CN107602701A - 基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法。本发明采用玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库；以2D3抗体为靶标物，采用四轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体；本发明采用玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代玉米赤霉烯酮标准物ELISA法测定天然污染的玉米、饲料样品，并与HPLC检测结果进行比对，两种方法的相关性较好，R²为0.997，证明玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代标准物法结果准确、可靠，是一种有效、可行的绿色免疫分析方法。

Description

基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是镰刀菌产生的真菌毒素，主要污染玉米、小麦以及高粱等谷类作物，具有生殖毒性、免疫毒性和潜在致癌性等。该毒素可通过污染谷物及其制品或残留有ZEN的肉、奶等进入人和动物体内，给畜牧业发展和人类健康造成严重威胁。鉴于玉米赤霉烯酮在农产品、食品中的广泛污染及居民膳食中的暴露水平，大多数国家现已制定了谷物及制品中ZEN的最大允许量。

目前，用于ZEN检测的方法有薄层层析法、高效液相色谱法、免疫分析法和电化学传感器等。其中，免疫分析法基于抗原抗体特异性结合，具有检测灵敏度高、特异性好、前处理简便、分析快速、成本低廉等优点，适用于食品安全检测中的批量样品的快速筛检。但建立该方法，需使用大量ZEN标准物及有机溶剂合成检测抗原，同时还需ZEN标准物建立标准曲线，对操作人员的身体健康存在着潜在的危害。另外，实验过程中的废液，还可能造成周边环境的二次污染。

1963年，Oudin等提出独特位的概念，独特位是指抗体V区的抗原表位，包括超变区和骨架区。1974年，Jerne提出“免疫网络学说”(Immune Network Theory)，即免疫系统的各个细胞，相互识别、刺激、制约，形成复杂的动态平衡网络结构。此网络的核心是抗体上的独特型(Idiotype,Id)，独特型具有抗原性，能诱导机体产生抗独特型抗体(anti-idiotypicantibody,Anti-Id或AId)，简称抗-Id。抗-Id可分为α、β、γ和ε四种类型，Ab2β识别Ab抗原结合位点，可与半抗原竞争结合Ab1，模拟原始抗原的三维构象，起到替代抗原分子的作用。

采用多克隆抗体技术制备抗独特型抗体生产技术相对简单，容易操作，费用较低，但血清的后期纯化较为繁琐，且单次产量有限。而采用单抗法，生产周期长，制备过程也比较复杂，所需成本偏高，细胞融合率和阳性率均远低于Ab₁类单抗，但此方法一旦成功，所得的杂交瘤细胞株可长期稳定保存，实现一劳永逸地制备大量AId，而且方法简单，抗体质量高，性质均一稳定。噬菌体抗体库技术制备AId简便、快速、经济，所得抗体分子量小、免疫原性低、基因型和表型一致，为制备人源化抗体创造了新的方法，但此法要求抗体库库容量很高、多样性丰富，后期筛选方法也要合适，否则难以获得性能优良的AId。利用AId模拟有毒有害小分子抗原已成为近些年来的研究热点。抗独特型抗体可以模拟抗原与抗体发生特异性结合，因此，可作为传统免疫分析法中的抗原和标准品的替代物，用于有毒有害物质的绿色无毒免疫检测中。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体，通过如下方法制备得到：以玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3免疫羊驼，通过提取羊驼血清中的淋巴细胞RNA，克隆重链抗体可变区VHH基因，以pComb3X为载体构建噬菌体展示纳米抗体免疫文库，并对文库进行鉴定，测定其滴度、库容量，分析文库的多样性，再以玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3抗体为靶标物，对纳米抗体免疫文库进行淘选，获得阳性噬菌体展示的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体作为替代抗原在绿色免疫分析中的应用。

一种基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮ELISA分析方法，包括如下步骤：

(1)玉米赤霉烯酮抑制标准曲线的建立：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后替代抗原包被于酶标板，以玉米赤霉烯酮标准品作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，以玉米赤霉烯酮标准品浓度对数值为横坐标，以结合率B/B₀值作为纵坐标，建立ELISA检测标准曲线；

(2)玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线的建立：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后替代抗原包被于酶标板，以玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，以玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度对数值为横坐标，以结合率B/B₀值作为纵坐标，建立ELISA检测标准曲线；

