CN109884008A - 一种黄曲霉毒素b1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样品反应瓶；所述荧光试纸条包括纸板、硝酸纤维素膜、样品垫、检测垫、吸水垫，所述硝酸纤维素膜上从左往右设有检测线和质控线，所述检测线包被有黄曲霉毒素B1‑牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗驼多克隆抗体；所述试剂盒还包括装在所述样品反应瓶中的铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。本发明所提供的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体能高特异性识别黄曲霉毒素B1，对黄曲霉毒素B1的结构类似物均不存在交叉反应，特异性和准确性高，可用于定量检测黄曲霉毒素B1的含量。

Description

一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒 及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于黄曲霉毒素检测技术领域，特别是一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及制备方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌产生的剧毒代谢产物，是迄今发现的最强致癌物质之一。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)和M1(AFM1)等，其中AFB1的毒性最强，污染最为广泛，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。产毒真菌菌株广泛存在于自然界中，谷物、水果、中药、茶叶、食用油和牛奶等农产品和食品均易受黄曲霉毒素B1的污染。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，特别是南方高温高湿地区受污染的情况最为严重。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法主要是精密仪器分析法和免疫学分析法。其中精密仪器分析法主要包括高效液相色谱法、色谱-质谱联用，这些方法灵敏度高，准确性好，然而存在仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，传统的样品前处理技术过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测的目的。近年来迅速发展的免疫层析分析方法克服了上述方法的不足，作为一类新型的快速检测分析技术，具有简便快速的操作过程、即刻呈现测试结果、价格低廉等优点，已经被广泛应用于医学诊断、食品检测等各个领域。

目前，黄曲霉毒素免疫层析试纸条组件中的抗体主要采用传统抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)与荧光材料进行标记，而传统抗体使用过程中存在生产周期长、活性退化较快、特异性不高且稳定性较差的技术难题。纳米抗体是在骆驼科动物体内天然存在的单域重链抗体，与传统的抗体相比，纳米抗体的生产采用基因工程手段，具有成本低、制备方便、稳定性好等优点，因此，纳米抗体在免疫层析试纸条的制备中与常规抗体相比更具有优势。

现有技术中，例如专利号为201611268788.X的专利“同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及应用”中，提供了一种试剂盒，包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其仍然采用传统的单克隆抗体为手段，而在纳米抗体领域缺乏相应研究。又例如专利号为201410121842.2的专利“一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15”，其黄曲霉毒素B1纳米抗体的基因库通过提取羊驼血液中的RNA，扩增VHH基因，与pCantab5E(his)载体连接后转化得到。

发明内容

相比于现有技术，本发明提供了一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，及其制备方法和应用方法，具体通过以下技术实现。

一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样品反应瓶；所述荧光试纸条包括纸板、硝酸纤维素膜、样品垫、检测垫、吸水垫，所述样品垫、检测垫、吸水垫从左往右依次粘贴在所述纸板上且两两重叠，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述纸板和检测垫之间；所述硝酸纤维素膜上从左往右设有检测线和质控线，所述检测线包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗驼多克隆抗体；

所述试剂盒还包括装在所述样品反应瓶中的铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体(编号2018AFB-N11)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。

优选地，所述黄曲霉毒素B1纳米抗体的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

与之对应地，三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ IDNO:6所示。

更优选地，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的制备方法为：将抗黄曲霉毒素B1纳米抗体和活化后的铕标记试剂混合，震荡过夜，即得到目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体。

进一步优选地，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的制备方法具体为：将铕标记试剂超声分散于硼酸缓冲液中，加入碳二亚胺溶液，室温震荡活化，离心，去除上清液；加入硼酸缓冲液复溶，超声分散，然后加入抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，混匀，震荡过夜，离心去除上清液；然后加入牛血清白蛋白封闭铕标记试剂表面多余的结合位点，得到铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体。

更进一步优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述样品稀释液为含有2％(m/v)蔗糖、1％(m/v)吐温-20的浓度为0.01mol/L且pH值为7.4的磷酸缓冲液；

所述荧光试纸条中的吸水垫长20～25mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长15～20mm，宽3～5mm，相邻各垫的重叠长度为1～3mm；所述质控线与硝酸纤维素膜右侧边相距5～10mm，所述检测线与质控线相距10～15mm；所述样品反应瓶为1～5mL的卡口瓶。

