CN103951751B - 一种a型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
一种a型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其制备方法与应用，它是以T‑2毒素作为前体，进行结构修饰，制备具有A型单端孢霉烯族毒素母核结构免疫反应性的族半抗原3‑Ac‑NEOS，并通过与大分子蛋白BSA和OVA的偶联，将只有免疫反应性的小分子半抗原转化为具有免疫原性的完全抗原，免疫动物，制备的抗血清效价较高，满足免疫学检测对抗体的要求。以该抗体为基础，建立的免疫学检测技术，操作简便，特异性强，灵敏度高，可广泛应用于食品、饲料及动物机体内A型单端孢霉烯族毒素（包括隐蔽态A型单端孢霉烯族毒素）的检测。如以该抗体制备的ELISA试剂盒可用于检测对虾体内的隐蔽态T‑2毒素。
Description
技术领域
本发明涉及一种多克隆抗体及其制备方法与应用，通过对T-2毒素进行结构修饰制备得3-乙酰基-新茄病镰刀菌烯醇半抗原，经琥珀酸酐法构建桥梁与载体蛋白联结而成适合于动物免疫的抗原体系，再经动物免疫后获得多克隆抗体，具体涉及多克隆抗体及其制备方法与其在检测A型单端孢霉烯族毒素上的应用。
背景技术
单端孢霉烯族毒素是一类化学性质相近的真菌毒素，由镰刀菌、木霉、单端孢、头孢霉、漆斑霉、轮枝孢和黑色葡萄状穗霉等属的真菌产生，该类毒素不仅污染小麦、大麦、玉米等禾谷类作物，也危害马铃薯等经济作物，以及肉、奶、蛋等畜产品。现已经鉴定出单端孢霉烯族毒素200余种，根据其化学结构，可分为A、B、C、D四类，其中以A和B型较为常见，A型在C8位上有羟基(-OH)或酯基(-COOR),B型在C8位上有羰基(-C=O)。由于单端孢霉烯族毒素具有致癌、致畸、致突变的作用，严重威胁人畜健康。加之种类繁多，且结构差异较大，故检测方法多样。另外，该类毒素的耐热和耐酸碱特性，也导致了脱除的困难。
A型单端孢霉烯族毒素(type-A trichothecene)是具有相同倍半萜化学结构的生物活性物质，主要由镰刀菌属(Fusarium)的真菌产生，其广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，常见的作物和粮食都很容易被此类毒素侵染，侵染通常发生在作物生长，储存，运输等阶段。而含有此类毒素的谷物或粮食一旦被动物或人类食用，将造成很大的危害，包括损害动物和人的细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成，还具有强致畸性，弱致癌性等。因此，寻找一种快速便捷的A型单端孢霉烯族毒素的检测方法是亟待解决的问题。
免疫学检测方法的出现，为研究A型单端孢霉烯族毒素的检测提供了良好渠道，目前国内外已有较多有关检测A型单端孢霉烯族毒素的免疫学方法的报道，然而这些方法的研究主要都是集中在对单一、游离的A型单端孢霉烯族毒素的检测上面，对A型单端孢霉烯族毒素多种残留检测包括隐蔽态的A型单端孢霉烯族的检测的研究却未见报道。在霉变谷物粮食饲料中，A型单端孢霉烯族毒素的存在经常都是以多种类残留形式存在，或以隐蔽态形式存在。
中国专利，专利公开号：CN102297904A，公开一种检测不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，其测定方法包括：气相色谱-电子捕获检测法测定，用DB-1701毛细管色谱柱分离，程序升温，不分流进样；气-质谱联用法确证，用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，程序升温，不分流进样。该方法以气相为主要仪器进行检测，检测前需要对样品衍生化，操作复杂，并且仅能对中药中两种A型单端孢霉烯族毒素进行检测，使用范围比较受限。
因此，本发明对可识别A型单端孢霉烯族毒素的多克隆抗体进行了制备。利用分子基团修饰原理对A型单端孢霉烯族毒素族半抗原的制备工艺进行了优化，大大提高了3-乙酰基-新茄病镰刀菌烯醇半抗原制备量及纯度，同时通过偶联蛋白，制备了具有免疫原性的A型单端孢霉烯族毒素族完全抗原，以此免疫新西兰种兔子，制备抗A型单端孢霉烯族毒素的多克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种可应用于检测A型单端孢霉烯族毒素（含隐蔽态A型毒素）的多克隆抗体。本发明采用化学修饰法乙酰化T-2毒素的C3位基团，得3-乙酰-T-2，并利用大鼠红细胞酶解法修饰3-乙酰-T-2的C8位侧链基团，制备得族半抗原，进而利用小分子毒素偶联大分子蛋白原理制备得具有免疫原性的族完全抗原，并以此抗原免疫新西兰种兔子，制备得高效价的抗血清，纯化后，为免疫学检测方法的建立提供灵敏度和特异性强的抗体。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工完全抗原及抗体的制备。