(3)由玉米赤霉烯酮抑制标准曲线和玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线计算出结合率B/B₀在20％～80％范围内对应的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度和玉米赤霉烯酮标准品浓度，以每一个结合率B/B₀值对应的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度为横坐标，以相同结合率B/B₀值所对应的玉米赤霉烯酮标准品浓度为纵坐标，建立玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体与玉米赤霉烯酮标准品的线性关系曲线；

(4)ELISA法测定样品中玉米赤霉烯酮含量：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后包被于酶标板，加入样品作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，将结合率B/B₀值代入步骤(2)所建立的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线，计算得到抗独特型纳米抗体的浓度，然后将计算所得抗独特型纳米抗体的浓度代入步骤(3)所建立的线性关系曲线，换算得到玉米赤霉烯酮含量。

上述方案中，所述竞争抑制ELISA反应的操作过程为：(1)将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后包被于酶标板，4℃包被过夜；次日，用封闭液进行封闭，37℃下孵育1.5h；(2)向酶标孔中加入甲醇/磷酸盐缓冲液，将2D3抗体和竞争物用磷酸盐缓冲液稀释后加入到酶标孔中，37℃孵育1h；(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃温育1h；(4)加入显色液，37℃反应15min后，测定OD₄₅₀。

上述方案中，所述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的包被浓度13.54ng/mL～20.31ng/mL。

上述方案中，所述封闭液为3％BSA、1.5％OVA、5％脱脂奶粉或1.5％明胶。

上述方案中，所述甲醇/磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

上述方案中，所述甲醇/磷酸盐缓冲液中甲醇浓度为5％～10％。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库，且库容量高，多样性好；以2D3抗体为靶标物，采用四轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体；

(2)本发明将阳性噬菌体玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体基因转化到表达菌株，经诱导表达、纯化、鉴定，获得性能优良的蛋白形式纳米抗体；通过优化包被浓度、2D3抗体工作浓度、封闭试剂、pH、甲醇浓度，建立基于纳米抗体替代抗原的VHH-ELISA；

(3)本发明建立了基于玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的竞争抑制ELISA曲线以及玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体与玉米赤霉烯酮标准品之间的线性关系曲线，通过二步换算，可以应用于样品中玉米赤霉烯酮含量的检测分析；

(4)本发明选用玉米、饲料等样品测定玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代玉米赤霉烯酮标准物ELISA的添加回收率，回收率在80.8％～101.3％之间，准确度良好；本发明采用玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代玉米赤霉烯酮标准物ELISA法测定天然污染的玉米、饲料样品，并与HPLC检测结果进行比对，两种方法的相关性较好，R²为0.997，证明玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代标准物法结果准确、可靠，是一种有效、可行的绿色免疫分析方法。

附图说明

图1为用于判断噬菌体展示纳米抗体免疫文库多样性的测试结果。

图2为phage-ELISA鉴定阳性克隆。

图3为噬菌体展示纳米抗体氨基酸序列。

图4为VHH-8#与抗玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A(简称OTA)、呕吐毒素(简称DON)、T-2毒素单克隆抗体的结合情况。

图5为VHH-8#经不同温度温育后的竞争抑制曲线。

图6为棋盘法优化VHH-8#包被浓度和2D3工作浓度。

图7为封闭试剂对VELISA的影响。

图8为磷酸盐缓冲液pH值对VELISA的影响。

图9为盐离子浓度对VELISA的影响。

图10为甲醇浓度对VELISA的影响。

图11为基于VHH-8#的VELISA对赭曲霉毒素A、呕吐毒素、T-2毒素的交叉反应情况。

图12为VHH-8#作竞争原标准曲线。

图13为玉米赤霉烯酮作竞争原标准曲线。

图14为VHH-8#与玉米赤霉烯酮浓度间的线性关系。

图15为替代标准物ELISA与HPLC结果比对。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1噬菌体展示纳米抗体免疫文库的构建

(1)羊驼免疫：取抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3(溶于常规磷酸盐缓冲液溶液)150μg，与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，对三周岁的雄性羊驼(Alpaca)进行皮下多点注射，此后每隔两周免疫一次，共免疫六次，四免后开始采血检测。在第四次免疫后7～10天，用EDTA真空采血管颈静脉采血10mL，同时轻柔颠倒采血管避免血液凝固，再用LeukoLOCK试剂盒中的滤器处理血液，然后依次用3mL常规磷酸盐缓冲液和3mL RNAlater缓冲液冲洗滤器，则所需的白细胞就截留在滤器里，最后将滤器密封保存于-80℃，以备提RNA用。

