CN101750482A

CN101750482A - 一种制备条斑紫菜r-藻红蛋白荧光探针的方法

Info

Publication number: CN101750482A
Application number: CN200810204718A
Authority: CN
Inventors: 何培民; 蔡春尔; 周铭; 汪卿; 柳俊秀; 李春霞
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2010-06-23

Abstract

一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，特征是该方法在温度为20℃条件下进行以下各步骤：先以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与R-藻红蛋白摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白；再以二硫苏糖醇与抗体摩尔比为500∶1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体；最后按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100μl的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，接着以Sephacryl S-300HR层析柱分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、pH7.0，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针。

Description

一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法

技术领域：

本发明涉及一种制备藻胆蛋白荧光探针的方法，特别是涉及一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法。

背景技术：

藻胆蛋白是很好的纯天然色素，有鲜艳的颜色，可用作食物色素、化妆品、添加剂等，同时，藻胆蛋白也是一种新型荧光物质，包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等，可以作为抗体荧光标记物质以替代合成荧光物质，它们作为生物体内的荧光示踪物质，正被广泛应用于临床诊断、免疫标记等领域。特别是R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。但由于荧光探针制备工艺难度较大，所用的藻红蛋白及单克隆抗体的纯度要求又较高，使目前国内科研和医疗单位使用的藻红蛋白荧光标记物完全依赖进口，成为限制其扩大应用的瓶颈。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，它不但能高效地制备R-藻红蛋白荧光探针，而且，工艺简单，成本低廉。

本发明的目的是这样实现的：本发明的一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法在温度为20℃条件下进行以下各步骤：

(1)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与R-藻红蛋白(R-PE)摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白(R-PE)的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白(R-PE)；

(2)以二硫苏糖醇(DTT)与抗体摩尔比为500∶1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体；

(3)按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100μl的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，接着以Sephacryl S-300HR层析柱分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、PH7.0，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针。

所述的摇床低速震荡为50转/分。

所述的N-乙基马来酰亚胺为用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为80mmol/L。

所述的Sephacryl S-300HR层析柱为￠16mmX1000mm的SephacrylS-300HR层析柱。

由于本发明以条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)为材料，通过R-藻红蛋白(R-PE)衍生化、抗体巯基化，交联产物分离纯化等方法制备条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针，因此，具有以下优点：

1、藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；

2、目前从条斑紫菜提取高纯度藻红蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高；

3、R-藻红蛋白(R-PE)检测效果好，R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。

附图说明：

图1是在明场下肝癌SMCC-7721细胞的形态。

图2是在绿色激发光下羊抗兔抗体检测SMCC-7721细胞(对照组)。

图3是在绿色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。

图4是在绿色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。

图5是在蓝色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。

图6是在蓝色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。

具体实施方式：

实施例1

本实施例中所用的材料为条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)和羊抗兔抗体，所述的条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)从上海安谱科学仪器有限公司购得，所述的羊抗兔抗体从武汉华美生物工程有限公司购得。

(1)、以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与R-藻红蛋白(R-PE)摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白(R-PE)的衍生化，在摇床以50转/分避光振荡2小时，再用Sephadex G-25脱盐柱去除未反应的3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，收集衍生化的R-藻红蛋白(R-PE)；

(2)、以二硫苏糖醇(DTT)与羊抗兔抗体摩尔比为500∶1进行羊抗兔抗体的巯基化，在20℃下，在摇床以50转/分振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱去除未反应的二硫苏糖醇(DTT)，收集巯基化的羊抗兔抗体；

(3)、按衍生前R-藻红蛋白(R-PE)与羊抗兔抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白(R-PE)与巯基化的羊抗兔抗体混合，在摇床以50转/分震荡，反应12小时，后加入100μl的用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解的浓度为80mmol/L的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，再以SephacrylS-300HR层析柱(￠16mm×1000mm)分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、PH7.0，收集分离的交联产物，即制得条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针。

上述各步骤在温度为20℃条件下进行。

实施例2

条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针在肝癌SMCC-7721细胞检测上的应用步骤如下：

1.取普通洁净盖玻片于70％乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干，用0.9％氯化纳溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入肝癌SMCC-7721细胞培养过夜。