更进一步优选地，每厘米所述检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.2～0.5μg；每厘米所述质控线所需的兔抗驼多克隆抗体的包被量为0.1～0.4μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的含量为18～50μg。

本发明还提供了上述黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、将吸水纸剪裁成吸水垫；

S2、制备检测垫，将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、兔抗驼多克隆抗体分别配制成浓度为0.4～0.8mg/mL的包被液Ⅰ和0.2～0.5mg/mL的包被液Ⅱ，在硝酸纤维素膜上用线喷方式喷涂包被液Ⅰ，37℃下干燥1～2h，得检测线；然后在检测线右边喷涂包被液Ⅱ，37℃下干燥1～2h，得质控线；

S3、制备样品垫，将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿取出，37℃下干燥10～16h，得样品垫，置于干燥器中室温保存；

S4、组装荧光试纸条，在纸板上从左往右依次粘贴样品垫、检测垫、吸水垫且两两重叠，得荧光试纸条。

优选地，制备所述包被液Ⅰ的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

制备所述包被液Ⅱ所使用的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

制备所述样品垫所使用的封闭液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白0.5g，叠氮化钠0.02g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.3g，吐温-20 1.0g，聚乙烯吡咯烷酮K-301.0g、EDTA0.25g。

本发明还提供了上述黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的应用，包括以下步骤：

P1、将样品反应瓶中加入待测样品溶液，与铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体混匀；

P2、将荧光试纸条插入样品反应瓶中，37℃反应7min，用时间分辨荧光测试仪检测，得到试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值；

P3、基于预先获得的试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值，与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量，换算后得待测样品中黄曲霉毒素B1含量。

优选地，步骤P3中，所述试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值，与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线采用以下方法得到：

P31、配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液；

P32、将适量上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入试纸条，37℃反应7min，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到若干个免疫层析时间试纸条上检测线和质控线的荧光强度，由此获得若干个免疫层析时间的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值；

P33、拟合得到该比值与黄曲霉毒素B1的关系曲线。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明采用一种不同于现有技术的铕标记抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，其氨基酸序列号和编码基因序列均未被公开；能够更高特异性识别黄曲霉毒素B1，对黄曲霉毒素B1的结构类似物均不存在交叉反应，显著提高免疫层析检测方法的特异性和准确性；操作简单、快速，稳定性好；

2、本发明黄曲霉毒素B1纳米抗体是采用基因工程手段生产得到，具有成本低、制备方便等优点，因此由其制备得到的黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂条与常规抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂条相比更有优势。

附图说明

图1为实施1的黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图。图中标号如下：

1、样品垫；2、检测垫；3、检测线；4、质控线；5、吸水垫。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的获得

黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11是通过噬菌体展示纳米抗体基因库构建及生物淘选法获得的，具体制备方法如下：

1、动物免疫

购买2岁龄的雄性羊驼一只，免疫黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物完全抗原(AFB1-BSA，Sigma公司)。将200μg黄曲霉毒素B1完全抗原与弗氏不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射，间隔2周免疫一次，每次免疫后7～10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选取效价最高的一次免疫后，对羊驼进行静脉取血10mL，采用LifeTechnology公司的LeukoLOCK总RNA分离试剂盒提取羊驼血液中的总RNA。

2、黄曲霉毒素B1纳米抗体基因库的构建

(1)一步法RT-PCR扩增羊驼重链抗体VHH基因：以羊驼血液总RNA为模板，采用Invitrogen公司的SuperScript^TMIII One-Step RT-PCR System with Platinum^TM TaqHigh Fidelity DNA Polymerase试剂盒，采用一步法RT-PCR方法，通过特异性引物扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因。

上述方案中，所述特异性引物是根据FR1区设计上游引物F，根据IgG2和IgG3铰链区分别设计下游引物R2、R1，即IgG2的重链可变区引物为“F、R2”，IgG3的重链可变区引物为“F、R1”。引物上均含有SfiI酶切位点(引物序列下划线处)，能与pComb3X载体上相应的酶切位点进行连接，形成重组质粒；所述特异性引物为：