(2)提取羊驼血液中白细胞总RNA：加70μL pH调节缓冲液到2.5mL裂解液中；将密封的滤器打开，用注射器将滤器内剩余的少量RNAlater缓冲液冲去；用3mL注射器吸取新鲜配制裂解液2.5mL，洗滤器，收集流出液；加入2.5mL无RNase的ddH₂O，混匀后，加入25μL蛋白酶K，室温下，将离心管以250rpm震荡5min；将RNA结合磁珠混匀，取50μL加入到上述裂解液中，混匀后，加入2.5mL异丙醇，室温轻轻震荡5min；离心，2000g、3min，使磁珠沉淀，吸弃上清；将离心管16000g离心15s，使磁珠聚集，弃掉上清；加入750μL洗液Ⅱ/Ⅲ，涡旋15s使聚集的磁珠再次分散开，于16000g离心15～30s，收集磁珠；室温下，将离心管敞口2min，配制TURBO DNase混合液，取4μL TURBO DNase加入到296μL LeukoLOCK DNase缓冲液中，混匀、加到离心管中，并涡旋混匀；加入300μL裂解液(不用加pH调节缓冲液)、300μL异丙醇，混匀后离心16000g、15～30s(12)吸弃上清，加入750μL洗液Ⅱ/Ⅲ，涡旋15～30s，于16000g离心15～30s收集磁珠，重复用洗液Ⅱ/Ⅲ冲洗磁珠一次；加入150μL洗脱液，再16000g离心2min，上清即为提取的RNA，将其转移至无RNase离心管，-70℃保存备用。

(3)cDNA的合成：取两个1.5mL离心管，分别加入3μL dNTP mix(10mM)、3μL的oligo(dT)₂₀(50μM)以及24μL的RNA；65℃水浴5min，打开模板二级结构，立即置于冰上；然后在离心管中配置反应混合液；

反应混合液进行加热，先50℃、50min，再85℃、5min；分别加入3μL RNase，混匀；37℃加热20min，完成cDNA第一链合成，分装保存于-20℃。

(4)重链抗体可变区VHH基因的扩增：以cDNA为模板，扩增重链抗体IgG2和IgG3的VHH基因，反应体系(50μL)如下：

PCR程序如下：94℃3min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，35cycles；72℃10min。

其中扩增IgG2、IgG3对应的上游引物分别为引物R2、R1，引物序列如表1所示。

表1纳米抗体测序相关引物序列

引物	序列
		F	5'-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3'
R1	5'-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3'
		R2	5'-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3'
gback	5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3'

(1)噬菌体展示纳米抗体文库的构建：采用SfiI分别对载体pComb3X和VHH进行酶,运用T4连接酶连接酶切后的VHH片段与载体，取3μL连接产物到25μL ER2738感受态细胞中，轻轻混匀，转到1mm的电转杯中，注意避免产生气泡，电转条件为1.8KV、200Ω、25μF；电转后，向电转杯中加入1mL预热复苏培养基，再转移至摇菌管中复苏培养；取10μL转化菌液，稀释涂板，37℃培养过夜用于估算库容量。将全部转化菌转至200mL SB培养基中，加入羧苄青霉素至50μg/mL、四环素至20μg/mL；250rpm，37℃培养至OD₆₀₀为0.6；加入1mL辅助噬菌体(1×10¹³pfu/mL)，37℃静置侵染30min；250rpm，37℃培养2h，加入卡那霉素至浓度为70μg/mL，继续培养过夜；次日，将菌液离心，4℃、10000rpm离心15min；取上清到无菌离心管中，加1/4体积PEG/NaCl溶液，冰浴2h，再离心，弃上清，用10mL重悬液(含1×蛋白酶抑制剂、0.02％NaN₃、1％BSA的常规磷酸盐缓冲液)重悬沉淀；用0.22μm滤器过滤噬菌体溶液，除去残留的细菌等；所得噬菌体溶液即为噬菌体展示纳米抗体文库，将其分装、做好记号，保存于-80℃。

(2)噬菌体展示纳米抗体免疫文库的鉴定：从平板上挑20个单克隆各至1mL SB培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀约为0.8，取出菌液，以gback为引物，送公司测序，分析克隆序列，判定所建库的多样性程度。测序结果如图1所示，由图可见，所选20个克隆的插入片段的氨基酸序列均不同，表明所构建的噬菌体展示纳米抗体库多样性良好，可用于后续的筛选工作。

