CN111675764B - 一种藻红蛋白免疫荧光探针及其标记蛋白的方法 - Google Patents

一种藻红蛋白免疫荧光探针及其标记蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种藻红蛋白荧光标记蛋白的方法，该方法包括如下步骤：步骤一、对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理；步骤二、1)将目标蛋白巯基化；2)采用SMCC对步骤1)获得的藻红蛋白进行活化；3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的藻红蛋白交联；先对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理，在藻红蛋白上的游离巯基被封闭后，后续的胺‑巯基交联剂只能与被封闭处理藻红蛋白上的氨基反应，而不会与相应蛋白上的巯基反应，如此能够确保胺‑巯基交联剂的氨基全部用于偶联被巯基化的藻红蛋白或目标蛋白，获得的藻红蛋白免疫荧光探针在进行免疫检测时，也能获得较强阳性信号，大大提高信噪比。

Description

一种藻红蛋白免疫荧光探针及其标记蛋白的方法
技术领域
本发明属于PE标记法，具体涉及一种藻红蛋白免疫荧光探针及其制备方法。
背景技术
藻红蛋白(P-phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻胆蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的 30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。
将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性。比如：(1)在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；(2)吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；(3)具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；(4)水溶性极佳，易与其他分子交联结合，非特异性吸附少；(5)纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。
现有技术中常常采用PE标记法，将藻红蛋白与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、蛋白质和核酸等生物大分子的分析；还可以用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。
传统的PE标记法(如AnaTagTMR-PE Labeling Kit)的实施步骤大致是：(1)将目标蛋白巯基化；(2)采用SMCC对PE进行活化；(3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的PE交联。
现有技术中还有一种实施步骤(参见文献：赵亚杰，闭兰，孙可芳，端义坤，詹骞，金玉玲，吕兰君，张爱华.荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体.微生物学免疫学进展[J].2006，34(2)：32-34.)为：(1)采用SPDP和SMCC分别活化PE和目标蛋白； (2)将经SPDP活化后的PE巯基化；(3)将巯基化的PE与经SMCC活化的目标蛋白交联。
上述PE标记法的不足之处在于：由于目标蛋白和藻红蛋白上既携带游离氨基，又携带游离巯基，当采用SMCC等胺-巯基交联剂进行活化时，胺-巯基交联剂不仅会与氨基结合，也会与巯基结合，这就导致当被胺-巯基交联剂活化的蛋白与巯基化藻红蛋白交联时，被胺- 巯基交联剂活化的蛋白上那些已与巯基结合的交联剂难以与巯基化藻红蛋白再发生交联，导致目标蛋白上结合的藻红蛋白少、标记效果差，获得的免疫荧光探针产生的阳性信号弱、背景信号强，检测时信噪比低。
发明内容
第一方面，本发明提供一种藻红蛋白荧光标记蛋白的方法，该方法包括如下步骤：步骤一、对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理；步骤二、1)将目标蛋白巯基化；2)采用SMCC对步骤1)获得的藻红蛋白进行活化；3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的藻红蛋白交联。
本发明提供的实施方式在采用常规的方法步骤将藻红蛋白标记、交联到目标蛋白上前，先对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理，在藻红蛋白上的游离巯基被封闭后，后续的胺-巯基交联剂只能与被封闭处理藻红蛋白上的氨基反应，而不会与相应蛋白上的巯基反应，如此能够确保胺-巯基交联剂的氨基全部用于偶联被巯基化的藻红蛋白或目标蛋白，从而有效提高藻红蛋白与目标蛋白的交联效率，提高藻红蛋白对目标蛋白的标记效率，而获得的藻红蛋白免疫荧光探针在进行免疫检测时，也能获得较强阳性信号，大大提高信噪比。
在一些实施方式中，所述步骤一中，采用NEM或ASE对对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理。
在一些实施方式中，该方法包括如下步骤：所述步骤一的具体实现方式为：将PE悬浊液预处理获得PE溶液，然后将NEM加入到PE溶液，低温避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基。
在一些实施方式中，PE悬浊液预处理通过以下预处理步骤获得：步骤i：将试剂管中PE 悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀；步骤ii：取出PE沉淀悬浊液放置于离心管内，离心，并用移液枪完全吸走上清液；步骤iii：取出PBS(含有EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的PE沉淀，离心，吸取PE上清溶液；步骤iv：选择超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入PBS(含有M EDTA)缓冲液混匀，5离心并除去滤出液，再加入PBS (含有EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作多次；步骤v：收集脱盐后PE溶液定容，得到 PE溶液。
在一些实施方式中，所述步骤一的具体实验过程为：
