CN113150160B - 一种黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体及其制备方法。所述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库，且库容量高，多样性好；以黄曲霉毒素M1单克隆抗体为靶标物，采用四轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体；将阳性噬菌体黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体基因转化到表达菌株，经诱导表达、纯化、鉴定，获得性能优良的蛋白形式纳米抗体VHH C4。

Description

一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体及其制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉或者寄生曲霉产生的代谢物，它们污染了多种农产品，在农作物的生长、收获、贮存和加工过程中均被发现。这些代谢物是剧毒，致突变，致畸和致癌的化合物，已被认为是人肝和肝外致癌作用的致病因子。黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最高，被国际癌症研究机构归为1类人类致癌物。AFM1是AFB1的羟基化代谢产物。摄取被AFB1污染的饲料的泌乳动物会将AFM1排泄到牛奶中，因此可以在各种各样的牛奶产品中找到它。AFM1也具有毒性和致癌作用，已被分类为1类致癌物。由于AFM1污染对人体健康(特别是对婴儿和儿童)的危害，已成为全球关注的问题。欧盟对牛奶中AFM1的限制为0.05ng/mL。但是，中国、美国和巴西的限定标准均为0.5ng/mL。
先前已经建立了许多用于AFM1检测的方法。高效液相色谱(HPLC)和荧光检测(FD)成功取代了薄层色谱法(TLC)，仍然是应用最广泛的方法之一。目前，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)和电喷雾电离四极杆飞行时间质谱已经开发了。所有这些步骤都依赖昂贵的成本，设备完善的实验室和几个小时，从而削弱了它们在AFM1检测中的应用。另一方面，酶联免疫吸附测定(ELISA)由于其成本低廉且易于应用而变得越来越流行。免疫学方法适用于快速检测黄曲霉毒素。酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种高通量测定，样品量少，主要用于AFM1的常规分析。但是，每块ELISA板都必须使用AFM1校准曲线，以减少板间的差异并提高准确性。此外，用作校准剂的纯毒素对操作者和环境都有害。因此，寻求无毒替代品校准品是解决此问题的一种方法，这也为开发一种检测AFM1的绿色方法提供前提。
发明内容
本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种编码上述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
含上述如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的重组表达载体、噬菌体或重组工程菌。
上述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的制备方法：通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；其中：所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
本发明中的黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体通过如下方法筛选获得：以黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫羊驼，通过提取羊驼血清中的淋巴细胞RNA，克隆重链抗体可变区VHH基因，以pComb3X为载体构建噬菌体展示纳米抗体免疫文库，并对文库进行鉴定，测定其滴度和库容量，分析文库的多样性；再以黄曲霉毒素M1单克隆抗体为靶标物，对纳米抗体免疫文库进行淘选，获得阳性噬菌体展示的黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的有益效果如下：
1)本发明提供的黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体特异性良好，可替代抗原和标品开发无毒绿色免疫检测方法，应用于黄曲霉毒素M1检测。