2.吸尽六孔板内培养液，加入1ml固定液，4℃固定过夜。

3.去除固定液，用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，吸尽液体。

4.用封闭液封闭60分钟。

5.去除封闭液，加稀释的兔抗肌动蛋白多克隆抗体(1∶400)作用60分钟。

6.去除一抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。

7.去除洗涤液，加入1毫升R-藻红蛋白荧光探针作用60分钟。

8.回收荧光标记的二抗。用洗涤液洗涤盖玻片3-5次，每次3-5分钟。

9.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液。

10.在荧光显微镜下用绿光激发，观察并拍照。

同时以异双功能试剂衍生化但未与羊抗兔抗体交联的R-藻红蛋白衍生物(R-PE-PDP)及单独使用羊抗兔抗体作对照组。

结果：

图1是肝癌SMCC-7721细胞在明场情况下20倍的照片，细胞形态清楚可与其后的荧光激发图片做对比。

图2显示只与羊抗兔抗体结合的SMCC-7721细胞自身不具有荧光能用于荧光标记检测。

经兔抗肌动蛋白多克隆抗体处理的肝癌细胞能与R-藻红蛋白荧光探针发生特异性的结合，在绿色激发光下显示出红色的细胞形态(图3)，与对照组(图4)相比，其荧光强度大细胞形态清晰明显，说明未与抗体交联的衍生化R-PE大部分未与肝癌细胞上的第一抗体(兔抗肌动蛋白多克隆抗体)发生结合且其他非特异性吸附也较弱会被缓冲液洗出。而蓝色激发光下显示出橙色的细胞形态(图5)，与对照组(图6)相比，其荧光强度也明显较大，但整个细胞形态不如在绿色激发光下清晰。

藻胆蛋白荧光探针优点：

在免疫分析技术中以往常用的放射性同位素标记法因半衰期短、需防护、废物处理困难；酶联标记法因易失活，灵敏度低，假性反应不易控制等缺点，正在被荧光标记法所取代。而用于免疫荧光分析，藻胆蛋白荧光探针具有传统荧光染料无法比拟的优越性：

1)各种藻胆蛋白在可见光区有强烈的吸收，荧光强度比常用的荧光素强30倍。

2)所发荧光不为天然生物大分子及其它物质自发淬灭。

3)在含水环境中高度可溶，各种藻胆蛋白的等电点均位于pH4.7～5.3范围内，在生理pH值条件下，藻胆蛋白和细胞表面都带负电荷，其非特异性结合少。

4)藻胆蛋白的荧光激发和发射的斯托克位移较大(吸收光谱区宽，发射光谱区窄)，根据能量转移原理可使用特殊的技术构建两种藻胆蛋白的分子间交联体或藻胆蛋白与其它荧光染料的结合物，可使其斯托克位移更为扩大，发射的荧光更趋近于可见光谱的红端，减少和排除了样品本底荧光、拉曼散射、瑞利散射的干扰。有利于激发光的选择，较大程度地提高了荧光检测的灵敏度。

5)藻胆蛋白的吸光度和荧光量子产率很高，并且与环境的pH值无关，有利于提高灵敏度。在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰。

6)藻胆蛋白易用化学方法与其它分子结合而不影响其荧光性质，从而形成多种交联体可以用于可见光区的单一激发光激发，发射不同颜色的荧光。可利用作二色、三色等多色标记，分别标记不同的单抗，实现多组分同时测定。藻胆蛋白在pH4～11的范围内其吸收光谱和荧光光谱几乎不变，与单抗结合也不改变其吸收光谱和荧光光谱。

7)藻胆蛋白表面具有较多的活性基团如-SH基，-NH2基等，与抗体共价结合并不影响它的光谱学特性，同时又保持了抗体的免疫特征。

8)受激后荧光衰减较缓，是优良的荧光探针。液体或固体状态存在时都极为稳定，且长期保存而荧光几乎无衰减，这一性质这对于研制中的普及型藻脂蛋白荧光标记诊断试剂盒是极为有利的。检测结果的长期保存预示着有可能实现分散取样，集中检测，便于边远地区的使用。

Claims

1.一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于该方法在温度为20℃条件下进行以下各步骤：

(1)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与R-藻红蛋白摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白；

(2)以二硫苏糖醇与抗体摩尔比为500∶1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体；

(3)按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100μl的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，接着以Sephacryl S-300HR层析柱分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、PH7.0，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针。

2.一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于所述的摇床低速震荡为50转/分。

3.一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于所述的N-乙基马来酰亚胺为用无水二甲基亚砜溶解，浓度为80mmol/L。

4.一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于所述的Sephacryl S-300HR层析柱为￠16mmX1000mm的Sephacryl S-300HR层析柱。