实施例2玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的淘选及鉴定

(一)玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的淘选

以2D3单抗为靶标物，通过逐轮降低包被原浓度、竞争洗脱的玉米赤霉烯酮标准品浓度，交替使用封闭试剂，进行亲和富集淘选，获得针对2D3抗体的抗体，即抗抗体，又称作抗独特型抗体，淘选步骤如下：

(1)包被：包被2D3单抗，20μg/mL，100μL/孔，包6孔，用包被buffer稀释均可；去吸附孔，包被3％BSA-常规磷酸盐缓冲液，100μL/孔，包6孔；4度过夜包被的效果优于37℃孵育2h；

(2)封闭：3％常规磷酸盐缓冲液M，300uL/孔，37℃孵育2h后，手洗板3次；

(3)加库至包被抗原孔：100uL/孔，37℃反应1h，再室温摇床反应1h，然后用带滤芯枪头手洗这6个孔，洗板10次；

(4)洗脱：配制200ng/mL玉米赤霉烯酮标准品，室温摇床反应1h；

(5)去吸附：将洗脱液转移到去吸附孔，100μL/孔，室温反应30min；

(6)汇集600μL洗脱物，称为“1st output”，第一轮淘选完成；1st output需经过扩增才能用于第二轮的淘选；

(7)测定“1st output”滴度，取10μL“1st output”，梯度稀释至10³、10⁴、10⁵，这3个稀释液各取10μL侵染90μL ER2738(OD为0.8)，37度静置30min，涂布Carb(羧苄)平板，37度过夜培养，次日数平板上的单克隆数，估算滴度。

在随后的淘选中，包被抗体浓度逐步减少，洗脱液中玉米赤霉烯酮浓度逐渐降低，共进行四轮淘选，淘选过程见表2，淘选富集结果见表3。

表2噬菌体纳米抗体库的淘选

表3每轮淘选噬菌体富集结果

(二)阳性噬菌体克隆的鉴定

(1)从最后一轮淘选的output滴度平板上随机挑取32个单克隆,于羧苄平板上保菌,同时接入3mL SB培养基；

(2)37℃摇床培养4-5h，至OD值为0.8，加入30μL helper phage，37℃静置20-30min；

(3)37℃摇床培养1h，加终浓度为70μg/mL Kana，37℃培养；

(4)次日，各取500μL菌液离心，8000rpm、3min，上清稀释10倍用于Phage-ELISA；

(5)ELISA板封闭，3％常规磷酸盐缓冲液M，300μL/孔，37℃孵育1.5h，机洗板3次；

(6)每个克隆的噬菌体上清(稀释10倍)加到对应的3个孔中，每孔50μL，1,4,7,10列加50μL标准品，2,3,5,6,8,9,11,12列加50μL 10％甲醇-常规磷酸盐缓冲液，加好后酶标仪震荡混匀；

(7)37℃静置1h，手洗板10次；

(8)二抗，anti-M13/辣根过氧化物酶，1:5000稀释，37℃孵育1h；

(9)显色，37℃温育15min，检测450nm处的吸光值。

对32个克隆做phage-ELISA，发现它们与2D3抗体结合反应差别较大。将加入玉米赤霉烯酮后OD₄₅₀减小的定为阳性噬菌体，phage-ELISA结果如图2所示，通过四轮淘选共获得8个阳性克隆(依次为2、3、6、7、8、10、11、16号克隆)。根据上述ELISA结果，将阳性克隆从保菌平板上挑出，活化培养后送至上海生工进行序列分析，测序引物为gback，对8个阳性克隆进行测序，经序列分析，发现这8个克隆的氨基酸序列中CDR1、CDR2、CDR3相同，则这8个克隆实为同一种噬菌体展示纳米抗体，其序列如图3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。结合phage-ELISA的OD值和抑制率，选取VHH8#克隆开展后续的实验研究。

实施例3玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的表达与纯化

(一)Top10F’感受态细胞的制备：

(1)用挑取适量Top10F’划线于LB-四环素平板，37℃培养过夜；

(2)挑取Top10F’单克隆到5mL LB培养基中，37℃、250rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8；