R1：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’

F：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；

或

R2：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3’

F：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；

其中横线部分表示的引物序列为SfiI酶切位点。

上述方案中，所述一步法RT-PCR扩增的反应体系为：

2×Reaction Mix，25μL；

10μM F引物，1μL；

10μM R1引物(或R2引物)，1μL；

SuperScript^TMIII RT/Platinum^TM Taq聚合酶，1μL；

RNA模板(0.2μg/mL)，5μL；

ddH2O补至总体系，50μL。

所述一步法RT-PCR扩增的程序为：

45-60℃，15～30min；94℃，2min，扩增1个循环；

94℃，15s；55℃，30s；68℃，1min，扩增40个循环；

68℃，5min。

其中，以“F、R1”为引物进行4个PCR扩增反应，以“F、R2”为引物进行6个PCR扩增反应。PCR产物经过0.7％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收450bp大小的DNA片段。

(2)酶切处理VHH基因与pComb3X载体：将VHH基因与pComb3X载体分别进行SfiⅠ酶切处理。

VHH基因的SfiⅠ酶切，按照如下体系配制反应液：

VHH PCR产物，30μL；

SfiⅠ(20U/μL)，2μL；

10×M Buffer4，5μL；

10×BSA，5μL；

ddH2O补至总体系，50μL；

pComb3X载体的SfiⅠ酶切，按照如下体系配制反应液：

pComb3X载体，30μL；

SfiⅠ(20U/μL)，1μL；

10×M Buffer4，5μL；

10×BSA，5μL；

ddH2O补至总体系，50μL；

50℃水浴16h后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。

(3)VHH基因与pComb3X载体的连接：

按照如下体系进行连接：

SfiⅠ酶切处理的pComb3X载体，1.4μg；

SfiⅠ酶切处理的VHH基因，0.495μg；

10×buffer，20μL；

T4ligase，10μL；

ddH2O补至总体系，200μL；

16℃水浴过夜后，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收，-20℃保存待用。

(4)连接产物的电转化：

将上述连接产物取3μL加入到25μL E.coli ER2738电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的0.1cm电转化杯(Bio-rad)中，快速放置于Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，电转化后立即在电转化杯中加入1mL、37℃预热的SOC液体培养基，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，37℃缓慢振摇复苏1h。取2μL菌液倍比稀释后涂布于LB氨苄平板上，37℃倒置过夜，第二天数菌落个数计算库容量。

(5)黄曲霉毒素纳米抗体基因库的拯救：共进行十次上述的电转化，将复苏后的菌液全部转入200mL的SB培养基中，于37℃、250rpm振摇至OD600值为0.5时，加入1mL，1×1012pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置1h后，继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃、10000rpm离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/4体积的5×PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4℃、12000rpm离心20min，用10mL无菌的重悬溶液(含1×蛋白酶抑制剂，0.02％NaN3和0.5％BSA的PBS缓冲液)溶解沉淀得到拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库。

3、黄曲霉毒素B1纳米抗体的筛选以及序列测定

(1)黄曲霉毒素B1纳米抗体的淘选

用AFB1-BSA(1μg/孔)及3％BSA-PBS溶液(用作阴性对照)分别包被ELISA板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3％脱脂奶粉封闭1h；PBST洗板3次，在包被有AFB1-BSA的孔中加入上述拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库100μL，37℃孵育1h；PBST洗板10次后，每孔加入100μL、500ng/mL AFB1溶液，室温(20℃～30℃)震荡30min洗脱。将洗脱液转至包被有3％BSA-PBS溶液的孔中，37℃孵育1h(去除非特异性吸附)；孵育后，取上清侵染2mL生长至对数期的ER2738菌液，37℃侵染20min，取1μL、10μL分别涂布LB氨苄平板上，并于37℃培养箱中静置过夜，次日数平板上的菌落数确定洗脱液中噬菌体滴度。另将上述剩余的被侵染后的ER2738菌液转入6mL的SB培养基中，加100mg/mL的氨苄青霉素3μL，37℃振摇1h，补加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，继续振摇1h后，加入1mL辅助噬菌体M13KO7(1×1012pfu/mL)，37℃静置30min，转入100mL的SB培养基，补加氨苄青霉素(100mg/mL)50μL，继续振摇2h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并于37℃振摇过夜。次日，将菌液于10000rpm、4℃离心15min，转移上清，并加入1/4体积5×PEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm、4℃离心20min，用1％的BSA-PBS溶液溶解沉淀，得到第一轮淘选扩增产物，并用于下一轮淘选。在随后几轮的淘选中，包被抗原AFB1-BSA的浓度分别为0.5μg/孔、0.1μg/孔、0.05μg/孔，洗脱液分别为100ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的AFB1溶液。