步骤i：取NEM加入预处理的PE溶液，混匀；步骤ii：4℃过夜避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基；步骤iii：将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入PBS(含有EDTA)缓冲液离心并除去滤液，再加入PBS(含有EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作多次；步骤iv：收集脱盐后高浓度PE封闭溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为得PE封闭溶液。
在一些具体实施例中，该方法具体包括如下步骤：
一、PE悬浊液预处理：
1、将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀；
2、取出100ul约0.5mg的PE沉淀悬浊液放置于1.5mL离心管内，5min、12000g离心，并用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀；若悬浊液浓度约为20mg/mL，则取出 25ul即可；
3、取出100ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的 PE沉淀，然后5min、12000g离心，吸取PE上清溶液；
4、选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入400ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，5min、12000g离心并除去滤出液，再加入500ul PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作3次；
5、收集脱盐后PE溶液定容到50ul，得到10mg/mL PE溶液；
二、NEM封闭PE
1、取5μLNEM(50mM)加入50μL预处理的PE溶液，混匀；
2、4℃过夜避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基(SH)；
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次；
4、收集脱盐后高浓度PE封闭溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为50uL(10mg/mL)，得PE封闭溶液；
三、PE-NEM与SMCC交联反应：
1、将SMCC从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水；
2、称取适量SMCC溶解于适量DMSO内，配置成10mg/mL母液(母液5uL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃；
3、向每40ul(10mg/mL)PE-NEM溶液中加入4uL 10mg/mL SMCC溶液(VPE-NEM： VSMCC＝1：10)，25℃以上室温反应1.5h，使SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合；
4、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使抗体中未反应SMCC残余量至少为抗体总量的10-3倍以上，尽可能较多稀释；
5、收集脱盐后高浓度交联抗体蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为40uL(5mg/mL)；
四、单抗(McAb)巯基化反应：
1、称取适量DTT，溶解于适量去离子水中配置成1M母液(母液5uL/管分装保存于 -20℃)；该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃；
2、向每50ul McAb中加入5uL 1M的DTT溶液(V(McAb)：V(DTT)＝10：1)，25℃以上室温避光反应1.5h；
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次；
4、收集脱盐后高浓度交联PE溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将PE蛋白溶液体积定容为40uL，获得McAb-SH中间体；
五、PE与抗体交联反应：
将步骤二与步骤三得到的交联蛋白溶液按照摩尔比n(McAb-SH)：n(PE-SMCC)＝1：5比例混合均匀，25℃以上室温避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积的1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应；反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.25mMEDTA)溶液，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4摄氏度长期保存。
所述的藻红蛋白的游离巯基作封闭处理后获得。
在一些实施方式中，采用NEM对对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理。
第三方面，本发明提供将上述探针应用到蛋白标记；具体地，所述的蛋白包括但不限于抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白；本发明提供的藻红蛋白免疫荧光探针在进行免疫检测时，阳性信号强、信噪比高。
一种藻红蛋白免疫荧光探针制备方法，包括将藻红蛋白标记到目标蛋白上的步骤；在所述的将藻红蛋白标记到目标蛋白上的步骤前，所述的藻红蛋白免疫荧光探针制备方法还包括对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理的步骤。
本发明通过先封闭藻红蛋白上的游离巯基再采用胺-巯基交联剂进行活化，如此胺-巯基交联剂只能与藻红蛋白上的氨基反应，胺-巯基交联剂上的马来酰亚胺全部未参与反应；则当将活化藻红蛋白与巯基化目标蛋白交联时，活化藻红蛋白上胺-巯基交联剂的马来酰亚胺全部用于与巯基化目标蛋白上的巯基反应，如此目标蛋白上能够结合更多的藻红蛋白，藻红蛋白标记效率更高，而获得的藻红蛋白免疫荧光探针在进行免疫检测时，也能获得更强的阳性信号，进一步提高信噪比。
附图说明
图1为CD4-PE[GK1.5]NEM封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测散点图；