2)本发明采用黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫羊驼，通过提取其白细胞总RNA构建噬菌体展示纳米抗体文库，库容量高，多样性好；然后以黄曲霉毒素M1单克隆抗体为靶标物，采用多轮亲和富集淘选，逐轮降低包被浓度和竞争洗脱浓度，淘选获得特异性良好的阳性噬菌体黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体；
3)本发明将阳性噬菌体黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体基因转化到表达载体，经诱导表达、纯化、鉴定，获得性能优良的蛋白形式纳米抗体，能有效降低抗体生产成本。
附图说明
图1为用于判断噬菌体展示纳米抗体免疫文库多样性的测试结果。
图2为phage-ELISA鉴定阳性克隆。
图3为VHH C4与抗黄曲霉毒素B1(简称AFB1)、赭曲霉毒素A(简称OTA)、T-2毒素(简称T-2)单克隆抗体的结合情况。
图4为棋盘法优化VHH C4包被浓度和黄曲霉毒素M1单克隆抗体工作浓度。
图5为封闭试剂对VELISA的影响。
图6为磷酸盐缓冲液pH值对VELISA的影响。
图7为盐离子浓度对VELISA的影响。
图8为甲醇浓度对VELISA的影响。
图9为基于VHH C4的VELISA对黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素M2的交叉反应情况。
图10为VHH C4在不同样品基质中对AFM1的竞争曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，所述黄曲霉毒素M1单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO.C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生，杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利《杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用》，申请号：201110108230.6中公开。
实施例1噬菌体展示纳米抗体免疫文库的构建
1.羊驼免疫
取抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体(溶于PBS7.4)200μg，与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，对三周岁的雄性羊驼(Alpaca)进行皮下多点注射，此后每隔两周免疫一次，共免疫8次，四免后开始采血检测。在第四次免疫后7～10天，用EDTA真空采血管颈静脉采血10mL，同时轻柔颠倒采血管避免血液凝固，再用LeukoLOCK试剂盒中的滤器处理血液，然后依次用3mLPBS缓冲液和3mL RNAlater缓冲液冲洗滤器，则所需的白细胞就截留在滤器里，最后将滤器密封保存于-80℃，以备提RNA用。
2.总RNA提取
按照Life Technology公司LeukoLOCK total RNA提取试剂盒的操作手册分离羊驼血液中总RNA，具体操作如下：
(1)向2.5mL裂解/结合液中加入70μLpH调节缓冲液，现配现用；(2)将密封的滤器放置恢复至室温，打开滤帽，用2mL注射器将滤器内残留的RNAlater缓冲液冲去；(3)用2.5mL注射器吸取2.5mL现配裂解/结合缓冲液冲洗滤器一次，流出液用15mLRNAse-free离心管收集；(4)加入不含核酸酶的ddH2O 2.5mL，涡旋混匀，加入25μL蛋白酶K，将离心管于室温250g震荡5min；(5)取出保存于4℃的RNA结合磁珠，涡旋混匀后吸取50μL至上述离心管中，涡旋离心管，再向离心管中加入异丙醇2.5mL，室温震荡5min；(6)将上述离心管于3200g离心3min，仔细吸出上清弃去，注意不要吸到沉淀的磁珠；(7)加入600μL洗液I，反复吹打沉淀的磁珠使其分散均匀，转移悬液至1.5mL离心管，再用600μL洗液I漂洗15mL离心管一次，并转移至同一1.5mL离心管中；(8)将1.5mL离心管于16000g离心30s，小心弃去上清；(9)加入750μL洗液2/3，剧烈涡旋震荡30s使聚集沉淀的磁珠分散开，于16000g离心30s收集磁珠，小心弃去上清；(10)将离心管敞开盖子在超净台中静置2min，挥发洗液2/3中残留的酒精，期间，现配TURBODNase master混液，取4μLTURBO DNase(20U/μL)加入到296μL