(3)将菌液转至预冷离心管中(约1.3mL/管)，4℃离心，8000rpm、8min；

(4)离心完后迅速置于冰上，弃上清，加入1mL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬菌体，吸打混匀后冰浴30min；

(5)4℃下，8000rpm离心8min后迅速置回冰上，彻底吸尽液体，沉淀用100μL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，即为Top10F’感受态细胞。

(二)阳性噬菌体克隆质粒的提取与转化：

(1)从VHH8#/ER2738的甘油菌中，挑适量划线于LB-羧苄平板，37℃培养过夜；

(2)挑VHH8#/ER2738单菌落到2mL SB培养基中，37℃培养到OD₆₀₀为0.8，提取VHH8#的质粒；

(3)冰上，加1.5μL VHH8#质粒到上述制备的100μL Top10F’感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；

(4)42℃热击90s，迅速放回冰上，放置5min；

(5)超净工作台内，向每个离心管中加入700μL LB培养基，37℃、200rpm复苏培养45min；

(6)4℃下，12000rpm离心4min，吸弃部分上清，留取约150μL液体，混匀后涂布LB-羧苄平板，37℃过夜培养。

(三)纳米抗体的诱导表达与纯化

在VHH8#/Top10F’的平板上，挑单菌落到3mL SB培养基，37℃摇床培养过夜后，转接1mL菌到200mL SB培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.6，加入200μL 1M IPTG，37℃诱导过夜。4℃，8000rpm、15min离心收菌，根据菌体沉淀质量，按4mL/g加入裂解液B-PER，充分分散沉淀后室温缓慢摇动10min，再12000rpm离心20min，上清即为纳米抗体的粗取液。用0.01M常规磷酸盐缓冲液溶液透析粗提液，再过0.22μm水相滤膜，以备镍柱纯化。

使用Ni-NTA His·Bind Resin试剂盒纯化纳米抗体粗提液，步骤如下：

(1)依次用10倍层析柱体积的无菌ddH₂O、0.01M常规磷酸盐缓冲液溶液平衡柱子；

(2)将过滤除菌后的粗提液加到层析柱中，与填料混合后，室温下摇动2h，使纳米抗体与填料充分结合；

(3)将混合液装入柱中，用10倍柱体积的常规磷酸盐缓冲液平衡；

(4)由1M咪唑分别配制20mM、40mM、300mM的咪唑-常规磷酸盐缓冲液溶液各10mL，过0.22μm水相滤膜，用作洗脱液进行梯度洗脱，用2mL离心管收集流出液；

(5)用10mL的20mM的咪唑-常规磷酸盐缓冲液溶液过柱子，不收集流出液；

(6)用10mL的40mM的咪唑-常规磷酸盐缓冲液溶液过柱子，收集前3mL流出液；

(7)用10mL的300mM的咪唑-常规磷酸盐缓冲液溶液过柱子，收集全部流出液；

(8)用10倍柱体积的1M的咪唑-常规磷酸盐缓冲液溶液洗柱子，不收集流出液，使非特异性结合的杂蛋白全部被洗脱下来；

(9)用10倍柱体积的常规磷酸盐缓冲液平衡柱子，用10倍柱体积的ddH₂O洗柱子，最后用10mL 20％乙醇水封柱保存。

对各管流出液作SDS-PAGE电泳分析，将有明显纳米抗体条带的流出液混合，于常规磷酸盐缓冲液中4℃透析过夜，然后用PEG8000对抗体溶液进行浓缩，即得VHH-8#纳米抗体溶液，并分装于-20℃保存。

实施例4抗独特型纳米抗体VHH-8#的特异性分析和热稳定性检测

(1)抗独特型纳米抗体VHH-8#的特异性分析：用包被缓冲液分别配制浓度为0.2μg/mL的玉米赤霉烯酮抗原即ZEN-BSA、赭曲霉毒素A抗原即OTA-BSA、呕吐毒素抗原即DON-BSA和T-2毒素抗原即T-2-BSA，4℃过夜包被酶标板；次日，用5％的脱脂奶粉/常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液封闭，200μL/孔，37℃孵育1.5h，将抗玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素和T-2毒素的四种单克隆抗体从1μg/mL开始，用常规磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，37℃孵育1h；加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠单克隆抗体，37℃温育1h；加入显色液，37℃显色15min，加入终止液，测定OD₄₅₀。