图2为CD4-PE[GK1.5]NEM封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测柱形图；
图3为CD4-PE[GK1.5]未封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测散点图；
图4为CD4-PE[GK1.5]未封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测柱形图；
图5为IgD-PE[11-26C]NEM封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测散点图；
图6为IgD-PE[11-26C]NEM封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测柱形图；
图7为IgD-PE[11-26C]未封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测散点图；
图8为IgD-PE[11-26C]未封闭与CD3-ifluor488共染小鼠脾细胞的流式检测柱形图。
图9与图10为实施例与对比例的技术路线图。
具体实施方式
本发明述及的“PE”是指藻红蛋白()R-Phycoerythrin,R-PE，
本发明述及的“SMCC”是指4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl 4-(maleimidome.)cyclo-hexanecarboxylate)；
本发明述及的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，)；
本发明述及的McAb是指单克隆抗体(monoclonal antibody)；
本发明述及的Cys是指半胱氨酸(Cysteine)；
本发明述及的DTT是指二硫苏糖醇；
本发明述及的NEM是指N-乙基马来酰亚胺。
实施例藻红蛋白荧光标记单克隆抗体的方法
详细步骤：
一、PE悬浊液预处理：
1、将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀。
2、取出100ul约0.5mg(悬浊液浓度约为5mg/mL)的PE沉淀悬浊液放置于1.5mL离心管内，5min、12000g离心，并用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀。(若悬浊液浓度约为20mg/mL，则取出25ul即可)
3、取出100ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的 PE沉淀，然后5min、12000g离心，吸取PE上清溶液。
4、选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入400ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，5min、12000g离心并除去滤出液，再加入500ul PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作3次。
5、收集脱盐后PE溶液定容到50ul，得到10mg/mL PE溶液。
二、NEM封闭PE
1、取5μLNEM(50mM)加入50μL预处理的PE溶液，混匀。
2、4℃过夜避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基(SH)。
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
4、收集脱盐后高浓度PE封闭溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为50uL(10mg/mL)，得PE封闭溶液。
三、PE-NEM与SMCC交联反应：
1、将SMCC从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
2、称取适量SMCC溶解于适量DMSO内，配置成10mg/mL母液(母液5uL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
3、向每40uL(10mg/mL)PE-NEM溶液中加入4uL 10mg/mL SMCC溶液(VPE-NEM： VSMCC＝1：10)，25℃以上室温反应1.5h，使SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合。
4、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使抗体中未反应SMCC残余量至少为抗体总量的10-3倍以上，尽可能较多稀释。
5、收集脱盐后高浓度交联抗体蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为40uL(5mg/mL)。
四、单抗(McAb)巯基化反应：
1、称取适量DTT，溶解于适量去离子水中配置成1M母液(母液5uL/管分装保存于 -20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
2、向每50ul McAb中加入5uL1M的DTT溶液(V(McAb)：V(DTT)＝10：1)，25℃以上室温避光反应1.5h。
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
4、收集脱盐后高浓度交联PE溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将PE蛋白溶液体积定容为40uL，获得McAb-SH中间体。
五、PE与抗体交联反应：
将步骤二与步骤三得到的交联蛋白溶液按照摩尔比n(McAb-SH)：n(PE-SMCC)＝1：5比例混合均匀，25℃以上室温避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积的1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.25mMEDTA)溶液，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4摄氏度长期保存。
对比例PE标记单克隆抗体标准操作流程(PE未做封闭处理)
详细步骤：
一、PE悬浊液预处理：
1、将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀。