LeukoLOCKDNase缓冲液中，混合均匀后转移至上述离心管中，用移液枪反复吹打沉淀的磁珠，使之分散均匀，室温下1000g震摇10min，中途轻轻颠倒混合几次；(11)向上述离心管中依次加入裂解/结合液(未加pH调节缓冲液)和异丙醇各300μL，混匀后点动离心2s，然后室温下孵育3min；(12)于16000g离心30s，弃上清，加750μL洗液2/3，剧烈涡旋30s，16000g离心30s，弃上清，再次加入750μL洗液2/3，剧烈涡旋30s，16000g离心1min，尽可能弃干上清，室温敞口静置3min，使残留的洗液挥发掉，注意不能放置过久以免磁珠过度干燥；(13)加入洗脱液60μL，涡旋震荡30s，16000g离心2min后，洗脱下来的RNA溶液转移至另一不含核酸酶的1.5mL离心管中，留取1μLRNA溶液用nanodrop测浓度，再取3μL左右RNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的RNA溶液立即全部反转成cDNA，防止发生降解。
3.cDNA的合成
按照反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，步骤如下：
(1)取两支200μL不含核酸酶的PCR管，各加入3μL 10mM dNTPmix、3μL 50μMoligo(dT)20、24μLRNA，轻柔混匀；
(2)65℃加热5min，使模板变性，二级结构打开；
(3)立即置于冰上冷却至少1min；
(4)现配合成cDNA的预混液：
(5)向两支PCR管中各加30μL预混液，用微量移液器混匀；
(6)将反应混合液进行加热：50℃退火反应50min，然后85℃加热5min使反应终止；
(7)向反应混合液中各加入3μLRNAseH并混匀，在37℃加热处理20min，分解未完全反应的RNA；
(8)第一链cDNA的合成完成，分装后于-20℃保存备用。
4.重链抗体可变区VHH基因的扩增
取IgG2和IgG3可变区VHH基因各自的简并引物对，以cDNA为模板分别进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，引物对F、R2用于克隆IgG2亚型，引物对F、R1用于IgG3亚型的克隆，反应体系如下：
PCR程序为：
其中扩增IgG2、IgG3对应的上游引物分别为引物R2、R1，引物序列如表1所示。
表1 VHH抗体基因扩增与测序引物序列表
5.噬菌体展示纳米抗体文库的构建
采用SfiI分别对载体pComb3X和VHH进行酶,运用T4连接酶连接酶切后的VHH片段与载体pComb3X，取3μL连接产物到25μL E.coli ER2738感受态细胞中，轻混后全部吸出转移至预冷电转杯(内径为1mm)中，快速放置于电转仪中进行电转化；电击后，立即加入1mL37℃预热的SOC培养基到电转杯中，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，于37℃摇床中250g震荡复苏培养1h；重复电转了10次，每次3μL连接产物，汇集10次转化的菌液并取1μL用无菌水稀释10倍后涂布在LB-Amp平板上，于37℃培养箱培养过夜用于估算库容量。将全部转化菌转至200mLSB培养基中，加入羧苄青霉素至50μg/mL、四环素至20μg/mL；250g，37℃培养至OD600为0.6；加入1mL辅助噬菌体(1×1013pfu/mL)，37℃静置侵染30min；250g，37℃培养2h，加入卡那霉素至浓度为70μg/mL，继续培养过夜；次日，将菌液离心，4℃、10000g离心15min；取上清到无菌离心管中，加1/4体积PEG/NaCl溶液，冰浴2h，再离心，弃上清，用10mL重悬液(含1×蛋白酶抑制剂、0.02％NaN3、0.5％BSA的PBS缓冲液)重悬沉淀；用0.22μm滤器过滤噬菌体溶液，除去残留的细菌等；所得噬菌体溶液即为噬菌体展示纳米抗体文库，将其分装、做好记号，保存于-70℃。
6.噬菌体展示纳米抗体免疫文库的鉴定
从平板上随机挑30个单克隆各至1mLSB培养基中，37℃培养至菌液OD600约为0.8，取出菌液，以gback为引物(见表1)，送公司测序，分析克隆序列，判定所建库的多样性程度。测序结果如图1所示，从所选30个单克隆的插入片段的氨基酸序列可以看出，纳米抗体的保守区FR1、FR2、FR3和FR4具有高度的相似性，而可变区CDR1、CDR2和CDR3区不尽相同。尤其是CDR3区(氨基酸100位至120位之前的区域)的高度多样性使得噬菌体展示文库具有丰富的多样性，表明所构建的噬菌体展示纳米抗体库多样性良好，可用于后续的筛选工作。
实施例2黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的淘选及鉴定
(一)黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的淘选
