CN103278631A - 黄曲霉毒素b1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物；所述抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株分泌产生。其可用于黄曲霉毒素B1含量的定量测定，操作简单、快速、准确度高。

Description

黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。 

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、AFG和M1（AFM1）等。在目前已经发现的真菌毒素中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，简称AFB1）的毒性最强，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首位。黄曲霉毒素对食品及饲料中可能产生污染的环节多，其广泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，AFB1污染食品及饲料后，会直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，其危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正比。为此世界各国都规定了黄曲霉毒素B1食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准，因此加强对食品及饲料中黄曲霉毒素B1的检测、特别是速测，以便及时了解和掌握食品及饲料的卫生安全信息，是增强食品安全性的一个重要环节。 

现有黄曲霉毒素B1的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是较早用于检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，该法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，这些方法灵敏度高，准确性好，但又有仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。近年来发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为： 

黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸 条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)；所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体；所述的杂交瘤细胞株AFB3G1已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201015。 

按上述方案，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5～2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经Sephadex G-50层析柱分离铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。 

按上述方案，所述荧光试纸条中的吸水垫长10～15mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。 

按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为60～120ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30～90ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1～0.3μg。 

按上述方案，所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30%的吐温-20水溶液。 

按上述方案，所述的荧光试纸条的制备方法如下： 

（1）将吸水纸剪裁得吸水垫； 

（2）检测垫的制备： 

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA配制成浓度为0.1～0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿10～15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA的包被量为60～120ng，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟； 

将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1～0.5mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30～90ng，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟； 

（3）样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥4～6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

(4)荧光试纸条的组装： 

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得荧光试纸条。 

按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g； 

配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g； 

所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。 

上述流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素B1含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线（T）时间分辨荧光强度与质控线(C)时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。 

按上述方案，所述的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线是采用以下方法得到的： 

（1）配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液； 

（2）将适量上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线（T）和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）； 

（3）经拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线。 

本发明的有益效果： 

本发明提供的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒可用于黄曲霉毒素B1含量的定量测定，且操作简单、快速、准确度高。 

附图说明

图1为本发明提供的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒中荧光试纸条的结构示意图。图中：1样品垫、2检测垫、3检测线、4质控线、5吸水垫。 

具体实施方式

实施例1抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的获得 

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体，具体制备方法： 

将杂交瘤细胞株AFB3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。 

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株AFB3G1分泌的单克隆抗体的亚型为IgG1。 

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得注射杂交瘤细胞AFB3G1株的BALB/c小鼠腹水抗体的效价可达8.4×10⁵，即小鼠腹水抗体稀释8.4×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。采用常规竞争ELISA方法鉴定抗体特性，结果表明，杂交瘤细胞株AFB3G1产生的单克隆抗体对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为86pg/mL，与供试的其他黄曲霉毒素及呕吐 毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素的交叉反应率均小于2.5%。 

其中：上述杂交瘤细胞株AFB3G1是根据以下方法筛选得到的： 

1.动物免疫 

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素B1完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的黄曲霉毒素B1完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠80μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。 

黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA购于Sigma-Aldrich公司。 

2.细胞融合 

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1%HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。 

所述的含1%HAT的细胞完全培养基含有20%（体积百分数）胎牛血清，75%（体积百分数）RPMI-1640基础培养液，1%（重量百分数）L-谷氨酰胺，1%（体积百分数）HEPES，1%（体积百分数）双抗（10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素），2%（重量百分数）生长因子（HFCS）和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体培养基为含1%（质量百分数）甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液、HEPES、双抗和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。 

3.细胞株的筛选及克隆 

待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株AFB3G1。 

4.杂交瘤细胞株AFB3G1的可变区序列测定 

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株AFB3G1的总RNA； 

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得； 

（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3'（22mer）和5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3'（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3'（24mer）和5'-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3'（24mer）。 

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长345bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由115个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长324bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由108个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。 

实施例4：黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用 

黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，其中：吸水垫长12mm，宽3mm；检测垫长25mm，宽3mm；样品垫长15mm，宽3mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为80ng/cm质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)，其包被量为40ng/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15mm，质控线和检测线的间距为5mm。 

所述荧光试纸条的获得： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁成长12mm，宽3mm的规格，即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA用包被缓冲液配制成浓度为0.1mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需AFB1-BSA的包被量为80ng，然后于37℃条件下干燥30分钟； 

所述的包被缓冲液为：0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.1mg/mL的包被液；于距检测线6mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为40ng，然后于37℃条件下干燥1小时； 

所述的包被缓冲液为：将1mg兔抗鼠多克隆抗体，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至10mL所得； 

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm。 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

(4)荧光试纸条的组装： 

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得荧光试纸条，见图1。 

所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的获得： 

取1mg上述抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，用100mmol/L pH9.3的碳酸盐缓冲液反复洗涤6次后，将其和0.5mg铕标记试剂充分混匀，于4℃过夜。然后将其加入到1.9cm×60cm的Sephadex G-50层析柱中，用含0.9%NaCl的50mmol/L Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光值(A280nm)，合并峰管，得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。 