2、取出100ul约0.5mg(悬浊液浓度约为5mg/mL)的PE沉淀悬浊液放置于1.5mL离心管内，5min、12000g离心，并用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀。(若悬浊液浓度约为20mg/mL，则取出25ul即可)
3、取出100ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的 PE沉淀，然后5min、12000g离心，吸取PE上清溶液。
4、选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入400ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，5min、12000g离心并除去滤出液，再加入500ul PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作3次。
5、收集脱盐后PE溶液定容到50ul，得到10mg/mL PE溶液。
二、PE-NEM与SMCC交联反应：
1、将SMCC从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
2、称取适量SMCC溶解于适量DMSO内，配置成10mg/mL母液(母液5uL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
3、向每40ul(10mg/mL)PE溶液中加入4uL 10mg/mL SMCC溶液(VPE：VSMCC＝1：10)，25℃以上室温反应1.5h，使SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合。
4、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使抗体中未反应SMCC残余量至少为抗体总量的10-3倍以上，尽可能较多稀释。
5、收集脱盐后高浓度交联抗体蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为40uL(5mg/mL)。
三、单抗(McAb)巯基化反应：
1、称取适量DTT，溶解于适量去离子水中配置成1M母液(母液5uL/管分装保存于 -20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
2、向每50ul McAb中加入5uL1M的DTT溶液(V(McAb)：V(DTT)＝10：1)，25℃以上室温避光反应1.5h。
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500ul PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
4、收集脱盐后高浓度交联PE溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将PE蛋白溶液体积定容为40uL，获得McAb-SH中间体。
四、PE与抗体交联反应：
将步骤二与步骤三得到的交联蛋白溶液按照摩尔比n(McAb-SH)：n(PE-SMCC)＝1：5比例混合均匀，25℃以上室温避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积的1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.25mMEDTA)溶液，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4摄氏度长期保存。
试验例 抗体阳性的荧光信号测试
试验方法：
向1.5mLEP管内加入100μL(1*106/mL)淋巴结或脾脏研磨过滤液，3500rpm离心2min，去掉上清液，加入50μL抗体稀释液，室温状态下孵育15min，加入900μLFACS buffer充分吹打混匀，3500rpm离心2min，去掉上清。加入1mLFACSbuffer充分吹打混匀，3500rpm离心2min，去掉上清。加入500μLbuffer充分吹打混匀，使细胞重悬，将细胞重悬液转移至流式管内。流式细胞仪上机操作。
试验结果如图1～8，将图1～8的试验数据进行汇总，如表1所示：
表1实施例和对比例实验数据
信号值 实施例 对比例
CD4阳性值 26814 20687
CD4阴性值 447 935
CD4信噪比 59.99 22.13
IgD阳性值 14629 8055
IgD阴性值 110 103
IgD信噪比 132.99 78.20
从附图以及表1中可以直接获知，CD4-PE实施例和对比例结果表明NEM封闭能有效提高CD4阳性细胞信号值，降低阴性细胞信号值，进而显著提高信噪比；IgD-PE实施例和对比例结果表明NEM封闭能够显著提高IgD阳性细胞信号值，阴性细胞信号值无显著变化，信噪比有明显提高。综上所述，本专利采用的NEM封闭PE并标记单克隆抗体的方法能够显著提高PE标记抗体的信噪比，具有明显优势。

Claims (6)

1.一种藻红蛋白荧光标记蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一、对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理；
步骤二、1）将目标蛋白巯基化；2）采用SMCC对步骤1）获得的藻红蛋白进行活化；3）将巯基化后的目标蛋白与活化后的藻红蛋白交联。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，采用NEM或ASE对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：所述步骤一的具体实现方式为：将PE悬浊液预处理获得PE溶液，然后将NEM加入到PE溶液，低温避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PE悬浊液预处理通过以下预处理步骤获得：
步骤i：将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀；
步骤ii：取出PE沉淀悬浊液放置于离心管内， 离心，并用移液枪完全吸走上清液；
步骤iii：取出含有EDTA 的PBS缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的PE沉淀，离心，吸取PE上清溶液；
步骤iv：选择超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入含有EDTA PBS缓冲液混匀，离心并除去滤出液，再加入含有EDTA 的PBS缓冲液混匀离心，重复此操作多次；