以黄曲霉毒素M1单克隆抗体为靶标物(所述黄曲霉毒素M1单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO.C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生，杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利《杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用》，申请号：201110108230.6中公开)，通过逐轮降低包被原浓度、竞争洗脱的黄曲霉毒素M1标准品浓度，交替使用封闭试剂，进行亲和富集淘选，获得针对黄曲霉毒素M1单克隆抗体的抗体，即抗抗体，又称作抗独特型抗体，淘选步骤如下：
(1)包被：包被黄曲霉毒素M1单克隆抗体，50μg/mL，100μL/孔，包6孔，用包被buffer稀释均可；去吸附孔，包被3％BSA/PBS，300μL/孔，包6孔；4度过夜包被的效果优于37℃孵育2h；
(2)封闭：3％PBSTM，300μL/孔，37℃孵育2h后，手洗板3次；
(3)加库至包被抗原孔：100μL/孔，37℃反应1h，再室温摇床反应1h，然后用带滤芯枪头手洗这6个孔，洗板10次；
(4)洗脱：配制100ng/mL黄曲霉毒素M1标准品，室温摇床反应30min；
(5)去吸附：将洗脱液转移到去吸附孔，100μL/孔，室温反应1h；
(6)汇集600μL洗脱物，称为“1st output”，第一轮淘选完成；1st output需经过扩增才能用于第二轮的淘选；
(7)测定“1st output”滴度，取10μL“1st output”，梯度稀释至103、104、105，这3个稀释液各取10μL侵染90μL ER2738(OD为0.8)，37℃静置30min，涂布LB-Amp(氨苄)平板，37℃过夜培养，次日数平板上的单克隆数，估算滴度。
在随后的淘选中，包被抗体浓度逐步减少，洗脱液中黄曲霉毒素M1浓度逐渐降低，进行三轮淘选，淘选过程见表2，淘选富集结果见表3。
表2噬菌体纳米抗体库的淘选
表3每轮淘选噬菌体富集结果
(二)阳性噬菌体克隆的鉴定
(1)从最后一轮淘选的output滴度平板上随机挑取30个单克隆,于LB-Amp平板上保菌,同时接入3mL SB培养基；
(2)37℃摇床培养4-5h，至OD值为0.8，加入30μL M13KO7辅助噬菌体，37℃静置30min；
(3)37℃摇床培养1h，加终浓度为70μg/mL Kana，37℃培养；
(4)次日，各取500μL菌液离心，5000g、10min，上清直接用于Phage-ELISA；
(5)ELISA板封闭，3％PBSTM，300μL/孔，37℃孵育1h，机洗板3次；
(6)每个克隆的噬菌体上清加到对应的3个孔中，每孔50μL，1,4,7,10列加50μL标准品，2,3,5,6,8,9,11,12列加50μL 10％甲醇/PBS缓冲液，加好后酶标仪震荡混匀；
(7)37℃静置1h，手洗板10次；
(8)二抗，Anti-M13辣根过氧化物酶，1:5000稀释，37℃孵育1h；
(9)显色，37℃温育15min，检测450nm处的吸光值。
对30个克隆做phage-ELISA，发现它们与黄曲霉毒素M1单克隆抗体结合反应差别较大。Phage-ELISA测定中，与抗体反应OD450值较高，同时加入AFM1后OD450值明显降低现象的噬菌体克隆判定为阳性，结果如图2所示，通过四轮淘选共获得21个阳性克隆(依次为1、2、3、4、6、7、8、11、12、14、16、17、20、21、23、24、25、27、28、29、30号克隆)。根据上述ELISA结果，将阳性克隆从保菌平板上挑出，活化培养后送至上海生工公司进行序列分析，测序引物为gback，对21个阳性克隆进行基因测序。结果显示21个单克隆具有相同的氨基酸序列，表明在筛选过程中成功富集到1株可以与黄曲霉毒素M1单克隆抗体特异性结合的纳米抗体，命名为黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体VHH C4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例3黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的表达与纯化
(一)Top10F’感受态细胞的制备：
(1)用挑取适量Top10F’划线于LB-四环素平板，37℃培养过夜；
(2)挑取Top10F’单克隆到5mL LB培养基中，37℃、250rpm培养至OD600为0.6～0.8；
(3)将菌液置于冰上静置30min；
(4)4℃下，5000g离心5min后迅速置回冰上，弃上清，加入1mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬菌体，吸打混匀后冰浴7min；
