CN108508214A - 一种藻红蛋白荧光探针及其用于黄曲霉毒素b1快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种藻红蛋白荧光探针及其用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法。本发明首先将荧光藻红蛋白与黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行偶联制成荧光探针，并将其应用于试纸条快速检测中，基于竞争免疫层析法原理，建立一种黄曲霉毒素B1快速测定的方法。本发明的快速检测试纸条操作简单快捷，适用于现场大批量样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种藻红蛋白荧光探针及其用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法。
背景技术
藻红蛋白是一种存在于海藻中的天然色素蛋白，具有抗氧化、抗炎症、提高免疫力等生物活性，常作为天然色素添加剂应用于食品和化妆品中，作为生理活性物质应用于保健品、药品等。藻红蛋白具有良好的水溶性、物理学和光谱学性质，可长时间保存于液体中，且荧光特性等物理性质几乎不会改变。藻红蛋白中的发色团为开链四吡咯结构，命名为藻红素，包被在蛋白内部，与外界环境相隔绝。因此藻红蛋白的荧光性质不易受到影响，可用作荧光标记物。藻红蛋白交联物一般不会与细胞发生非特异性结合。而很多其他染料分子，常常会与细胞之间发生非特异性结合。因此藻胆蛋白常用于荧光剂。
免疫层析技术（immunochromatography）是近20世纪末发展起来的一种分析方法，具有特异性、操作简单、快速等优点，因而成为环境保护、食品安全快速检测分析研究的热点。
根据待检物质和抗体不同的结合模式，可将免疫层析技术分为直接法和竞争法。直接法用于检测多抗原位点的生物大分子，如人类、动物疫病的早期诊断、生化分析、抗体水平监测。竞争法用于抗原结合位点少或仅具有单个抗原结合位点的小分子化合物，多采用标记抗体模式。
竞争法的工作原理为：在毛细管作用力下，待检物质先与结合垫处的标记抗体进行识别而结合，形成抗原-标记抗体复合物继续向前层析，到达T线时，未结合的标记抗体继续与T线的偶联抗原结合形成偶联抗原-标记抗体复合物而显色，当待检样品中的抗原越多，结合的标记抗体越多，则T线上结合到的标记抗体就越少，显色越弱；反之，当待检样品中的抗原越少，结合的标记抗体越少，则T线上结合到的标记抗体就越多，显色越强；抗原-标记抗体复合物或未结合的标记抗体与C线上的二抗结合，C线显色。竞争法常用于检测农药残留、重金属离子、真菌毒素等。
目前，用于免疫层析技术的标记物主要为胶体金，其存在无法定量的缺点。因此，需要一种能够新的定量跟踪的标记物，同时，能保持快速测定、操作简便的优点。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术现状，提供一种藻红蛋白荧光探针及其用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法。本发明的检测方法操作简单快捷，适用于现场大批量样品的快速检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种藻红蛋白荧光探针的制备方法，按摩尔比为10~1:1往pH 为4.0~8.0、浓度为0.01~0.2 M磷酸盐缓冲液中加入藻红蛋白和黄曲霉毒素B1单克隆抗体，振荡混匀；然后加入体积分数为0.02%~0.6%的戊二醛，振荡混匀后，在避光、温度为5~50℃的条件下，匀速振荡反应2~20 h，得到藻红蛋白荧光探针。
一种如上所述的制备方法制得的藻红蛋白荧光探针中，含有1~10 μg/mL黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
一种将上述的藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，包括以下步骤：
1）取10~100 μL、0.1-30ng/mL的黄曲霉毒素B1待测样品，加入藻红蛋白荧光探针10~80μL，混匀，反应1~10 min；
2）将步骤1）的反应液滴加至检测卡孔中，层析时间为3~15 min，然后将检测卡放入荧光免疫层析快速检测设备中进行检测。
步骤2）所述的检测卡的制备方法为：用0.01 mol/L、pH=7.0 磷酸盐缓冲液分别稀释羊抗鼠二抗和牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原至0.1~10 mg/L、0.01~5 mg/L，然后将其均匀地画在NC膜上，分别为质控线（C线）和检测线（T线），在室温下干燥5~10 h；最后在塑料底板上依次组装NC膜、样品垫、吸水垫，装入检测卡，放入密封袋中于4℃下保存以备用。
步骤2）所述的荧光免疫层析快速检测设备参数如下：LED灯滤光片波长为400~800nm；相机滤光片的中心波长为400~800 nm。
步骤2）所述的荧光免疫层析快速检测设备的检测条件设定为：LED灯的电压和电流分别为0.1~9 V和0.1~100 mA；相机的曝光时间为0.1~9 s。
本发明的优点在于：
本发明应用了天然藻红蛋白作为标记物，克服了传统人工合成标记物价格昂贵的缺陷；合成时不产生有毒物质、不污染环境的优点，并融合了自身摩尔消光系数大、荧光量子产率高以及斯托克斯位移大的优点；该检测方法具有操作简单快捷，适用于现场大批量样品的快速检测。
附图说明
图1是免疫试纸条的检测原理图；
图2是荧光免疫层析快速检测设备；左为实物图，右为结构图；
图3是免疫试纸条检测AFB1的标准曲线。
具体实施方式
以下通过试验例来进一步阐述具体实施方式，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，具体步骤为：