T-2毒素具有A型单端孢霉烯族毒素母核结构，其主要结构特性受C8位上的侧链基团所影响，通过对C8位上的侧链基团进行修饰，可以暴露出A型单端孢霉烯族毒素母核结构，制备得适用于作为A型单端孢霉烯族毒素特异性抗原决定簇的族半抗原，同时在C8位上偶联上大分子蛋白，可将只有反应原性小分子半抗原转变为具有免疫原性免疫原。A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3-Ac-NEOS，其结构式为：
本发明以3-Ac-NEOS为基础，与载体蛋白BSA和OVA相连接合成人工免疫原和包被原。其中人工免疫原再经过动物免疫，取血，分出抗全血清，纯化制得抗体；
以族半抗原3-Ac-NEOS为基础，与载体蛋白BSA相连接，合成分子式为：
以族半抗原3-Ac-NEOS为基础，与载体蛋白OVA相连接，合成分子式为：
一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体，其制备方法如下：
1. 半抗原的设计与合成
为了制备抗A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体，合成了A型单端孢霉烯族毒素族半抗原3-Ac-NEOS。
半抗原3-Ac-NEOS的合成：
1）T-2毒素乙酰化 在具塞试管中加入10 mg T-2毒素、1 mL嘧啶和2 mL醋酸酐，室温下振荡反应2h，反应完成后，取出氮吹浓缩，后加入3 mL乙醇，混匀并进行70 ℃加热氮吹浓缩，之后进行以100 mL正己烷洗柱、正己烷：乙酸乙酯（50：50）为洗脱剂150 mL洗脱的硅胶过柱，洗脱液浓缩结晶，－20 ℃保存，部分进行质谱检测；
2）半抗原3-Ac-NEOS的合成 根据Johnsen H等的红细胞酶解法制备小鼠红细胞酶解液，取制备的3-Ac-T-2毒素加入到1 mL二甲基亚砜和1 mL乙醇混匀得A液，后往A液里加入3mL红细胞酶解液，调节pH至7.4-7.5之间，放置37 ℃培养箱中乳化2 h；乳化完成后，适当氮吹浓缩后，对浓缩液先进行离子交换柱层析，以大孔树脂作为吸附剂，以丙酮作为洗脱剂，用150mL丙酮进行洗脱，对洗脱液进行旋转蒸发浓缩，浓缩到一定体积后，移入试管中，进行氮吹浓缩，浓缩完成后用蒸馏水复溶，并用20 mL三氯甲烷进行四次萃取，萃取液进行浓缩后再次用硅镁吸附剂进行过柱，分别用30 mL CHCl3 ，25 mL CHCl3（含甲醇1%），25 mLCHCl3（含甲醇2%），25 mL CHCl3（含甲醇3%）进行逐步洗脱。对洗脱液氮吹浓缩结晶，核磁共振进行检测，并同时进行液质联用检测，以此确定3-Ac-NEOS结构；
2. 人工免疫原和包被原的合成
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将4mg 3-Ac-NEOS与80mg琥珀酸酐混合溶于2 mL吡啶中，参考徐娟等的琥珀酸酐法进行构建连接臂；0.2 mL的DMF中溶解3 mg 3-Ac-NEOS-HS，制得A液；25 mL蒸馏水中溶解6mg牛血清白蛋白、4 mg EDC，制得B液；边滴加边搅拌的情况下，将A液加入B液后，加0.8 mg EDC，调pH至5.5，室温下连续搅拌24 h，后用0. 01 mol/L，pH 7. 4的PBS溶液透析5 d，每天换液一次，4 ℃下透析，透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上；制备完成后进行紫外扫描和凝胶电泳，通过紫外扫描特征峰值和电泳条带的差异来进行偶联成功与否的判定，并计算偶联比；
3. 免疫与特异性抗体制备
1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔。免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天有兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
初次免疫：取溶有400 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
加强免疫：取溶有200 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价。当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体。
上述制备的A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体可用于A型单端孢霉烯族毒素的免疫检测。
免疫分析方法的建立和测定条件的优选：
利用方阵滴定法分别确定抗原抗体结合效价、亲和性以及抗体和酶标二抗的最佳工作浓度。根据间接ELISA绘制针对A型单端孢霉烯族毒素的间接竞争抑制标准曲线，并计算出IC50，和检测限。计算抑制率，后以抑制率值为纵坐标，以毒素浓度的100倍的对数值为横坐标，绘制间接竞争标准曲线。抑制率=1-(B-b)/(Bo-b)*100% （B是加入了浓度除0外竞争毒素的反应孔的OD值；Bo是加入竞争毒素浓度为0的反应孔的OD值；b是以加入PBS作为反应液的空白孔的OD值）。