(2)阳性克隆的鉴定：

经过4轮淘选后，取2μL洗脱液倍比稀释后侵染生长至对数期的ER2738菌液，涂布LB氨苄平板上，37℃倒置过夜。次日，随机挑取30个克隆分别于3mL的SB-氨苄培养基中，37℃震荡培养6～8h，至OD600为0.6左右，加入30μL辅助噬菌体M13KO7(1×1012pfu/mL)，37℃静置30min后继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并震荡培养过夜；次日，将菌液于10000rpm、4℃离心15min后，得到菌液上清。

用包被液配制AFB1-BSA至终浓度0.2μg/mL，包被96孔ELISA板，每孔100μL，同时另取ELISA板，其中的32个孔用3％的BSA包被，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3％脱脂奶粉-PBS封闭1h；取AFB1标准品储存液，用10％甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL(即不含AFB1)的工作液，分别取50μL加入到包被有AFB1-BSA抗原的孔中，再每孔加入50μL上述菌液上清，每种工作液浓度重复3次；在包被有BSA的孔中加入10％甲醇/PBS和50μL上述菌液上清作为对照，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1h；PBST洗板10次后，每孔加入100μL用PBS按1:5000比例稀释的HRP标记的抗M13鼠单抗，37℃孵育1h；PBST洗板6次，每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，37℃孵育15min；加2mol/L的H₂SO₄，每孔50μL中止反应，用酶标仪分别测定OD450值；对BSA不吸附，对AFB1-BSA有吸附，并且加入AFB1标准品后存在竞争反应的即为阳性噬菌体克隆，由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，得到噬菌体展示的黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11。

(3)黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的特性及测序分析结果如下：

采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五种不同标准品储存液，用10％甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50％时的标准品浓度，用IC50表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率(％)＝(AFB1IC50/类似物IC50)×100％，所述类似物为AFB2、AFG1、AFG2或AFM1，得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11对于对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为1.26ng/mL；与黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率均小于0.1％。因此，黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11是一种抗黄曲霉毒素B1的高特异性纳米抗体，能够应用于特异性识别黄曲霉毒素B1的检测试剂的研发。

同时将筛选到的含有黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCA TGA TTA CGCCAA GCT TTG GAG CC-3’。得到黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的氨基酸序列为SEQ IDNO:7所示，编码基因序列为SEQ ID NO:8所示，其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4、黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的制备

(1)获得能分泌黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的ER2738菌液，使用Qiagen的DNA小量提取试剂盒提取质粒，转化到Top10F’感受态细胞中，并涂布到LB-氨苄平板上；

(2)挑取含有黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11质粒的Top10F’菌落于100mL的SB氨苄液体培养基中，250rpm、37℃培养至OD600＝0.5～0.8，加入100μL、1.0M的IPTG溶液诱导过夜。

(3)4℃、10000rpm离心15min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀采用细菌蛋白抽提试剂盒(Clontech Technology)进行周质蛋白提取，得到蛋白粗提液。将蛋白粗提液用平衡缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，20mM咪唑；pH值＝7.4)透析过夜。

(4)采用His60镍柱(Clontech Technology)纯化抗体：首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤(3)中透析后的上清蛋白进样His60镍柱(Clontech Technology)进行抗体纯化，用10倍柱体积淋洗缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，40mM咪唑；pH值＝7.4)洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，300mM咪唑；pH值＝7.4)洗脱抗体2018AFB-N11，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M，pH值＝7.4的磷酸盐缓冲液透析3～4次后浓缩，分装并于-20℃保存备用。

实施例2：黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备

1、一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条机器制备

包括荧光试纸条、铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11、样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管。