按上述方法包被、封闭后，将VHH-8#用常规磷酸盐缓冲液依次两倍稀释，按以上优化的浓度配制抗玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素和T-2毒素的四种单克隆抗体，分别加入50μL VHH-8#稀释液和50μL对应的单克隆抗体到各孔中，酶标仪振荡混匀，37℃孵育1h；再按1:5000稀释加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，37℃反应1h；同以上方法显色，测定OD₄₅₀值。

测试结果如图4所示，图4表明VHH-8#可以抑制2D3与ZEN-BSA的结合，随着VHH-8#浓度的不断增大，抑制作用越来越明显，而对抗赭曲霉毒素A、呕吐毒素、T-2毒素单克隆抗体与相应抗原的结合没有抑制作用，表明VHH-8#具有良好的选择性，只与2D3可变区进行特异性结合。

(2)抗独特型纳米抗体VHH-8#的热稳定性检测

先将VHH-8#分别在37℃、50℃、60℃、70℃和80℃℃下温育20min，降至室温后，用甲醇/常规磷酸盐缓冲液溶液倍比稀释，按照4.3.1的方法分别建立相应的竞争抑制曲线，检测其作为替代标准品的能力，并与4℃保存的VHH-8#标准曲线进行做对比。结果如图5所示，随着温度的升高，标准曲线的IC₅₀值略有升高，即VHH-8#与2D3抗体的结合能力出现一定程度的下降，但曲线的总体趋势没有发生较大变化，表明VHH-8#最高可耐受80℃温育20min而不影响其与抗体结合的活性。

实施例5纳米抗体VHH-8#替代玉米赤霉烯酮抗原ELISA(VELISA)的建立

(一)VELISA条件优化

(1)最佳VHH包被浓度与2D3抗体工作浓度：对VHH-8#依次稀释1600×、3200×、4800×、6400×倍，对应的浓度分别为40.63、20.31、13.54、10.16ng/mL，包被酶标板，采用棋盘法对8#及2D3浓度进行优化，取OD≈1.0时2D3抗体浓度为其工作浓度，稀释1600×、3200×、4800×、6400×倍时，2D3抗体稀释倍数分别为89.6w、12.8w、6.4w和500倍，按此浓度进行间接ELISA分析，建立标准曲线(图6)，当VHH-8#稀释3200×和4800×时，IC₅₀均在0.15ng/mL左右，但4800×时的ODmax大于3200×时的ODmax，因此确定VHH-8#最佳包被浓度为13.54ng/mL，2D3抗体最佳稀释倍数分别为6.4w，即0.0156μg/mL。

(2)最佳封闭试剂：在最优VHH8#包被浓度和2D3抗体工作浓度下，探讨不同封闭试剂对VELISA反应的影响。分别用3％BSA、1.5％OVA、5％脱脂奶粉与1.5％明胶封闭，建立标准曲线(图7)，确定5％脱脂奶粉为最佳封闭液。

(3)最适pH：分别用pH为5、6、7、7.4、8、9的磷酸盐缓冲液稀释2D3抗体，用含10％甲醇的各缓冲液倍比稀释玉米赤霉烯酮标准品，建立的VELISA标准曲线如图8，当pH＝7.4时，竞争拟合曲线的IC₅₀最小，升高或降低pH对反应灵敏度均有影响。

(4)最佳盐离子浓度：分别配制0.04M、0.08M、0.137M(常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液)、0.16M、0.32M、0.64M的磷酸盐缓冲液稀释2D3抗体及玉米赤霉烯酮标准品，建立VELISA检测玉米赤霉烯酮的标准曲线，如图9所示，其中当盐离子浓度为0.137M(常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液)和0.64M时，拟合曲线的IC₅₀比较接近，均较小，但0.137M(常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液)对应的最大吸光度值更大，因此确定最佳盐离子浓度为0.137M，即实验室常规用的pH＝7.4的常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液。

(5)最适甲醇浓度：在以上优化出来的最佳VHH8#包被浓度、2D3抗体工作浓度、封闭试剂及最优磷酸盐缓冲液条件下，继续探讨不同甲醇浓度对VELISA反应的影响。用甲醇浓度分别为5％、10％、20％、40％的常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液稀释玉米赤霉烯酮和抗体，建立抑制曲线(图10)，其中甲醇浓度为5％和10％时，由曲线得出的IC₅₀很接近，但甲醇浓度5％时的IC₅₀更大，且竞争拟合曲线的趋势相对更好。