抑制率为0.5对应的毒素浓度即为半数竞争抑制浓度IC50，抑制率为0.1对应的毒素浓度即为，毒素的检测限。
抗体特异性：以抗体与结构类似化合物的交叉反应程度，以抑制抗体最大结合率的50%所需目标分析物的浓度IC50i与所需各种结构类似化合物的浓度IC50M之间的百分数表示，即交叉反应率C.R(%)，C.R(%)=IC50i/IC50M*100。
交叉反应越小，抗体特异性越高。
上述制备的的抗体可应用于A型单端孢霉烯族毒素的免疫检测方法中，其方法如下：
1）96孔酶标板中加入200µL最佳包被浓度包被原，4 ℃包被过夜；
2）过夜后，用PBST洗涤3次，每次3 min。每孔加入200 µL封闭液，37 ℃孵育1 h；
3）PBST同上洗涤3次，依次加入100 µL毒素标品（浓度分别为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.000 µg/mL）与待测样品；
4）后各加入100 µL两倍最佳抗体工作浓度的抗体，37 ℃下孵育1 h；
5）PBST洗涤3次后加入100 µL适当稀释度(1：3000)的HRP标记的羊抗兔IgG ，孵育1h，洗涤；
6）加入100 µL TMB显色工作液，显色15 min，后加终止液，测定各孔的OD450nm值，根据建立的标准曲线和检测的OD450nm值，分析样品中毒素含量。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
与其他方法相比，本发明具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。该抗体适合应用于A型单端孢霉烯族毒素多残留免疫检测。该设计、合成的半抗原与目标待测物相似程度高，对待测物的特征结构保留完整，为制备特异性良好的抗体奠定了基础。制备的抗体具有良好的特异性和灵敏度，检测限以T-2毒素为例可达49 ng/mL，且抗体的效价可达1：64000，表明了制备的抗原具有很好的免疫原性。
经实验证实，上述半抗原，其合成方法简便，且合成效率高、反应步骤少，半抗原合成只需两步反应即可合成，提高了反应的可控性。另外，合成产物偶联蛋白制备的免疫原，具有较强的免疫原性，兔子在经五次加强免疫反应后，即可得到高效价抗血清。
本发明为免疫学快速检测技术的建立提供了可靠的抗体。
附图说明
图1为T-2毒素的结构式；
图2为半抗原3-Ac-NEOS结构式；
图3为免疫原合成路线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围，本发明具体实施方式是通过制备和应用两方面进行实施的。
实施例1
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体的制备方法，是由下述步骤制得：
（1）半抗原的设计与合成：
为制备抗A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及包被原，合成A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3-Ac-NEOS；3-Ac-NEOS的合成：
1）以T-2毒素作为反应底物，加入无水吡啶和醋酸酐，对T-2毒素C3位羟基进行乙酰化，制备得3-乙酰基-T-2，对反应产物进行硅胶过柱纯化，以正己烷/乙酸乙酯50：45作为洗脱剂。洗脱液浓缩后，进行质谱鉴定；
质谱分析：检测所得的最强离子峰的m/z为524.66[M+18]+，得分子量为508与目标产物3-Ac-T-2毒素的理论分子量相符；
2）利用大鼠的红细胞酶解液酶解处理3-乙酰基-T-2，制备得3-Ac-NEOS，对所得产物，先进行大孔树脂过柱纯化，后再经硅镁吸附剂柱进行纯化，分别以丙酮和氯仿作为洗脱液，纯化后对产物进行浓缩结晶，并进行结构鉴定；
结构分析：一级质谱检测最强峰441.45[M+18]+符合已知3-Ac-NEOS的理论分子量；二级质谱，显示了特征子离子峰303.03；1H-NMR在2.022，2.181和2.245分别具有较强的峰，为目标产物3-Ac-NEOS三个乙酰基特征峰，并且在4.123出现峰，为C8位羟基所产生；
（2）人工抗原的合成
用琥珀酸酐法在半抗原3-Ac-NEOS的C8位羟基上构建酰胺基连接臂，并通过碳二亚胺法，分别连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上，合成人工免疫原和人工包被原，具体做法如下：
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将3 mg 3-Ac-NEOS与75 mg琥珀酸酐混合溶于3 mL吡啶中，蒸气浴下反应5 h，间歇性加入丙酮，后溶液呈淡黄，后将反应混合物用氮气吹干，复溶于3 mL氯仿中，蒸馏水水洗四次，对抽提物进行浓缩干燥，制备得3-Ac-NEOS-HS；