所述荧光试纸条包括纸板、硝酸纤维素膜、样品垫、检测垫、吸水垫，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述纸板和检测垫之间；所述样品垫、检测垫、吸水垫从左往右依次粘贴在所述纸板上且两两重叠，重叠长度为2mm；吸水垫长22mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；样品垫长18mm，宽4mm。

所述硝酸纤维素膜上从左往右设有检测线和质控线。所述检测线包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物，其包被量为0.25μg/cm检测线；所述质控线包被有兔抗驼多克隆抗体，其包被量为0.15μg/cm质控线；质控线与硝酸纤维素膜右侧边相距6mm，检测线与质控线相距12mm。

上述荧光试纸条制备方法为：

S1、将吸水纸剪裁成长22mm，宽4mm的尺寸，即得吸水垫；

S2、制备检测垫

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、兔抗驼多克隆抗体分别配制成浓度为0.4mg/mL的包被液Ⅰ和0.2mg/mL的包被液Ⅱ；在硝酸纤维素膜上用线喷方式喷涂包被液Ⅰ，37℃下干燥2h，得检测线；然后在检测线右边喷涂包被液Ⅱ，37℃下干燥2h，得质控线；制备包被液Ⅰ的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

制备包被液Ⅱ的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

S3、制备样品垫

将玻璃纤维膜裁剪成长18mm，宽4mm的尺寸，放入封闭液中浸湿取出，37℃下干燥12h，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；所用的封闭液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白0.5g，叠氮化钠0.02g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.3g，吐温-201.0g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30 1.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)0.25g。

S4、组装荧光试纸条

在纸板上从左往右依次粘贴样品垫、检测垫、吸水垫且两两重叠，重叠长度为2mm，得荧光试纸条。

2、所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11的获得：

取400μL、0.2mol/L、pH值＝8.2的硼酸缓冲溶液，加入100μL铕标记试剂(粒径200nm，固形物含量1％)，涡旋混匀。再置于数控高功率超声仪中，功率10％，超声10min。加入20μL、15mg/mL碳二亚胺溶液，剧烈涡旋振荡15min。14000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀中加入500μL硼酸缓冲溶液复溶，涡旋混匀后再超声10min，14000rpm离心10min后加入500μL硼酸缓冲溶液复溶沉淀并加入30μg黄曲霉毒素B1纳米抗体2018AFB-N11，涡旋混匀，4℃下摇床震荡过夜。次日14000rpm离心10min，沉淀物用500μL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀。超声10min，4℃下摇床震荡2h，即得到目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体。上述铕标记试剂购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。

3、荧光试纸条的检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)的比值(F_T/F_C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线的建立

用10％甲醇/缓释液稀释黄曲霉毒素B1标准品，配得200ng/mL、160ng/mL、120ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6ng/mL、3ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.04ng/mL和0ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品溶液。取上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液50μL，分别加入到300μL样品反应瓶中，再分别加入50μL用缓释液1：150稀释的铕标记抗黄曲霉毒素B1纳米抗体(约0.02μg标记探针)，插入荧光试纸条，37℃反应7min后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长365nm，测定波长615nm)得到各荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)及其比值(F_T/F_C)，所述的样品缓释液为含有2％(m/v)蔗糖、1％(m/v)吐温-20的0.01mol/L、pH值＝7.4磷酸缓冲液。

以各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液相应的检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)的(F_T/F_C)为纵坐标，黄曲霉毒素B1标准品浓度的对数值为横坐标，拟合得到时间分辨荧光免疫层析试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(F_T/F_C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线。该方法的有效检测范围为0.1～50ng/mL。

