml) ble tilsatt, og blandingen inkubert i 15 minutter, hvoretter 100 ul dihydrofolatreduktase-oppløsning ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i ytterligere 3 minutter, og enzymaktiviteten bestemt ved tilsetning av 100 pl dihydrofolat-oppløsning og målt ved 3 40 nm på et variant spektrofotometer. Resultatene er vist i tabell II.

Det fremqår av de ovenstående resultater at noen få pg human serumalbumin kan bestemmes i det beskrevne systemet.

EKSEMPEL 3

Enzyminhibitor- immunomåling for morfin.

En blanding av 10 pl morfinløsning i passende konsentrasjon, 50 ul metotreksat -^-(0 3-amidoetylmorfin)-løsning (4 ng/

25 ml), 50 pl antimorfin-antistoffløsning, 10 pl NADPH-løsning, 10 pl 2-merkaptoetanol-løsning, 5C pl kalium-klorid-løsning, 150 pl tris-HCl-buffer (pH 7,5) inneholdende EDTA og 10 pl dihydrofolatreduktase (E.casei) løsning ble inkubert 2 0 minutter ved 3 7°C. Enzymaktiviteten i blandingen ble bestemt etter tilstetning av 10 pl dihydrofolat-løsning ved måling av forandringen i ekstink-sjon av løsningen ved 340 nm ved bruk av en "Centrifichem"-sentrifugalanalyse. Resultatene er vist i tabell III.

Den ovenstående tabell viser at med økende konsentrasjon av morfin avtar aktiviteten av dihydrofolatreduktase. Slike løsninger av morfin som inneholder 4 pg - 4 mg/ml morfin kunne bestemmes selv hvor bare 10 pl løsning var tilgjengelig. Dette betyr imidlertid ikke at dette er det krevede område, men snarere at det kan anvendes med hell.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale i en prøve karakterisert

   ved at prøven bringes i kontakt med en reseptor som spesifikt kan binde det immunologisk aktive materialet og med det immunologisk aktive materialet merket nied en substans som er i stand til å modifisere graden eller typen av aktivitet hos et enzym, og med et enzym og et enzymsubstrat, og at graden eller typen av den resulterende enzymaktivitet måles og sammenliknes med sådann erholdt med en standard.