3-Ac-NEOS-HS-BSA制备，将3 mg 3-Ac-NEOS-HS用0. 3 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶解，制得A液；4 mg BSA、4 mg EDC加23 mL蒸馏水溶解，制得B液；将A液逐滴加入B液中，边加边搅拌；13 min后，加2 mg EDC，室温、pH 5. 7条件下继续搅拌19 h，后用PBS溶液（0. 02mol/L，pH 7.3）透析4 d，每天换液一次。透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上；
（3）免疫和特异性抗体制备：
1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔，免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天有兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
初次免疫：取溶有350 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.8% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
加强免疫：取溶有350 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.8% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体；
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体在A型单端孢霉烯族毒素的免疫检测方法中的应用，该方法如下：
1）96孔酶标板中加入150 µL最佳包被浓度包被原，4 ℃包被过夜；
2）过夜后，用PBST洗涤3次，每次4 min。每孔加入150 µL封闭液，37 ℃孵育1 h；
3）PBST同上洗涤3次，依次加入，80 µL毒素标品（浓度分别为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.000 µg/mL）与样品处理样；
4）后各加入80µL两倍最佳抗体工作浓度的抗体，37 ℃下孵育1 h；
5）PBST洗涤3次后加入80µL适当稀释度（1：3000）的HRP标记的羊抗兔IgG ，孵育1h，洗涤；
6）加入80 µL TMB显色工作液，显色15 min。后加终止液，测定各孔的OD450nm值。根据建立的标准曲线和检测的OD450nm值，分析样品中毒素含量。
实施例2
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体的制备方法，是由下述步骤制得：
（1）半抗原的设计与合成：
为制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及包被原，合成A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3-Ac-NEOS；3-Ac-NEOS的合成：
1）以T-2毒素作为反应底物，加入无水吡啶和醋酸酐，对T-2毒素C3位羟基进行乙酰化，制备得3-乙酰基-T-2，对反应产物进行硅胶过柱纯化，以正己烷/乙酸乙酯50：50作为洗脱剂。洗脱液浓缩后，进行质谱鉴定；
质谱分析：检测所得的最强离子峰的m/z为526.66[M+18]+，得分子量为508与目标产物3-Ac-T-2毒素的理论分子量相符；
2）利用大鼠的红细胞酶解液酶解处理3-乙酰基-T-2，制备得3-Ac-NEOS，对所得产物，先进行大孔树脂过柱纯化，后再经硅镁吸附剂柱进行纯化，分别以丙酮和氯仿作为洗脱液，纯化后对产物进行浓缩结晶，并进行结构鉴定；
结构分析：一级质谱检测最强峰442.45[M+18]+符合已知3-Ac-NEOS的理论分子量；二级质谱，显示了特征子离子峰305.03；1H-NMR在2.024，2.182和2.246分别具有较强的峰，为目标产物3-Ac-NEOS三个乙酰基特征峰，并且在4.122出现峰，为C8位羟基所产生；
（2）人工抗原的合成
用琥珀酸酐法在半抗原3-Ac-NEOS的C8位羟基上构建酰胺基连接臂，并通过碳二亚胺法，分别连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上，合成人工免疫原和人工包被原；具体做法如下：
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将4 mg 3-Ac-NEOS与80 mg琥珀酸酐混合溶于2 mL吡啶中，蒸气浴下反应4 h，间歇性加入丙酮，后溶液呈淡黄；后将反应混合物用氮气吹干，复溶于4 mL氯仿中，蒸馏水水洗四次，对抽提物进行浓缩干燥，制备得3-Ac-NEOS-HS；