(5)重复上述操作一次；
(6)4℃下，5000g离心5min后迅速置回冰上，彻底吸尽液体，沉淀用100μL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬，即为Top10F’感受态细胞。
(二)阳性噬菌体克隆质粒的提取与转化：
(1)从VHH C4/ER2738的甘油菌中，挑适量划线于LB-氨卞平板，37℃培养过夜；
(2)挑VHH C4/ER2738单菌落到2mL SB培养基中，37℃培养到OD600为0.8，提取VHHC4的质粒；
(3)冰上，加1.5μLVHH C4质粒到上述制备的100μL Top10F’感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；
(4)42℃热击90s，迅速放回冰上，放置5min；
(5)超净工作台内，向每个离心管中加入700μL LB培养基，37℃、200rpm复苏培养45min；
(6)4℃下，12000g离心4min，吸弃上清，向离心管中加入100μL LB培养基重悬沉淀，混匀后涂布LB-氨苄平板，37℃过夜培养。
(三)纳米抗体的诱导表达与纯化
在VHH C4/Top10F’的平板上，挑单菌落到3mLSB培养基，37℃，250rpm摇床培养过夜后，转接200μL过夜菌到200mLSB培养基中，继续培养至OD600为0.6，加入200μL 1M IPTG，37℃诱导过夜。4℃，8000g、15min离心收菌，根据菌体沉淀质量，按20mL/g加入裂解液B-PER，充分分散沉淀后室温缓慢摇动10min，再12000g离心20min，上清即为纳米抗体的粗取液。用0.01M PBS7.4透析粗提液，再过0.22μm水相滤膜，以备镍柱纯化。
使用Ni-NTA His·Bind Resin试剂盒纯化纳米抗体粗提液，步骤如下：
(1)依次用10倍层析柱体积的无菌ddH2O、0.01mol/L PBS7.4平衡柱子；
(2)将过滤除菌后的粗提液加到层析柱中，与填料混合后，室温下摇动1h，使纳米抗体与填料充分结合；
(3)将混合液装入柱中，用10倍柱体积的0.01mol/L PBS7.4平衡柱子；
(4)由1M咪唑分别配制20mM、40mM、300mM的咪唑-PBS7.4各10mL，过0.22μm水相滤膜，用作洗脱液进行梯度洗脱，用2mL离心管收集流出液；
(5)用10mL的20mM的咪唑-PBS7.4过柱子，不收集流出液；
(6)用10mL的40mM的咪唑-PBS7.4过柱子，收集前3mL流出液
(7)用10mL的300mM的咪唑-PBS7.4过柱子，收集全部流出液；
(8)用10倍柱体积的1M的咪唑-PBS7.4洗柱子，不收集流出液，使非特异性结合的杂蛋白全部被洗脱下来；
(9)依次用10倍柱体积的PBS、10倍柱体积的ddH2O、10倍柱体积的20％乙醇洗柱，最后用等体积20％乙醇水封柱保存。
对各管流出液作SDS-PAGE电泳分析，将有明显纳米抗体条带的流出液混合，于PBS缓冲液中4℃透析过夜，然后用超滤管浓缩，即得VHH C4纳米抗体溶液，并分装于-20℃保存。
实施例4抗独特型纳米抗体VHH C4的特异性分析
(1)抗独特型纳米抗体VHH C4的特异性分析：用包被缓冲液分别配制浓度为0.2μg/mL的黄曲霉毒素B1抗原即AFB1-BSA、赭曲霉毒素A抗原即OTA-BSA、T-2毒素抗原即T-2-BSA和黄曲霉毒素M1抗原即AFM1-BSA，4℃过夜包被酶标板；次日，用3％脱脂奶粉/常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，将抗黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素OTA和T-2毒素的四种单克隆抗体从10μg/mL开始，用常规磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，37℃孵育1h；加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠单克隆抗体，37℃温育1h；加入显色液，37℃显色15min，加入终止液，测定OD450。
按上述方法包被、封闭后，将VHH C4用常规磷酸盐缓冲液依次三倍稀释，按以上优化的浓度配制抗黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素OTA和T-2毒素的四种单克隆抗体，分别加入50μLVHH C4稀释液和50μL对应的单克隆抗体到各孔中，酶标仪振荡混匀，37℃孵育1h；再按1:5000稀释加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，37℃反应1h；同以上方法显色，测定OD450值。