(6)VELISA的交叉反应率：以VHH-8#为替代抗原，根据优化条件，选取OTA、DON、T-2三种真菌毒素作竞争物，测定VELISA的交叉反应率CR。由图11可看出，该ELISA对玉米赤霉烯酮灵敏度较高，IC₅₀值达到0.118ng/mL，而与OTA、DON、T-2均不存在交叉反应，则VELISA特异性好，可针对性地检测农产品中的玉米赤霉烯酮。

(7)VELISA基质效应的研究：对玉米、饲料、面粉、小麦四种空白样品进行前处理，用7倍、20倍及50倍的稀释液稀释玉米赤霉烯酮标准品，建立相应的竞争抑制曲线，结果显示四种样品均对VELISA存在一定的基质效应，导致假阳性结果。同时发现，用2％BSA/常规磷酸盐缓冲液溶液稀释提取液20倍时，能减小基质效应，使基质曲线与无基质时接近。

(8)VELISA添加回收率的测定：为了验证检测方法准确性，采用新建立的VELISA法进行了玉米、饲料、面粉、小麦样品的添加回收试验。分别对空白的玉米、饲料、面粉、小麦样品添加8、25、60μg/kg的玉米赤霉烯酮，添加回收的结果如表3.1，方法的回收率在71.7％～102.2％之间。

表4 VELISA样品添加回收试验结果

(9)VELISA检测实际样品：采用本发明建立的VELISA检测方法测定天然污染的样品玉米、饲料和小麦共15份，并与HPLC法的检测结果进行比对(表5)，两种方法具有良好的相关性(R²＝0.87)。

表5 VELISA与HPLC检测样品中玉米赤霉烯酮含量的结果比对

实施例6抗独特型纳米抗体VHH-8#与玉米赤霉烯酮标准品的对应关系

将纳米抗体VHH-8#用常规磷酸盐缓冲液溶液倍比稀释，从0.203μg/mL开始，依次2倍稀释，用作玉米赤霉烯酮替代标准物品，建立替代标准曲线，同步建立玉米赤霉烯酮抑制曲线，分别取B/B₀在20％～80％时的VHH-8#浓度值、玉米赤霉烯酮浓度值，通过线性回归分析，确立VHH-8#与玉米赤霉烯酮两者间的对应关系，线性回归方程即为两种竞争物的定量转换方程。

VHH-8#作竞争原标准曲线如图12所示，玉米赤霉烯酮作竞争原标准曲线如图13所示。图12和图13显示，两条曲线均近似于“S”形，随着VHH-8#或玉米赤霉烯酮浓度的不断增大，其对2D3抗体与包被抗原结合的抑制作用逐渐增强，在竞争物浓度较高或较低时，曲线相对平缓，在结合率为20％～80％时，曲线呈线性，是检测的线性区间，抑制作用比较明显。

由上述两种标准曲线，计算出结合率B/B₀在20％～80％范围内对应的VHH-8#浓度和玉米赤霉烯酮浓度，间隔为10％，以每一种结合率对应的VHH-8#浓度为横坐标，以相应结合率所对应的玉米赤霉烯酮浓度为纵坐标，建立VHH-8#与玉米赤霉烯酮的相关关系曲线(见图14)，由线性回归分析得出线性回归方程：y＝82.6405x-0.1029，相关系数R²＝0.98429，其中x为VHH-8#浓度，y为玉米赤霉烯酮浓度。

VHH-8#作为玉米赤霉烯酮替代品用于检测实际样品可分为两步：(1)由ELISA测得的OD值计算各孔的B/B0值，代入替代方程中，计算出对应的VHH-8#的浓度；(2)将VHH-8#的浓度代入VHH-8#与玉米赤霉烯酮浓度的定量转换方程，求出相应的玉米赤霉烯酮浓度。