3-Ac-NEOS-HS-BSA制备，将2 mg 3-Ac-NEOS-HS用0. 2 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得A液；5 mg BSA、3 mg EDC加25 mL蒸馏水溶解，制得B液；将A液逐滴加入B液中，边加边搅拌；10 min后，加1 mg EDC，室温、pH 5. 5条件下继续搅拌18 h，后用PBS溶液（0. 01mol/L，pH 7.4）透析3 d，每天换液一次，透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上；
（3）免疫和特异性抗体制备：
1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔，免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天有兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
初次免疫：取溶有400 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
加强免疫：取溶有200 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价。当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体；
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体在A型单端孢霉烯族毒素的免疫检测方法中的应用，该方法如下：
1）96孔酶标板中加入200 µL最佳包被浓度包被原，4 ℃包被过夜；
2）过夜后，用PBST洗涤3次，每次3 min。每孔加入200 µL封闭液, 37 ℃孵育1 h；
3）PBST同上洗涤3次，依次加入100 µL毒素标品（浓度分别为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.000 µg/mL）与样品处理样；
4）后各加入100 µL两倍最佳抗体工作浓度的抗体，37 ℃下孵育1 h；
5）PBST洗涤3次后加入100 µL适当稀释度（1：3000）的HRP标记的羊抗兔IgG，孵育1h，洗涤；
6）加入100 µL TMB显色工作液，显色15 min，后加终止液，测定各孔的OD450nm值，根据建立的标准曲线和检测的OD450nm值，分析样品中毒素含量。
实施例3
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体的制备方法，是由下述步骤制得：
（1）半抗原的设计与合成：
为制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及包被原，合成A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3-Ac-NEOS；3-Ac-NEOS的合成：
1）以T-2毒素作为反应底物，加入无水吡啶和醋酸酐，对T-2毒素C3位羟基进行乙酰化，制备得3-乙酰基-T-2，对反应产物进行硅胶过柱纯化，以正己烷/乙酸乙酯45：50作为洗脱剂。洗脱液浓缩后，进行质谱鉴定；
质谱分析：检测所得的最强离子峰的m/z为526.66[M+18]+，得分子量为508与目标产物3-Ac-T-2毒素的理论分子量相符；
2）利用大鼠的红细胞酶解液酶解处理3-乙酰基-T-2，制备得3-Ac-NEOS，对所得产物，先进行大孔树脂过柱纯化，后再经硅镁吸附剂柱进行纯化，分别以丙酮和氯仿作为洗脱液，纯化后对产物进行浓缩结晶，并进行结构鉴定；
结构分析：一级质谱检测最强峰442.45[M+18]+符合已知3-Ac-NEOS的理论分子量；二级质谱，显示了特征子离子峰305.03；1H-NMR在2.024，2.182和2.246分别具有较强的峰，为目标产物3-Ac-NEOS三个乙酰基特征峰，并且在4.122出现峰，为C8位羟基所产生；
（2）人工抗原的合成
用琥珀酸酐法在半抗原3-Ac-NEOS的C8位羟基上构建酰胺基连接臂，并通过碳二亚胺法，分别连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上，合成人工免疫原和人工包被原；具体做法如下：
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将3mg 3-Ac-NEOS与85 mg琥珀酸酐混合溶于3 mL吡啶中，蒸气浴下反应3 h，间歇性加入丙酮，后溶液呈淡黄，后将反应混合物用氮气吹干，复溶于3 mL氯仿中，蒸馏水水洗四次，对抽提物进行浓缩干燥，制备得3-Ac-NEOS-HS；