测试结果如图3所示，图3表明VHH C4可以抑制黄曲霉毒素M1单克隆抗体与抗原AFM1-BSA的结合，随着VHH C4浓度的不断增大，抑制作用越来越明显，而对抗黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素OTA和T-2毒素单克隆抗体与相应抗原的结合没有抑制作用，表明VHH C4具有良好的选择性，只与黄曲霉毒素M1单克隆抗体可变区进行特异性结合。
实施例5纳米抗体VHH C4作为黄曲霉毒素M1替代抗原的ELISA(VELISA)方法建立
纳米抗体VHH C4作为黄曲霉毒素M1替代抗原的竞争抑制ELISA反应的操作过程为：(1)将黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体稀释后替代黄曲霉毒素M1抗原包被于酶标板，4℃包被过夜；次日，用封闭液进行封闭，37℃下孵育1h；(2)向酶标孔中加入甲醇/PBS 7.4缓冲液，将黄曲霉毒素M1单克隆抗体和竞争物用PBS 7.4缓冲液稀释后加入到酶标孔中，37℃孵育1h；(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃温育1h；(4)加入显色液，37℃反应15min后，测定OD450。
(一)VELISA条件优化
(1)最佳VHH包被浓度与黄曲霉毒素M1单克隆抗体工作浓度：对VHH C4依次稀释至浓度分别为20、10、5、0.06、2.5、1.25μg/mL，包被酶标板，采用棋盘法分别对纳米抗体VHHC4包被浓度及黄曲霉毒素M1单克隆抗体工作浓度进行优化，取OD450值在1.0左右的纳米抗体浓度和黄曲霉毒素M1单克隆抗体浓度为最优工作浓度，黄曲霉毒素M1单克隆抗体9倍稀释至浓度分别为100、11.11、1.23、0.14、0.02μg/mL，按此浓度进行间接ELISA分析，建立标准曲线(图4)。根据各个组合显色值不同，最终选定VHH C4工作浓度为5μg/mL，对应黄曲霉毒素M1单克隆抗体浓度为2μg/mL。
(2)最佳封闭试剂：在最优VHH C4包被浓度和黄曲霉毒素M1单克隆抗体工作浓度下，探讨不同封闭试剂对VELISA反应的影响。分别用3％BSA、1.5％OVA与3％脱脂奶粉，建立标准曲线(图5)，确定3％脱脂奶粉为最佳封闭液。
(3)最适pH：分别用pH为5、6、7、8的磷酸盐缓冲液稀释黄曲霉毒素M1单克隆抗体，用含10％甲醇的各缓冲液倍比稀释黄曲霉毒素M1标准品，建立的VELISA标准曲线如图6，当pH＝7时，反应灵敏度最高。
(4)最佳盐离子浓度：分别配用ddH2O，10mmol/LPBS，20mmol/L PBS，40mmol/L PBS四种溶液稀释黄曲霉毒素M1单克隆抗体，用含10％甲醇的各缓冲液倍比稀释黄曲霉毒素M1标准品，建立VELISA检测黄曲霉毒素M1的标准曲线。如图7所示10mmol/L PBS为最佳反应缓冲液。
(5)最适甲醇浓度：在以上优化出来的最佳纳米抗体包被浓度、黄曲霉毒素M1单克隆抗体工作浓度、封闭试剂及最优磷酸盐缓冲液条件下，继续探讨不同甲醇浓度对VELISA反应的影响。用甲醇浓度分别为5％、10％、20％、40％的常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液稀释黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M1单克隆抗体，建立抑制曲线(图8)，其中甲醇浓度为5％和10％时，由曲线得出的IC50很接近，但甲醇浓度10％时的IC50更小，且竞争拟合曲线的趋势相对更好。
(6)VELISA的交叉反应率：以VHH C4为替代抗原，根据优化条件，选取AFB1、AFB2、AFG1、AFG1、AFM1和AFM2六种真菌毒素作竞争物，测定VELISA的交叉反应率。由图9可看出，该ELISA对AFM1灵敏度较高，VHH C4的IC50值达到0.25ng/mL，而与AFB1、AFB2、AFG1、AFG1和AFM2均不存在交叉反应，则VELISA特异性好，可针对性地检测乳制品中的黄曲霉毒素M1。
实施例6 VHH-ELISA样品分析方法的建立
(1)纳米抗体VHH C4在不同样品基质中对AFM1的竞争曲线
对牛奶和酸奶空白样品直接取10mL在4℃下5000g离心10min，用去除乳脂层的下层清液直接稀释黄曲霉毒素M1标准品，建立基质提取液的VELISA竞争抑制曲线；对于奶粉空白样品，在分析天平上准确称取10g溶于50℃预热纯水中，定容至100mL，充分混匀后取10mL在4℃下5000g离心10min，用去除乳脂层的下层清液直接稀释黄曲霉毒素M1标准品，建立基质提取液的VELISA竞争抑制曲线，并与不含基质的反应体系下建立的标准曲线进行比较，结果显示三种样品均对VELISA存在较小的基质效应，使基质曲线与无基质时接近，结果如图10所示。