所述含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干粉的样品反应瓶的获得： 

取上述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体0.1μg放于3mL卡口瓶中，采用常规冷冻真空干燥方法抽干后，既得铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干粉，4℃保存，备用。 

所述的样品稀释液为：体积分数为0.05%的吐温-20水溶液。 

上述流动滞后免疫时间分辨荧光检测试剂盒在花生样品黄曲霉毒素B1检测中的应用： 

Ⅰ荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线的建立： 

（1）对经高效液相色谱法（HPLC）检测为黄曲霉毒素B1阴性的花生样品检测液进行黄曲霉毒素B1加标，配得10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL和0ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品溶液； 

（2）取上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液各200μL，分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测（激发波长：365nm，测定波长：615nm）得到各荧光试纸条上检测线处（T）和质控线(C)处的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）； 

（3）以AFB1浓度为横坐标，各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液相应的检测线时间分 辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线。该方法的有效检测范围为0.05～2ng/mL。 

Ⅱ花生样品中黄曲霉毒素B1含量的检测： 

取20g花生样品6份，用研磨机研磨，磨碎后加入80mL70%（体积分数）的甲醇水，搅拌反应2分钟，制得样品混合液，并将该混合液手动摇晃3分钟，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入6mL样品稀释液稀释滤液，混匀，得到各待测花生样品检测液； 

分别取上述待测花生样品检测液200μL加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测（激发波长：365nm，测定波长：615nm），获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C），然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，得到样品溶液中的黄曲霉毒素B1浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中黄曲霉毒素B1含量，得这6个花生样品中的黄曲霉毒素B1含量依次为：1.5μg/kg、7.6μg/kg、2.7μg/kg、22.1μg/kg、11.3μg/kg。 

将该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果进行比较，得：该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果高度一致，符合率高达98.4%；另，该方法单个样品检测所需时间也仅约为高效液相色谱标准方法的十分之一，显著提高了检测速度。 

实施例5：黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用 

黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，其中：吸水垫长15mm，宽3mm；检测垫长28mm，宽3mm；样品垫长12mm，宽3mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为90ng/cm质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)，其包被量为120ng/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为20mm，质控线和检测线的间距为10mm。 

所述荧光试纸条的获得： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁成长15mm，宽3mm的规格，即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA用包被缓冲液配制成浓度为0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需AFB1-BSA的包被量为120ng，然后于40℃条件下干燥30分钟； 

所述的包被缓冲液为：0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.4mg/mL的包被液；于距检测线6mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为90ng，然后于40℃条件下干燥30min； 

所述的包被缓冲液为：将1mg兔抗鼠多克隆抗体，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至10mL所得； 

所述的硝酸纤维素膜长28mm，宽3mm。 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长12mm，宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于40℃条件下干燥4小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

(4)荧光试纸条的组装： 

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得。 

所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的获得： 

取1mg上述抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，用100mmol/L pH9.3的碳酸盐缓冲液反复洗涤6次后，将其和2mg铕标记试剂充分混匀，于4℃过夜。然后将其加入到1.9cm×60cm的Sephadex G-50层析柱中，用含0.9%NaCl的50mmol/L Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液 (1ml/管)，逐管测量吸光值(A280nm)，合并峰管，得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。 

所述含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干粉的样品反应瓶的获得： 

取上述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体0.3μg放于3mL卡口瓶中，采用常规冷冻真空干燥方法抽干后，既得铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干粉，4℃保存，备用。 

所述的样品稀释液为：体积分数为0.30%的吐温-20水溶液。 

上述流动滞后免疫时间分辨荧光检测试剂盒在花生样品黄曲霉毒素B1检测中的应用： 

取20g花生样品1份，用研磨机研磨，磨碎后加入80mL70%（体积分数）的甲醇水，搅拌反应2分钟，制得样品混合液，并将该混合液手动摇晃3分钟，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入6mL样品稀释液稀释滤液，混匀，得到各待测花生样品检测液； 

取上述待测花生样品检测液200μL加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测（激发波长：365nm，测定波长：615nm），获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C），然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，得该花生样品中的黄曲霉毒素B1含量为10μg/kg。 

Claims (9)

1.黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物；所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5～2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经Sephadex G-50层析柱分离铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。

3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中的吸水垫长10～15mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。

4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为60～120ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30～90ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1～0.3μg。

5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：它还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30%的吐温-20水溶液。

6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述的荧光试纸条的制备方法如下：

（1）将吸水纸剪裁得吸水垫；

（2）检测垫的制备：

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA配制成浓度为0.1～0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿10～15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA的包被量为60～120ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；

将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1～0.5mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为30～90ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；

（3）样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥4～6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得荧光试纸条。

7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

8.根据权利要求1所述的流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素B1含量检测中的应用：其特征在于，它是将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。

9.根据权利要求1所述的流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素B1含量检测中的应用，其特征在于：所述的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值（T/C）与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

（1）配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液；

（2）将适量上述各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线和质控线的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；

（3）经拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线。

Images