3-Ac-NEOS-HS-BSA制备，将3 mg 3-Ac-NEOS-HS用0. 3 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶解，制得A液；4 mg BSA、4 mg EDC加30 mL蒸馏水溶解，制得B液；将A液逐滴加入B液中，边加边搅拌；10 min后，加2 mg EDC，室温、pH 5. 7条件下继续搅拌18 h，后用PBS溶液（0. 02mol/L， pH 7.4）透析3d，每天换液一次，透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上。
（3）免疫和特异性抗体制备：
1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔，免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天有兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
初次免疫：取溶有450 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.8% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
加强免疫：取溶有450 µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.8% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体；
A型单端孢霉烯族毒素人工抗原和抗体在A型单端孢霉烯族毒素的免疫检测方法中的应用，该方法如下：
1）96孔酶标板中加入150 µL最佳包被浓度包被原，4 ℃包被过夜；
2）过夜后，用PBST洗涤3次，每次3 min，每孔加入150 µL封闭液， 37 ℃孵育1 h；
3）PBST同上洗涤3次，依次加入，150 µL毒素标品（浓度分别为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.000 µg/mL）与样品处理样；
4）后各加入150 µL两倍最佳抗体工作浓度的抗体，37 ℃下孵育1 h；
5）PBST洗涤3次后加入150 µL适当稀释度(1：3000)的HRP标记的羊抗兔IgG，孵育1h，洗涤；
6）加入150 µL TMB显色工作液，显色15 min，后加终止液，测定各孔的OD450nm值，根据建立的标准曲线和检测的OD450nm值，分析样品中毒素含量。
实施例4
A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体的制备及其效价测定
一、制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体
现用本发明的方法制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体，包括以下步骤：
1. A型单端孢霉烯族毒素族半抗原的制备
1）T-2毒素乙酰化 在具塞试管中加入10 mg T-2毒素、1 mL嘧啶和2 mL醋酸酐，室温下振荡反应2 h，反应完成后，取出氮吹浓缩，后加入3mL乙醇，混匀并进行70 ℃加热氮吹浓缩，之后进行以100 mL正己烷洗柱、正己烷：乙酸乙酯（50：50）为洗脱剂150 mL洗脱的硅胶过柱。洗脱液浓缩结晶，－20 ℃保存，部分进行质谱检测；
2）半抗原3-Ac-NEOS的合成 根据Johnsen H等的红细胞酶解法[101]制备小鼠红细胞酶解液，取制备的3-Ac-T-2毒素加入到1 mL二甲基亚砜和1 mL乙醇混匀得A液，后往A液里加入3mL红细胞酶解液，调节pH至7.4-7.5之间，放置37 ℃培养箱中乳化2 h。乳化完成后，适当浓缩。对浓缩液先进行离子交换柱层析，以大孔树脂作为吸附剂，以丙酮作为洗脱剂，用150mL丙酮进行洗脱，对洗脱液进行旋转蒸发浓缩，浓缩到一定体积后，移入试管中，进行氮吹浓缩，浓缩完成后用蒸馏水复溶，并用20 mL三氯甲烷进行四次萃取，萃取液进行浓缩后再次用硅镁吸附剂进行过柱，分别用30 mL CHCl3 ，25 mL CHCl3（含甲醇1%），25 mLCHCl3（含甲醇2%），25 mL CHCl3（含甲醇3%）进行逐步洗脱。对洗脱液氮吹浓缩结晶，核磁共振进行检测结构，并同时进行质谱检测，以此确定3-Ac-NEOS结构。
2. 人工免疫原和包被原的合成
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂。将4 mg 3-Ac-NEOS与80mg琥珀酸酐混合溶于2 mL吡啶中，参考徐娟等的琥珀酸酐法进行构建连接臂。0.2 mL的DMF中溶解3 mg 3-Ac-NEOS-HS，制得A液；25 mL蒸馏水中溶解6 mg牛血清白蛋白、4 mg EDC，制得B液。边滴加边搅拌的情况下，将A液加入B液；后，加0.8 mg EDC，调pH至5.5。室温下连续搅拌24 h，后用0. 01 mol/L，pH 7. 4的PBS溶液透析5d，每天换液一次，4℃下透析。透析完成后，分装冷冻干燥。包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上。制备完成后进行紫外扫描和凝胶电泳，通过紫外扫描特征峰值和电泳条带的差异来进行偶联成功与否的判定，并计算偶联比。