(2)VHH-ELISA在实际样品检测中的应用
为了评价VELISA检测体系的准确性，采用新建立的VELISA方法进行了牛奶、酸奶和奶粉样品的添加回收试验。分别对空白的牛奶、酸奶和奶粉样品添加400、600、800ng/L的黄曲霉毒素M1标准溶液，用新建立的方法VELISA法检测样品提取液中的AFM1含量，结果见表4。AFM1的添加回收试验显示，样品添加回收率在84.1～119.1％之间，表明本研究建立的基于纳米抗体VELISA方法能够应用于黄曲霉毒素M1的污染监测中。
表4基于纳米抗体VHH-EILSA的样品添加回收试验
注：每个结果为重复三次的平均值
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体及其制备方法
＜160＞ 2
＜210＞ 1
＜211＞ 402bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 羊驼
＜400＞ 1
gcccaggcggcccaggtgcagctcgtggagtctgggggaggcttggtgca50
ggctggggggtctctgagactctcctgcgcagcctctggaagaaccttca100
gtcccaatgacatcggctggtaccgccaggctccaggaaaggagcgcgac150
ttggtcgcaagtattactagtgatgatactaaaaactatgcagactccgt200
gaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatc250
ttgaaatgaacagcctgaaacgtgaggacaCggccgtctattactgttac300
tacagggtcgcgccgggttacccctcgtactggggccaggggacccaggt350
caccgtctcctcagcgcaccacagcgaagacccccatggccaggccggcc400
ag 402
＜210＞ 1
＜211＞ 134
＜212＞ PRT
＜213＞ 羊驼
＜400＞ 2
Ala Gln Ala Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser GLy GLy GLy Leu
1 5 10 15
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
16 20 25 30
Arg Thr Phe Ser Pro Asn Asp Ile Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro
31 35 40 45
Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ala Ser Ile Thr Ser Asp Asp Thr
46 50 55 60
Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
61 65 70 75
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys
76 80 85 90
Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Tyr Arg Val Ala Pro
91 95 100 105
Gly Tyr Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
106 110 115 120
Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln
121 125 130 134

Claims (4)

1. 一种黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 编码权利要求1所述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
3.含编码权利要求1所述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的基因的重组表达载体、噬菌体或重组工程菌。
4.权利要求1所述黄曲霉毒素M1抗独特型纳米抗体的制备方法，通过基因工程重组表达的方式进行大量制备，所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
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