步骤v：收集脱盐后PE溶液定容，得到PE溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤一的具体实验过程为：
步骤i：取NEM加入预处理的PE溶液，混匀；步骤ii：4℃过夜避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基；步骤iii：将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入含有EDTA 的PBS缓冲液离心并除去滤液，再加入含有EDTA 的PBS缓冲液混匀离心，重复此操作多次；步骤iv：收集脱盐后高浓度PE封闭溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为得PE封闭溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
一、PE悬浊液预处理：
1、将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀；
2、取出100ul约0.5mg的PE沉淀悬浊液放置于1.5 mL离心管内，5 min、12000g 离心，并用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀；若悬浊液浓度约为20mg/mL，则取出25ul即可；
3、取出100ul含有0.25mM EDTA PBS缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的PE沉淀，然后5 min、12000g离心，吸取PE上清溶液；
4、选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，在加入400ul含有0.25mM EDTA的PBS缓冲液混匀，5 min、12000 g离心并除去滤出液，再加入500ul含有0.25mM EDTA 的PBS缓冲液混匀离心，重复此操作3次；
5、收集脱盐后PE溶液定容到50ul，得到10mg/mL PE溶液；
二、NEM封闭PE
1、取5μL 50mM NEM 加入50μL预处理的PE溶液，混匀；
2、4℃过夜避光反应，使NEM分子与PE分子结合，封闭PE分子的巯基；
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul含有0.25mM EDTA的 PBS缓冲液5 min、12000 g离心并除去滤液，再加入500ul含有0.25mM EDTA的 PBS缓冲液混匀离心，重复此操作5次；
4、收集脱盐后高浓度PE封闭溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为50 uL，得10mg/mLPE封闭溶液；
三、PE-NEM与SMCC交联反应：
1、将SMCC从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水；
2、称取适量SMCC溶解于适量DMSO内，配置成10mg/mL母液；母液5 uL/管分装保存于-20℃，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃；
3、向每40ul10mg/mL、PE-NEM溶液中加入4 uL 10mg/mL SMCC溶液，VPE-NEM：VSMCC=1：10，25℃以上室温反应1.5 h，使SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合；
4、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul含有0.25mM EDTA的 PBS缓冲液5 min、12000 g离心并除去滤液，再加入500ul 含有0.25mM EDTA的 PBS缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使抗体中未反应SMCC残余量至少为抗体总量的10-3倍以上，尽可能较多稀释；
5、收集脱盐后高浓度交联抗体蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将抗体溶液体积定容为40 uL5mg/mL；
四、单抗巯基化反应：
1、称取适量DTT，溶解于适量去离子水中配置成1M母液，母液5 uL/管分装保存于-20℃；该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃；
2、向每50ul McAb中加入5 uL 1M的DTT溶液，V(McAb)：V(DTT)=10：1，25℃以上室温避光反应1.5 h；
3、将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500ul含有0.25mM EDTA 的PBS缓冲液5 min、12000 g离心并除去滤液，再加入500ul含有0.25mM EDTA 的PBS缓冲液混匀离心，重复此操作5次；
4、收集脱盐后高浓度交联PE溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将PE蛋白溶液体积定容为40 uL，获得McAb-SH中间体；
五、PE与抗体交联反应：
将步骤二与步骤三得到的交联蛋白溶液按照摩尔比nMcAb-SH：nPE-SMCC=1：5比例混合均匀，25℃以上室温避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积的 1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应；反应完成后向反应体系内加入适量含有0.25mM EDTA 的PBS溶液，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4摄氏度长期保存。
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Denomination of invention: A phycoerythrin immunofluorescence probe and its labeling protein method

Granted publication date: 20230908

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Pledgor: Zhejiang Zhengxi Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980010535

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