实施例7纳米抗体VHH-8#替代标准物ELISA在实际样品检测中的应用

1)基于VHH-8#替代标准物的添加回收的测定

样品基质会对ELISA反应中的抗体与抗原的反应产生影响，不同基质的干扰程度可能不同。本实施例建立玉米、饲料基质的标准曲线，相应的转换方程见表4。

表4玉米、饲料基质的替代标准物ELSIA转换方程

样品	转换方程	相关系数R2值
			玉米	y＝81.312x-0.102	0.9841
饲料	y＝85.312x-0.214	0.9839

分别对5份玉米样品和5份饲料样品添加8μg/kg、25μg/kg和60μg/kg玉米赤霉烯酮，回收率在80.8％～101.3％之间，结果见5。

表5基于替代标准物ELISA检测玉米赤霉烯酮的添加回收率

2)基于VHH-8#替代标准物ELISA法与HPLC法的比对

对污染了玉米赤霉烯酮的玉米样品和饲料样品，各取5份进行前处理后，利用VHH-8#替代标准物ELISA法测定提取液中的玉米赤霉烯酮，并对检测结果进行定量分析。同时运用HPLC法检测，比较分析结果。以HPLC法检测的结果为x轴、替代标准物ELISA法检测的结果为y轴建立二者间的相关性曲线(图15)，两种检测方法线性关系良好，线性回归方程为：y＝1.0213x-0.4311，R²＝0.997，则基于VHH-8#替代标准物ELISA法检测样品中玉米赤霉烯酮结果准确、可靠，检测样品中玉米赤霉烯酮的线性范围为10～75μg/kg，满足大多数国家对玉米赤霉烯酮的限量标准(60μg/kg)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法

<160> 1

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> Lama pacos

＜400＞ 1

Ala Gln Ala Ala Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 15

Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 30

Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Thr Ile Gly Trp Trp Arg Arg Ala Pro 45

Gly Lys Glu Leu Glu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Ser Arg Asp Gly 60

Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser 75

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 90

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Leu Ser 105

Cys Thr Val Val Ala Gly Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 120

Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp 135

Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro 150

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 158

Claims (10)

1.一种玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3免疫羊驼，通过提取羊驼血清中的淋巴细胞RNA，克隆重链抗体可变区VHH基因，以pComb3X为载体构建噬菌体展示纳米抗体免疫文库，并对文库进行鉴定，测定其滴度、库容量，分析文库的多样性，再以玉米赤霉烯酮单克隆抗体2D3抗体为靶标物，对纳米抗体免疫文库进行淘选，获得阳性噬菌体展示的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体。

3.权利要求1所述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体作为替代抗原在免疫分析中的应用。

4.一种基于权利要求1所述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体替代玉米赤霉烯酮的ELISA检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）玉米赤霉烯酮抑制标准曲线的建立：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后替代抗原包被于酶标板，以玉米赤霉烯酮标准品作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，以玉米赤霉烯酮标准品浓度对数值为横坐标，以结合率B/B₀值作为纵坐标，建立ELISA检测标准曲线；

（2）玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线的建立：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后替代抗原包被于酶标板，以玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，以玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度对数值为横坐标，以结合率B/B₀值作为纵坐标，建立ELISA检测标准曲线；

（3）由玉米赤霉烯酮抑制标准曲线和玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线计算出结合率B/B₀在20%~80%范围内对应的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度和玉米赤霉烯酮标准品浓度，以每一个结合率B/B₀值对应的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体浓度为横坐标，以相同结合率B/B₀值所对应的玉米赤霉烯酮标准品浓度为纵坐标，建立玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体与玉米赤霉烯酮标准品的线性关系曲线；

（4）ELISA法测定样品中玉米赤霉烯酮含量：将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后包被于酶标板，加入样品作为竞争物，进行竞争抑制ELISA反应，检测获得结合率B/B₀值，将结合率B/B₀值代入步骤（2）所建立的玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体抑制标准曲线，计算得到抗独特型纳米抗体的浓度，然后将计算所得抗独特型纳米抗体的浓度代入步骤（3）所建立的线性关系曲线，换算得到玉米赤霉烯酮含量。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述竞争抑制ELISA反应的操作过程为：（1）将玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体稀释后包被于酶标板，4℃包被过夜；次日，用封闭液进行封闭，37℃下孵育1.5h；（2）向酶标孔中加入甲醇/常规磷酸盐缓冲液缓冲液，将2D3抗体和竞争物用磷酸盐缓冲液稀释后加入到酶标孔中，37℃孵育1h；（3）加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃温育1h；（4）加入显色液，37℃反应15min后，测定OD₄₅₀。

6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体的包被浓度13.54ng/mL~20.31ng/mL。

7.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述2D3抗体的浓度为0.01~0.2 µg/mL。

8.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述封闭液为3%BSA、1.5%OVA、5%脱脂奶粉或1.5%明胶。

9.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述甲醇/磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

10.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述甲醇/磷酸盐缓冲液中甲醇浓度为5%~10%。