3. 免疫动物
取400 µg制备好的免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA溶于0.9% NaCl溶液1mL后，与弗氏完全佐剂等体积混合，以连接器进行来回抽打，充分乳化致使形成油包水状，后进行皮下注射；
此后每隔2周用200µg 3-Ac-NEOS-HS-BSA与等量弗氏不完全佐剂混匀，腹腔注射。最后一次脾内免疫200µg 3-Ac-NEOS-HS-BSA作为加强免疫；
表1 兔子的免疫过程
| 免疫次序 | 动物数(只) | 间隔时间（d） | 佐剂类型 | 剂量（µg/只） | 免疫途径 |
| 1 | 3 | 14 | 完全佐剂 | 400 | 皮下 |
| 2 | 3 | 14 | 不完全佐剂 | 200 | 皮下 |
| 3 | 3 | 14 | 不完全佐剂 | 200 | 皮下 |
| 4 | 3 | 14 | 不完全佐剂 | 200 | 皮下 |
| 5 | 3 | 14 | 不完全佐剂 | 200 | 皮下 |
| 6 | 3 | 14 | 不完全佐剂 | 200 | 皮下 |
4. A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体的获得
抗血清效价检测采用耳静脉取血，最后的取血采用兔子心脏取血。兔血存于50 mL离心管中，至于4℃冰箱中，倾斜45度过夜保存。过夜后，血清析出，用一次性吸管吸出保存于50mL离心管中，残渣于冷冻离心机中，3000 r/min、4 ℃离心15 min，吸取上清，合并于先前血清离心管中，接着以4000 r/min、4 ℃离心10 min，加入叠氮钠（0.02%）和甘油（50%）混合分装，保存于-20 ℃。
（1）抗血清效价的测定
抗血清效价的检测采用间接ELISA法：
A. 96孔酶标板内每孔加入100 µL 10 µg/mL的包被原，冰箱内4 ℃过夜；
B. 移去，PBST洗涤3次，每次3 min；
C. 拍干，加入150 µL封闭液，37 ℃封闭2 h；
D. PBST重复洗涤3次，拍干，加入不同稀释度阴性和阳性血清（1: 1000, 1:2000,1:4000, 1:8000, 1: 16000, 1:32000, 1:64000, 1: 128000），每孔100µL，各设三个平行37 ℃下孵育1 h；
E. 同上洗涤拍干，加入适当稀释度（1:3000）的酶标二抗（HRP-羊抗兔IgG）， 每孔100µL，37℃孵育1h；
F. 同上洗涤三次拍干后，加入TMB显色工作液，每孔100 µL，37 ℃下反应 15min；
G. 加入终止液，每孔50 µL，置于酶标仪下检测OD450nm值，以阳性血清的OD450nm与对应阴性血清的OD450nm的比值大于2.1为判断标准，抗血清效价即为大于2.1的抗血清最大稀释倍数；
（2) 抗血清的纯化
利用饱和硫酸铵对抗血清进行纯化：
A. 配制饱和硫酸铵及PBS（pH 7.0，0.02 mol/L），分别至于冰箱4 ℃预冷，取出20mL血清，与等体积PBS混合，边搅拌边逐滴加入到预冷的40 mL饱和硫酸铵溶液中，得A液，将A液并放置冰箱中过夜保存；
B. 取出A液放置冷冻离心机中，4 ℃ 、12000 r/min条件下离心10 min，弃上清，加入20 mL 预冷PBS（pH 7.0，0.02 mol/L）复溶，加入40/3 mL预冷的饱和硫酸铵（逐滴加入），4 ℃静置1h；
C. 步骤同B，改饱和硫酸铵用量为20/3 mL；
D. 步骤同B，离心完成后，弃上清，取20 mL PBS（pH 7.0，0.02 mol/L）复溶沉淀，装入透析袋中；
E. 在4 ℃冰箱中进行透析，透析液用PBS（pH 7.0，0.02 mol/L），每天换液两次，于第三天用蔡氏试剂检测透析液，无黄色则终止透析；
F. 透析完成后，将溶液分装，冷冻干燥，保存于-20 ℃冰箱。
实施例5
含有A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体的ELISA试剂盒检测A型单端孢霉烯族毒素。
一、含有A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体的ELISA试剂盒制备
将实施例1制备的多克隆抗体与作为第二抗体的经过辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，显色A液：TMB-显色液100 mL，显色B液：3',3',5',5'-四甲基联苯胺(TMB)液5 mL，洗涤及稀释液PBST 50mL，封闭液1%BSA 10 mL，包被液0. 05 M pH 9. 6碳酸氢钠50 mL,H2SO4终止液10mL共同包装，得到检测A型单端孢霉烯族毒素的ELISA试剂盒。
二、A型单端孢霉烯族毒素的检测
以广东海洋大学食品科技学院水产品质量与安全方向制备的染毒凡纳滨对虾为例，用步骤一制备的试剂盒测定染毒对虾体内的隐蔽态T-2毒素，具体方法包括以下步骤：