4、黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂条的特异性测试

取50μL用缓释液1：150稀释的铕标记抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，加入到300μL样品反应瓶中，加入50μL黄曲霉毒素B1的结构类似物：黄曲霉毒素B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、呕吐毒素(DON)、T-2毒素，各种类似物标准品用10％甲醇/缓释液配制成200ng/mL，然后在样品反应瓶中插入荧光试纸条，以黄曲霉毒素B1和空白样品为对照，37℃反应7min后观察结果。将黄曲霉毒素B1类似物的试纸条T线与空白样品试纸条T线颜色进行对比，根据颜色的深浅判断试纸条的特异性，试验重复5次。实验结果表明，加入了黄曲霉毒素B1的试纸条T线荧光强度最弱，而其他黄曲霉毒素B1类似物的试纸条T线荧光强度基本没有减弱。表明上述荧光试剂条能够特异性检测黄曲霉毒素B1，对其他几种黄曲霉毒素B1类似物没有交叉反应。所述的样品缓释液为含有2％(m/v)蔗糖、1％(m/v)吐温-20的0.01mol/L、pH值＝7.4磷酸缓冲液。

实施例3：黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂条在黄曲霉毒素B1定量检测中的应用：

选取经过高效液相色谱法(HPLC)检测为黄曲霉毒素B1阴性的花生、玉米样品进行实验，分别称取25g花生、玉米样品并磨碎，加入100mL、84％的乙腈水溶液，高速均质提取2min，提取液用PriboFast M266净化柱(青岛普瑞邦生物工程有限公司)过滤，滤液取20mL进行氮吹至近干，加入5mL、10％甲醇/缓释液复溶，通过0.22μm有机相滤膜过滤，滤液即为样品基质提取液。

用10％甲醇/缓释液复溶的花生、玉米基质提取液分别稀释黄曲霉毒素B1标准品成系列梯度，配得200ng/mL、160ng/mL、120ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6ng/mL、3ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.04ng/mL和0ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品溶液。取上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液50μL，分别加入到300μL样品反应瓶中，再分别加入50μL用缓释液1：150稀释的铕标记抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，插入荧光试纸条，37℃反应7min后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长365nm，测定波长615nm)得到各荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)及其比值(F_T/F_C)，所述的样品缓释液为含有2％(m/v)蔗糖、1％(m/v)吐温-20的0.01mol/L、pH值＝7.4磷酸缓冲液。

以各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液相应的检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)的比值(F_T/F_C)为纵坐标，黄曲霉毒素B1标准品浓度的对数值为横坐标，拟合得到花生、玉米基质的时间分辨荧光免疫层析试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(F_T/F_C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线。该方法在花生样品中的有效检测范围为1.0～50ng/mL，在玉米样品中的有效检测范围为0.2～40ng/mL。

取经过高效液相色谱法(HPLC)检测为黄曲霉毒素B1阴性的花生、玉米样品基质提取液，向其中分别准确添加2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL黄曲霉毒素B1标准品，混匀，得到花生、玉米待测样品检测液。每个浓度重复5次，重复3天。分别取上述待测花生、玉米样品检测液50μL加入到300μL样品反应瓶中，再分别加入50μL用缓释液1：150稀释的铕标记抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，插入荧光试纸条，37℃反应7min后，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长365nm，测定波长615nm)得到各荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度(F_T)与质控线时间分辨荧光强度(F_C)的比值(F_T/F_C)。然后将其代入上述得到的花生、玉米基质的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(F_T/F_C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，得到样品溶液中的黄曲霉毒素B1浓度，测得花生、玉米样品中黄曲霉毒素B1的加标回收率在78.1～102.6％之间，组内相对标准偏差为4.8～8.6％，组间相对标准偏差为5.2～10.6％。

将该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果进行比较，试验结果表明，该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果高度一致，符合率达95％。

序列表

<110> 武汉中科兴达技术有限公司

<120> 一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法和应用

<141> 2019-02-25

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 1

Gly Ala Thr Pro Ala Ser Ala Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 2

Ile Ala Thr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 3

Ala Ala Gly Val Thr Ala Ser Ser Gly Thr Ala Thr Pro Ala Thr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 4

ggacgcacct tcagaagtaa tgcc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 5

attaggtgga gtggtggtag caca 24

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 6

gcagcaggtg tttggagatc gtcgggttgg gataccccgg actac 45

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 7

Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ala Thr Pro Ala Ser Ala

20 25 30

Ala Met Gly Thr Pro Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gly Pro Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ala Thr Ser Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gly Met Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala Thr Ala Val Thr Leu Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Val Thr Ala Ser Ser Gly Thr Ala Thr Pro Ala Thr Thr