1）快速检测卡的制备：取0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分别稀释牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原和羊抗鼠二抗至1 mg/L和3 mg/L，用划膜器具均匀地画在NC膜上，分别为检测线（牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原）（T线）和质控线（羊抗鼠二抗）（C线），于室温下干燥5 h；将NC膜、样品垫、吸水垫依次组装在塑料底板上，装入检测卡，并放入密封袋中于4℃下保存以备用；
2）藻红蛋白偶联黄曲霉毒素荧光探针的制备：按摩尔比为6:1往pH 为6.5、浓度为0.1M磷酸盐缓冲液中加入藻红蛋白和黄曲霉毒素B1单克隆抗体，振荡混匀；向反应体系中加入体积分数为0.5%的交联剂戊二醛，振荡混匀，于30℃摇床中匀速振荡，避光反应3 h，制得含4 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体的藻红蛋白荧光探针；
3）用移液枪吸取40 μL一定浓度的黄曲霉毒素B1待测样品，再加入40 μL步骤2）制备的含4 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体的藻红蛋白荧光探针，混匀，竞争反应11 min；将混合后待检样品滴加至检测卡孔中，层析时间为8 min，将检测卡放入荧光免疫层析快速检测设备中进行检测；检测时，荧光免疫层析快速检测设备设置的参数如下：LED灯滤光片波长为560 nm；相机滤光片的中心波长为580 nm；同时，设定检测条件如下：LED灯的电压和电流分别为3 V和15 mA；相机的曝光时间为1.5 s。
实施例2
一种藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，具体步骤为：
1）快速检测卡的制备：取0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分别稀释牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原和羊抗鼠二抗分别为5 mg/L和3 mg/L，用划膜器具均匀地画在NC膜上，分别为检测线（牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原）（T线）和质控线（羊抗鼠二抗）（C线），于室温下干燥9 h，将NC膜、样品垫、吸水垫依次组装在塑料底板上，装入检测卡，并放入密封袋中于4℃下保存以备用；
2）藻红蛋白偶联黄曲霉毒素荧光探针的制备：按摩尔比为10:1往pH 为7.0、浓度为0.1M磷酸盐缓冲液中加入藻红蛋白和黄曲霉毒素B1单克隆抗体，振荡混匀；向反应体系中加入体积分数为0.3%的交联剂戊二醛，振荡混匀，于25℃摇床中匀速振荡，避光反应5 h，制得含5 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体的藻红蛋白荧光探针；
3）用移液枪吸取30 μL一定浓度的黄曲霉毒素B1待测样品，再加入30 μL含5 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体的藻红蛋白荧光探针，混匀，竞争反应10 min；将混合后待检样品滴加至检测卡孔中，层析时间为10 min，将检测卡放入荧光免疫层析快速检测设备中进行检测；检测时，荧光免疫层析快速检测设备设置的参数如下：LED灯滤光片波长为550 nm；相机滤光片的中心波长为570 nm。同时，设定检测条件如下：LED灯的电压和电流分别为2 V和30 mA；相机的曝光时间为1 s。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种藻红蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于：按摩尔比为10~1:1往pH 为4.0~8.0、浓度为0.01~0.2 M磷酸盐缓冲液中加入藻红蛋白和黄曲霉毒素B1单克隆抗体，振荡混匀；然后加入体积分数为0.02%~0.6%的戊二醛，振荡混匀后，在避光、温度为5~50℃的条件下，匀速振荡反应 2~20 h，得到藻红蛋白荧光探针。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的藻红蛋白荧光探针，其特征在于：所述的藻红蛋白荧光探针含有1~10 μg/mL黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
3.一种将权利要求2所述的藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取10~100 μL、0.1-30ng/mL的黄曲霉毒素B1待测样品，加入藻红蛋白荧光探针10~80μL，混匀，反应1~10 min；
2）将步骤1）的反应液滴加至检测卡孔中，层析时间为3~15 min，然后将检测卡放入荧光免疫层析快速检测设备中进行检测。
4.根据权利要求3所述的藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，其特征在于：步骤2）所述的检测卡的制备方法为：用0.01 mol/L、pH=7.0 磷酸盐缓冲液分别稀释羊抗鼠二抗和牛血清蛋白偶联黄曲霉毒素B1抗原至0.1~10 mg/L、0.01~5 mg/L，然后将其均匀地画在NC膜上，分别为质控线和检测线，在室温下干燥5~10 h；最后在塑料底板上依次组装NC膜、样品垫、吸水垫，装入检测卡，放入密封袋中于4℃下保存以备用。
5.根据权利要求3所述的藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，其特征在于：步骤2）所述的荧光免疫层析快速检测设备参数如下：
LED灯滤光片波长为400~800 nm；相机滤光片的中心波长为400~800 nm。
6.根据权利要求3所述的藻红蛋白荧光探针用于黄曲霉毒素B1快速检测的方法，其特征在于：步骤2）所述的荧光免疫层析快速检测设备的检测条件设定为：LED灯的电压和电流分别为0.1~9 V和0.1~100 mA；相机的曝光时间为0.1~9 s。
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