1）根据国标方法，对染毒对虾样品进行前处理，提取对虾体内的隐蔽态T-2毒素；
2）96孔酶标板中加入200 µL最佳包被浓度包被原，4 ℃包被过夜；
3）过夜后，用PBST洗涤3次，每次3 min。每孔加入200 µL封闭液, 37 ℃孵育1 h；
4）PBST同上洗涤3次，依次加入100 µL毒素标品（浓度分别为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.000 µg/mL）与样品处理样；
5）后各加入100 µL两倍最佳抗体工作浓度的抗体，37 ℃下孵育1 h；
6）PBST洗涤3次后加入100 µL适当稀释度（1：3000）的HRP标记的羊抗兔IgG，孵育1h，洗涤；
7）加入100 µL 配好的显色工作液，显色15 min。后加终止液，测定各孔的OD450nm值。根据建立的标准曲线和检测的OD450nm值，分析样品中毒素含量。
Claims (1)
1.一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆体的制备方法，其特征在于：是由下述步骤制得：
（1）半抗原的设计与合成：
为制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及包被原，合成A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3-Ac-NEOS；3-Ac-NEOS的合成：
1)以T-2毒素作为反应底物，加入无水吡啶和醋酸酐，对T-2毒素C3位羟基进行乙酰化，制备得3-乙酰基-T-2，对反应产物进行硅胶过柱纯化，以正己烷/乙酸乙酯50:50作为洗脱剂，进行质谱分析；
质谱分析：检测所得的最强离子峰的m/z为526.66[M+18]+，得分子量为508与目标产物3-Ac-T-2毒素的理论分子量相符；
2)利用大鼠的红细胞酶解液酶解处理3-乙酰基-T-2，制备得3-Ac-NEOS，对所得产物，先进行大孔树脂过柱纯化，后再经硅镁吸附剂柱进行纯化，分别以丙酮和氯仿作为洗脱液，纯化后对产物进行浓缩结晶，并进行结构鉴定；
结构分析：一级质谱检测最强峰442.45[M+18]+符合已知3-Ac-NEOS的理论分子量MW=424；二级质谱，显示了特征子离子峰305.03；1H-NMR在2.024，2.182和2.246分别具有较强的峰，为目标产物3-Ac-NEOS三个乙酰基特征峰，并且在4.122出现峰，为C8位羟基所产生；
（2）人工抗原的合成
用琥珀酸酐法在半抗原3-Ac-NEOS的C8位羟基上构建酰胺基连接臂，并通过碳二亚胺法，分别连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上，合成人工免疫原和人工包被原；具体做法如下：
通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将4mg 3-Ac-NEOS与80mg琥珀酸酐混合溶于2mL吡啶中，蒸气浴下反应4h，间歇性加入丙酮，后溶液呈淡黄，后将反应混合物用氮气吹干，复溶于4mL氯仿中，蒸馏水水洗四次，对抽提物进行浓缩干燥，制备得3-Ac-NEOS-HS；
3-Ac-NEOS-HS-BSA制备：将2 mg 3-Ac-NEOS-HS用0. 2 mL二甲基甲酰胺DMF溶解，制得A液；5 mgBSA、3 mg EDC加25 mL蒸馏水溶解，制得B液，将A液逐滴加入B液中，边加边搅拌；10 min后，加1 mg EDC，室温、pH值5. 5条件下继续搅拌18 h，后用PBS溶液透析3d，每天换液一次，透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA制备同上：
（3）免疫和特异性抗体制备：
1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔，免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天在兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；
初次免疫：取溶有400µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
加强免疫：取溶有200µg族完全抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；
2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体；
所述的A型单端孢霉烯族毒素母核免疫反应性的族半抗原，其结构为：
以半抗原3-Ac-NEOS为基础，与载体蛋白BSA相连接，合成分子式为：
的化合物为人工免疫原。
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