100 105 110

Gly Gly Gly Thr Gly Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 366

<212> DNA

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 8

caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggg ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgtag cctctggacg caccttcaga agtaatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attaggtgga gtggtggtag cacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctccaaatga acagcctgaa acccgaggac acggccgttt atttgtgtgc agcaggtgtt 300

tggagatcgt cgggttggga taccccggac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

Claims (10)

1.一种黄曲霉毒素B1纳米抗体的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条和样品反应瓶；所述荧光试纸条包括纸板、硝酸纤维素膜、样品垫、检测垫、吸水垫，所述样品垫、检测垫、吸水垫从左往右依次粘贴在所述纸板上且两两重叠，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述纸板和检测垫之间，其特征在于，

所述硝酸纤维素膜上从左往右设有检测线和质控线，所述检测线包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗驼多克隆抗体；

所述试剂盒还包括装在所述样品反应瓶中的铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1纳米抗体的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

与之对应地，三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ IDNO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求1或2所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的制备方法为：将抗黄曲霉毒素B1纳米抗体和活化后的铕标记试剂混合，震荡过夜，即得到目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体。

4.根据权利要求3所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的制备方法具体为：将铕标记试剂超声分散于硼酸缓冲液中，加入碳二亚胺溶液，室温震荡活化，离心，去除上清液；加入硼酸缓冲液复溶，超声分散，然后加入抗黄曲霉毒素B1纳米抗体，混匀，震荡过夜，离心去除上清液；然后加入牛血清白蛋白封闭铕标记试剂表面多余的结合位点，得到铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体。

5.根据权利要求4所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述样品稀释液为含有2％(m/v)蔗糖、1％(m/v)吐温-20的浓度为0.01mol/L且pH值为7.4的磷酸缓冲液；

所述荧光试纸条中的吸水垫长20～25mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长15～20mm，宽3～5mm，相邻各垫的重叠长度为1～3mm；所述质控线与硝酸纤维素膜右侧边相距5～10mm，所述检测线与质控线相距10～15mm；所述样品反应瓶为1～5mL的卡口瓶。

6.根据权利要求4所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，每厘米所述检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.2～0.5μg；每厘米所述质控线所需的兔抗驼多克隆抗体的包被量为0.1～0.4μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体的含量为18～50μg。

7.权利要求1、2、4、5或6所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将吸水纸剪裁成吸水垫；

S2、制备检测垫，将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、兔抗驼多克隆抗体分别配制成浓度为0.4～0.8mg/mL的包被液Ⅰ和0.2～0.5mg/mL的包被液Ⅱ，在硝酸纤维素膜上用线喷方式喷涂包被液Ⅰ，37℃下干燥1～2h，得检测线；然后在检测线右边喷涂包被液Ⅱ，37℃下干燥1～2h，得质控线；

S3、制备样品垫，将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿取出，37℃下干燥10～16h，得样品垫，置于干燥器中室温保存；

S4、组装荧光试纸条，在纸板上从左往右依次粘贴样品垫、检测垫、吸水垫且两两重叠，得荧光试纸条。

8.根据权利要求7所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述包被液Ⅰ的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

制备所述包被液Ⅱ所使用的包被缓冲液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

制备所述样品垫所使用的封闭液为：每100mL溶液中含有牛血清白蛋白0.5g，叠氮化钠0.02g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钠0.3g，吐温-20 1.0g，聚乙烯吡咯烷酮K-301.0g、EDTA 0.25g。

9.权利要求1、2、4、5或6所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

P1、将样品反应瓶中加入待测样品溶液，与铕标记的抗黄曲霉毒素B1纳米抗体混匀；

P2、将荧光试纸条插入样品反应瓶中，37℃反应7min，用时间分辨荧光测试仪检测，得到试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值；

P3、基于预先获得的试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值，与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量，换算后得待测样品中黄曲霉毒素B1含量。

10.权利要求9所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒的应用，其特征在于，步骤P3中，所述试纸条的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值，与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线采用以下方法得到：

P31、配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液；

P32、将适量上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入试纸条，37℃反应7min，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到若干个免疫层析时间试纸条上检测线和质控线的荧光强度，由此获得若干个免疫层析时间的检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值；

P33、拟合得到该比值与黄曲霉毒素B1的关系曲线。